細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與實(shí)驗(yàn)分析

1、學(xué)習(xí)交流題目：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與實(shí)驗(yàn)分析莫水晶（高級(jí)工程師）一、 熱原與細(xì)菌內(nèi)毒素的研究進(jìn)展（一）熱原與熱原反應(yīng)一百多年前，在西方醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展史上，一個(gè)重要的發(fā)展就是注射給藥（特別是靜脈注射）方式的創(chuàng)立，它在人類與疾病作斗爭(zhēng)的過程中起了重大作用。但是無論過去還是現(xiàn)在，在臨床上使用注射劑，常易發(fā)生不良反應(yīng)（冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、膚色灰白、昏迷、休克）而加重病情，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致病人重要器官功能衰竭或死亡。1875年（Brrdon-Sanderson）從腐肉中分離出不帶活菌的物質(zhì)，能引起上述一系列癥狀，并稱之為熱原（Pyrogen）。將上述一系列不良反應(yīng)定為熱原反應(yīng)。為了克服熱原反應(yīng)的發(fā)生

2、，保障輸、注藥品的給藥安全，對(duì)熱原進(jìn)行了廣泛的研究。1923年Seibert肯定熱原來源于細(xì)菌，它能從濾器濾過，對(duì)熱穩(wěn)定，注射劑雖經(jīng)嚴(yán)格滅菌，仍不能排除熱原反應(yīng)的發(fā)生，而提出采用家兔檢測(cè)熱原的方法。1、熱原檢查法的建立及優(yōu)、缺點(diǎn)1942年美國首先將家兔熱原檢查方法收入藥典，作為檢查藥品注射液中發(fā)熱物質(zhì)的法定方法。因此，相繼在世界各國藥典均規(guī)定了這一檢查方法。中國藥典自1953年版開始收載了熱原檢查法（各國藥典方法基本相同）。近半個(gè)世紀(jì)以來，這項(xiàng)保障藥品安全的檢查，發(fā)揮了重要作用。家兔熱原檢查法的優(yōu)點(diǎn)：它能反映出“熱原”引起哺乳動(dòng)物復(fù)雜的升溫反應(yīng)過程，除此之外很難列出這一檢查方法的更多優(yōu)點(diǎn)。19

3、52年，世界衛(wèi)生組織生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)，邀請(qǐng)了一些國家協(xié)作，試圖建立熱原標(biāo)準(zhǔn)品，使這一檢查方法成為一種定量的方法。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱原質(zhì)的劑量與家兔升溫反應(yīng)關(guān)系的直線斜率是不一樣的，有的很銳，有的很平，使熱原檢查方法成為一種定量方法的任何努力都失敗了。而且隨著科學(xué)技術(shù)和制藥工業(yè)的發(fā)展，這一檢查方法的局限性，首先是這一方法不能標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)：熱原檢查法之所以不能進(jìn)行定量測(cè)定原因是：（1）、熱原的絕對(duì)不均一性（不同細(xì)菌來源的不一致性），不知道被檢測(cè)品中存在熱原到底是哪一種，因此無法確定選擇從哪一種細(xì)菌制備的熱原作為一個(gè)“標(biāo)準(zhǔn)品”（2）、家兔經(jīng)常處于被革蘭氏細(xì)菌污染的環(huán)境中，通過吸入、食入、皮膚受傷

4、，感染了這些細(xì)菌，可以說每個(gè)家兔生活中已經(jīng)或多或少地被革蘭氏細(xì)菌免疫了。（3）、家兔試驗(yàn)，常常處于被驚擾的條件下，驚擾可能引起降溫或升溫。（4）、這一方法的精密度和靈敏度均很差，試驗(yàn)的重復(fù)性差，特別是對(duì)于邊緣產(chǎn)品，主要原因是動(dòng)物個(gè)體之間對(duì)熱原反應(yīng)性的差異，靈敏度差也是一個(gè)原因。目前美國、歐洲藥典都拒絕以這一試驗(yàn)控制水的熱原檢查。(5)、成本高。2、熱原致熱機(jī)理多年來的研究已經(jīng)證明，熱原進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)后，并不直接引起發(fā)熱和其它毒性反應(yīng)，但它可使白細(xì)胞（單核細(xì)胞）釋放出“內(nèi)源性熱原”質(zhì)，這種內(nèi)源性熱原質(zhì)是熱原和炎癥活性的細(xì)胞變動(dòng)素（Cytokines）混合物，白細(xì)胞介素與腫瘤壞死因子a；白細(xì)

