牛黃清感膠囊對甲型H3N2流感病毒抑制與預(yù)防作用實驗探究

1、牛黃清感膠囊對甲型h3n2流感病毒抑制與預(yù)防作用實驗探究摘要目的檢測牛黃清感膠囊對甲型 a/brisban/10/2008 (h3n2)流感病毒抑制和預(yù)防的作用， 為抗病毒藥物的篩選、研發(fā)提供實驗依據(jù)。方法在mdck 細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用病毒細(xì)胞形態(tài)變化cpe法、mtt染色法， 檢測不同濃度的牛黃清感膠囊對甲型a/brisban/10/2008 (h3n2)流感病毒的抑制和預(yù)防作用。實驗分1次用藥組和 3次用藥組，計算藥物半數(shù)有效濃度ic50,最小有效濃度mic 及治療指數(shù)ti。結(jié)果體外抑制甲型h3n2流感病毒實驗中， “牛黃清感膠囊”單次用藥組ti為27,三次用藥組為ti為 43o體外預(yù)防甲型h

2、3n2流感病毒實驗中，''牛黃清感膠囊” 單次用藥組ti為21.3,三次用藥組為ti為27。結(jié)論體 外抑制甲型a/brisban/10/2008 (h3n2)流感病毒的藥效實 驗結(jié)果顯示“牛黃清感膠囊”具有抑制和預(yù)防甲型流感病 毒的作用。關(guān)鍵詞牛黃清感膠囊；甲型h3n2流感病毒；實驗研 究中圖分類號r285. 5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼a 文章編號 2095-0616 (2013) 16-27-04甲流病毒是a型流感病毒，防治措施主要針對傳播途徑 采取物理、行為預(yù)防及發(fā)病后對癥治療1。目前，抗病毒 西藥的種類較多，但對甲流病毒尚缺乏特效藥物，在我國中 醫(yī)藥已被納入甲流的防治體系。該研究主要

3、是檢測牛黃清感 膠囊對甲型h3n2流感病毒的預(yù)防作用。1實驗材料1. 1藥物1. 1. 1驗證藥物 牛黃清感膠囊：國藥準(zhǔn)字z20026054, 每粒含0. 3g生藥，批號090962,生產(chǎn)日期：2009年12月2 日，由黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司提供。1. 1.2陽性藥物對照利巴韋林注射液（病毒p坐），0. lg/ 支，蘇衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1988）第347003號：批號000223,蘇州 第六制藥廠生產(chǎn)。1. 1. 3細(xì)胞狗腎傳代細(xì)胞（mdck-p13）,由全國流感中 心提供。1. 1.4 病毒 甲型 a/brisban/10/2008（h3n2）流感病毒， 批號：09712,由全國流感中心提供。

4、1. 1.5實驗室及其他實驗材料生物安全三級實驗室 bsl-3：編號：cnas/bla/t003,由中國疾病預(yù)防控制中心病 毒病預(yù)防控制所提供。其他實驗材料還有來源華美公司的四 甲基喙哇藍(lán)（mtt）、d-mem培養(yǎng)基（高糖含-谷氨酰胺，進(jìn)口 gibc0）、胎牛血清（進(jìn)口 gibco）、牛血清白蛋白組分（進(jìn)口 gibc0）、青酶素、鏈酶素、hepes緩沖液（進(jìn)口 gibc0）、tpck 胰酶（牛胰腺來源viii型，進(jìn)口 gibco）、hank, s溶液、二 甲基亞楓（進(jìn)口 gibco）、倒置可視顯微鏡（olympus）. 一次 性實驗耗材及試劑等（進(jìn)口 gibco公司）；3m公司的個人防 護裝備

5、；本室的c02培養(yǎng)箱nuair usautoflowo2實驗方法2. 1牛黃清感膠囊對甲型a/brisban/10/2008 （h3n2） 流感病毒抑制作用2. 1. 1病毒cpe法2. 1. 1. 1細(xì)胞培養(yǎng)mdck細(xì)胞以40萬/ml的濃度接種96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為l-谷氨酸完全型d-mem、10%的進(jìn)口特 級胎牛血清。37°c 5% c02孵箱培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期最旺 盛75%90%成片細(xì)胞，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，采用hank s溶液 洗細(xì)胞2次。2. 1. 1.2 病毒吸附 將 100tcid50 甲型 a/brisban/10/2008 （h3n2 ）流感病毒（采用病毒生長液（d