5、胞介素和干擾素等。自1988年英國學(xué)者Poole.S報(bào)道用放射免疫方法測(cè)定細(xì)胞變動(dòng)素后，在歐洲藥學(xué)界引起重視，它很有可能導(dǎo)致建立一種新型的熱原檢查方法。因此作為檢測(cè)微量細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試驗(yàn)（Limulns test）的創(chuàng)立，除了在臨床上用于檢測(cè)內(nèi)毒素血癥外，一個(gè)重要的研究領(lǐng)域就是如何評(píng)價(jià)它在藥品熱原檢查方面的地位以及它與經(jīng)典的藥品熱原檢查法的關(guān)系。（二）細(xì)菌內(nèi)毒素在自然界，細(xì)菌屬微生物中原核生物，根據(jù)細(xì)菌對(duì)革蘭氏染色法的反應(yīng)，可分為革蘭陽性菌和革蘭氏陰性菌，這種區(qū)別主要是與細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)。這種毒素可歸納為兩類：一類稱外毒素（Exotoxin），它是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，大多數(shù)革蘭氏陽性菌在生長繁

6、殖的過程中，經(jīng)常不斷地向菌體外分泌這些毒素，一旦細(xì)菌死亡、解體，毒素也不再產(chǎn)生，這些毒素的主要成份是復(fù)合蛋白，對(duì)光、熱、酸、堿都很不穩(wěn)定。另一類稱內(nèi)毒素（Endotoxin），它是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁外壁層上的特有結(jié)構(gòu)，革蘭氏陽性菌則無，它在細(xì)菌生長、繁殖過程中，并不分泌到介質(zhì)中，也不能從外壁層上自然脫落，它不是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)菌死亡解體后，才顯示出一系列的內(nèi)毒素生物活性。1、細(xì)菌內(nèi)毒素化學(xué)組成細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin）是G-菌細(xì)胞壁層上的特有結(jié)構(gòu)，內(nèi)毒素為外源性致熱原，它可激活性粒細(xì)胞，使之釋放出一種內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱。到目前為止，我們知道細(xì)菌內(nèi)毒素作為G-

7、菌細(xì)胞壁外表層結(jié)構(gòu)的一部分脂多糖主要是由多糖O抗原，核心多糖和類脂A三部分組成。類脂A位于最外層。多糖抗原向外由若干個(gè)低聚糖的重復(fù)單位組成的多糖鏈，具有特異性，核心多糖分為內(nèi)核心及外核心，外核心由數(shù)種單糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等組成。內(nèi)核心含有庚糖及特殊的KDO（3-脫氧-D-甘露糖-辛酮糖）。KDO以耐酸的酮糖鍵與類脂A的氨基葡萄糖連接。所有G-菌都有此結(jié)構(gòu)。類脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖為單位，通過焦磷酸鍵組成的一種獨(dú)特的糖脂化合物，具有致熱作用，是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性成分。·脂多糖結(jié)構(gòu)·類脂A結(jié)構(gòu)2、細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性（1）、致熱性（2）、致死毒性

8、（3）、白細(xì)胞減少（4）、降低血壓、休克（5）、激活凝血系統(tǒng)（6）、誘導(dǎo)對(duì)內(nèi)毒素的耐受性（7）、鱟血細(xì)胞溶解物的凝集（8）、誘導(dǎo)抗感染的非特異抵抗力（9）、腫瘤細(xì)胞壞死作用二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法本法系利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，內(nèi)毒素的量用EU/ML表示：·鱟試劑反應(yīng)機(jī)理光度法定量鱟試劑反應(yīng)示意圖 封閉G因子支鏈反應(yīng)示意圖細(xì)菌內(nèi)毒素 葡 聚 糖Endotoxin （1-3）-D-glucan 加入堿土金屬離子 (+) 加入真菌多糖 C因子 活化C因子 (+) (-) B因子 活化B因子 (+) (-) 活化G因子 G因子

9、 凝固酶原 凝固酶顯色合成基質(zhì) Boc-Leu-Gly-Arg-C0 NH-pNA H-AlaLeu-Gly-Arg-ThrArg-Glyphe-OH 1 16 17 18 19 46 47 175 Boc-Leu-Gly-Arg-OH H-ThrArg-OH NaN02/HCL 19 46 （鱟肽鏈C） 銨基硫酸銨 H-AlaLeu-Gly-Arg- OH H-Glyphe-OH 1 16 17 18 47 175 萘二乙胺 A鏈 B鏈 （S-S）2偶氮蘭復(fù)合物（呈玫瑰紅色） 重合化（濁度上升） A545 A380-405 A545-630 A492-660 比色法 （顯色合成基質(zhì)法） 比濁

10、法 （一）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究進(jìn)展細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱“鱟試驗(yàn)）。自1973年以來，鱟試驗(yàn)被證明是一種有效檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素（熱原）存在的試劑。于是1973年美國食品與藥品管理署（FDA）就推薦鱟試驗(yàn)用于生產(chǎn)工藝流程的內(nèi)毒素質(zhì)量控制。因?yàn)檫@種鱟試驗(yàn)的靈敏性被證實(shí)為防止給藥或使用產(chǎn)品存在細(xì)菌內(nèi)毒素而導(dǎo)致人或動(dòng)物發(fā)熱、休克和死亡具有重要價(jià)值。此后由于鱟試劑生技術(shù)的改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化研究的進(jìn)展，鱟試劑的靈敏度要比早期產(chǎn)品高出100倍，而且人們普遍認(rèn)識(shí)到在所有藥學(xué)領(lǐng)域和藥品生產(chǎn)中對(duì)內(nèi)毒素污染進(jìn)行監(jiān)督是非常重要的。用鱟試驗(yàn)要比家兔試驗(yàn)迅速、經(jīng)濟(jì)、所需要樣品量少，操作過程工作量小，每天可以進(jìn)行許多樣品檢測(cè)。于是19

11、80年美國藥典（USP）20版收載了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（Bacterial Endotoxins Test）而中國藥典1990版收截，可是在任何品種正文中，仍未要求進(jìn)行該項(xiàng)檢查。1980年，F(xiàn)DA宣布鱟試驗(yàn)法可以檢測(cè)人用或獸用注射藥品的內(nèi)毒素。1983年USP增補(bǔ)本在規(guī)定了5種水和40種放射性藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值的同時(shí)，刪除了這些品種的熱原試驗(yàn)。1985年USP21版正文收載5種注射用水及40種放射性藥品的鱟試驗(yàn)法檢測(cè)內(nèi)毒素，并規(guī)定了這些品種細(xì)菌內(nèi)毒素的限量。1990年USP22版除放射性藥品外，又增加了10種品種以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法。1991年11月執(zhí)行的USP22版第五增補(bǔ)版公布

12、了185種藥品刪除家兔熱原檢查法，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替。在此之后，USP的第六和第七增補(bǔ)本還發(fā)布了眾多品種過去未要求進(jìn)行熱原試驗(yàn)也新增加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)。根據(jù)這一總的趨勢(shì)可以肯定，凡不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查或雖有干擾，但可以克服的藥品注射劑，將全部以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查代替家兔熱原檢查。1995年USP23版注射液熱原檢查項(xiàng)幾乎都被細(xì)菌內(nèi)毒素檢查代替。（二）實(shí)施細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的基本條件·鱟試劑·細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（79-5；86-3；89-6；92-4；96-2；98-1）·細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水·相關(guān)的實(shí)驗(yàn)器械（玻璃試管、吸管、恒溫水浴箱、振蕩器、封口膜等）三、中

13、國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法學(xué)習(xí)與討論本法系利用從鱟的變形細(xì)胞中提取的試劑來檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU/）表示。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及設(shè)置的各種

14、陽性對(duì)照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑在37±1條件下24小時(shí)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。細(xì)菌內(nèi)毒素定量測(cè)定用的檢查用水，其內(nèi)毒素的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250干烤至少1小時(shí)，也可用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)示為無內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無干擾的器械。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.08.0

15、的范圍內(nèi)。對(duì)于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖劑調(diào)節(jié)PH值。酸或堿溶液須用檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中進(jìn)行配制。緩沖劑必須經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子。內(nèi)毒素限值的建立 藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/M式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U活性單位表示，注射劑K=5E U/(kg·h)，放射性藥品注射劑K=2.5 EU/(kg·h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/(kg·h)；M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量，以