6、-mem培養(yǎng)基中含牛血清白蛋白組分12. 5ml.青酶素 100u/ml.鏈酶素 100ug/ml, hepes 12.5ml, tpck-胰酶 0. 5ml）稀釋后，接種經(jīng)處理的mdck細(xì)胞96孔培養(yǎng)板，每 孔100 11l,同時設(shè)病毒對照（100tcid50病毒液）。361、 5% c02孵箱中吸附2h,棄掉病毒稀釋液，采用hank' s溶 液洗2次。2. 1. 1.3藥物稀釋牛黃清感膠囊，選用對細(xì)胞的最大 無毒濃度（tdo） 2倍稀釋8個濃度即750-5. 9卩g/mlo同 時設(shè)利巴韋林注射液陽性藥物對照，選用對細(xì)胞的最大無毒 濃度（td0） 2倍稀釋9個濃度，即1000-3.

7、9n g/ml,每濃 度接種感染細(xì)胞3孔，每孔100 ul。實驗分1次用藥組（不 同濃度的藥液作用被病毒感染的mdck細(xì)胞1次），3次用藥 組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的mdck細(xì)胞，每24小 時棄掉舊藥液，換同濃度的藥液，連續(xù)3次）。361、5%c02 孵箱培養(yǎng)，每24小時在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)cpe變 化，以25%以下細(xì)胞形態(tài)cpe變化為“ + ” , 26%50%細(xì)胞形 態(tài)cpe變化為“+”，51%75%細(xì)胞形態(tài)cpe變化為“+” , 76%100%細(xì)胞形態(tài)cpe變化為“+” ,至病毒 對照出現(xiàn)“卄卄”時結(jié)束實驗，用reed-muench法，計算藥 物半數(shù)有效濃度（ic50）和最

8、小有效濃度（mic）及治療指 數(shù)（ti）判斷藥效。實驗重復(fù)3次。2. 1.2病毒mtt染色法觀察細(xì)胞病變cpe結(jié)果后，加入mtt 5mg/ml,每孔10 u l, 置37°c培養(yǎng)4h,然后加入100 u l dms0有機溶劑,室溫20min, 充分溶解細(xì)胞（過程中稍加震蕩）。然后，采用酶標(biāo)儀波長 570nm測定，記錄0d值，計算藥物半數(shù)有效濃度ic50和最 小有效濃度mic及治療指數(shù)ti,判斷藥效。實驗重復(fù)3次。2.2牛黃清感膠囊對甲型a/brisban/10/2008 （h3n2）流感病毒的預(yù)防作用2. 2. 1病毒cpe法2. 2. 1. 1細(xì)胞培養(yǎng)按2. 1. 1. 1的方法。

9、2. 2. 1.2藥物作用細(xì)胞 牛黃清感膠囊，選用對細(xì)胞的 最大無毒濃度（td0）2倍稀釋8個濃度，即7505.9ug/ml, 同時設(shè)利巴韋林注射液陽性藥物對照，2倍稀釋9個濃度 10003. 9ug/ml,每濃度接種感染細(xì)胞3孔,每孔100 ul。 實驗分1次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的mdck 細(xì)胞1次），3次用藥組（不同濃度的藥液作用被病毒感染的 mdck細(xì)胞，每24小時棄掉舊藥液，換同濃度的藥液，連續(xù) 3次）。2.2. 1.3病毒攻擊將100tcid50甲型a/brisban/10/2008 （ h3n2 ）流感病毒（采用病毒生長液 （d-mem培養(yǎng)基中含牛血清白蛋白組分12

10、5ml、青酶素 100u/ml.鏈酶素 looug/ml, hepes 12.5ml, tpck-胰酶 0. 5ml）稀釋后，接種經(jīng)藥物作用的mdck細(xì)胞96孔培養(yǎng)板, 每孔100 11l,同時設(shè)病毒對照（100tcid50病毒液），設(shè)正 常細(xì)胞對照。36°c. 5% c02孵箱中吸附2h,棄掉病毒稀釋 液，采用hank" s溶液洗2次。2.2. 1.4細(xì)胞培養(yǎng)及觀察 每孔加入100 ul病毒生長 液，36°c. 5% c02孵箱培養(yǎng)，每24小時在倒置顯微鏡下觀 察細(xì)胞形態(tài)cpe變化，按2. 1. 1.3的指標(biāo)判斷藥效。實驗重 復(fù)3次。2. 2.2病毒mtt染色法

11、按2. 1.2的方法。3實驗結(jié)果在mdck細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用病毒細(xì)胞形態(tài)變化cpe法、 mtt染色法，檢測不同濃度的牛黃清感膠囊對甲型 a/brisban/10/2008 (h3n2)流感病毒的預(yù)防作用。實驗分1 次用藥組和3次用藥組，用probit回歸法計算計算藥物的 半數(shù)有效濃度ic50,最小有效濃度mic及治療指數(shù)ti。3次 實驗結(jié)果見表2。4討論流行性感冒一直是世界高發(fā)的傳染病之一，每年全球約 有6億人患流感，占總?cè)丝诘?0%。我國是世界上公認(rèn)的流 感多發(fā)地甚至是發(fā)源地，其機制尚不清楚。其中曾經(jīng)引起世 界性大流行的a (h3n2)亞型流感病毒自1968年以來一直在 人群中存在2。流感病毒

12、的抗原變異與流感的發(fā)生和流行 密切相關(guān)，流感病毒正是通過不斷改變其抗原性來逃避宿主 特異性免疫的識別和清除，從而不斷引起流行3-4。國內(nèi)外有關(guān)抗病毒中藥的研究日益增多，從中篩選其有 效成分已成為當(dāng)前抗病毒新藥研發(fā)的一個熱點5。牛黃是 一種常用的名貴中藥，味苦、甘，性涼。歸心、肝經(jīng)。具有 清心解毒、涼肝息風(fēng)、豁痰開竅等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)方法研 究結(jié)果顯示，生物牛黃中間體在雞胚成纖維細(xì)胞上使新城疫 系疫苗毒的tcid50升高1個滴度6。金銀花具有清熱解毒, 涼散風(fēng)熱之功效，有研究7發(fā)現(xiàn)金銀花具有明顯的抗病毒 作用，其有效活性成分為綠原酸類化合物，金銀花的抗病毒 作用多是由其有效活性成分直接作用于病毒

13、，對dna和 rna病毒均有一定的抑制作用。金銀花提取物20g/kg和 40g/kg劑量組可明顯延長甲型流感病毒感染小鼠的存活天 數(shù)，顯著降低甲型流感病毒感染小鼠死亡數(shù)，對甲型流感病 毒（a/pr/8/34）感染小鼠具有明顯的保護作用，同時可明 顯降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)值，具有減輕甲型流 感病毒小鼠肺部病變的作用8。黃苓始載于神農(nóng)本草經(jīng), 為唇形科植物黃苓的干燥根，有清熱燥濕、瀉火解毒之效。 黃苓具有多種藥理作用，除抗氧化、清除自由基、抗炎、抗 腫瘤作用外，對多種病毒，如乙肝病毒、hiv等均具有抑制 作用9。目前研究認(rèn)為，黃苓的有效成分是黃酮類化合物, 研究表明黃苓昔對流感病毒所致的

14、細(xì)胞病變作用有明顯的 抑制作用，可較強地抑制小鼠感染流感病毒及明顯阻礙流感 病毒對小鼠的致死活性，對流感病毒的唾液酸酶有特異的抑 制活性，并抑制流感病毒的膜融合及脫殼10 o連翹對多種病毒具有抑制作用，連翹抗病毒有效部位（lc-4）在體外對 呼吸道合胞病毒（rsv）有明顯的預(yù)防作用及治療作用11。牛黃清感膠囊是由牛黃、金銀花、黃苓、連翹等組成的復(fù)方制劑12,我們對甲型h3n2流感病毒的實驗結(jié)果表明 牛黃清感膠囊具有體外抑制和預(yù)防高致病甲型h3n2流感病 毒的作用，同濃度的稀釋藥液連續(xù)3次作用正常的mdck細(xì) 胞和被病毒感染的細(xì)胞，能夠有效的抑制和預(yù)防高致病甲型 h1n1流感病毒的繁殖。參考文獻(xiàn)

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