16、ml(kg·h)、mg (kg·h)或U活性單位/ (kg·h)表示，人均體重按60kg計(jì)算，注射時(shí)間若不足1小時(shí)按1小時(shí)計(jì)算。確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在此稀釋倍數(shù)下可進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測(cè)。用以下公式來確定MVD：MVD=CL/式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值：C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U活性單位表示時(shí)，C的單位需為mg/ml或U活性單位/ml；為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或是在光度測(cè)定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。方法1 凝膠

17、法凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測(cè)或定量檢測(cè)內(nèi)毒素的方法。在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素最低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（），將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2.0、1.0、0.5和0.25四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取含有分裝了0.1ml鱟試劑溶液的10mm×75mm試管或復(fù)溶后

18、的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支,其中16管加入0.1ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,每一個(gè)濃度平行做4支;另外兩管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37±1適宜恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。若最大濃度2.0管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度幾何平均值，即為鱟

19、試劑靈敏度的測(cè)定值(c).c =1g-1(X/4)式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)c在0.52.0(包括0.5和2.0)時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。干擾試驗(yàn) 按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。只有當(dāng)A和D的所有平行管都為陰性，并且C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和Et）。Es= 1g-1(Xs/4)Et= 1g-1(Xt

20、/4)式中Es和Et分別為溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。當(dāng)Es在0.52.0(包括0.5和2.0)時(shí)，且當(dāng)Et在0.5Es2.0Es (包括0.5和2.0)時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用，如果供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。表1 凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液1248210.50.254444C2/檢查用水檢查用水1248210.50.254444D無/檢查用水2注：A 供試品溶液；B干擾試

21、驗(yàn)系列；C鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列；D陰性對(duì)照。使用更高靈敏度的鱟試劑并對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢查法1）凝膠限量試驗(yàn)按表2制備溶液A、B、C、D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟

22、試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。表2 凝膠限量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2C2/檢查用水2B2/供試品溶液2D無/檢查用水2注：A供試品溶液；B供試品陽性對(duì)照；C陽性對(duì)照；D陰性對(duì)照。結(jié)果判斷 保溫60分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的平行管為陰性，供試品陽性對(duì)照B的所有平行管為陽性，陽性對(duì)照溶液C的平行管都為陽性，試驗(yàn)有效。若溶液A的兩個(gè)平行管都為陰性，判供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個(gè)平行客都為陽性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個(gè)平行管中的一管為陽性另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若所

23、有平行管都為陽性，判供試品符合規(guī)定。2）凝膠半定量試驗(yàn)本方法系通過確定終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。依表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。結(jié)果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液D的所有平行管為陰性，供試品陽性對(duì)照B的所有平行管為陽性，溶液C的終點(diǎn)濃度的幾何平均值在0.52之間，試驗(yàn)有效。溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以，為每個(gè)系列的終點(diǎn)濃度，所有平行管終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按“靈敏度的復(fù)核”中的公式）。如果試驗(yàn)的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都

24、為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于（如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則記錄為小于乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù)）。如果結(jié)果都為陽性，應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。表3 凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水12482222B2/供試品溶液22C2/檢查用水檢查用水1248210.50.252222D無/檢查用水2注：A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品溶液。用檢查用水進(jìn)行2倍系列稀釋，從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開

25、始再稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，但隨后的稀釋也不得超過MVD；B：含2濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽性對(duì)照）；C：含2、1、0.5、0.25濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的檢查用水系列；D：陰性對(duì)照。方法2 光度測(cè)定法 光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可以分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。終點(diǎn)濁度法是依據(jù)反映混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)的濁度（吸光度和透光率）之間存在著量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。顯色基質(zhì)法系利用

26、檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特殊底物顯色釋放出的有色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，分為終點(diǎn)顯色法和動(dòng)態(tài)顯色法。終點(diǎn)顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其在孵育終止時(shí)釋放出的有色團(tuán)的量之間存在著量化關(guān)系來測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)色度增長速度的方法。光度測(cè)定試驗(yàn)應(yīng)在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37±1。為保證濁度和顯色試驗(yàn)的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)以及供試品溶液的干擾試驗(yàn)。當(dāng)試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何可能影響檢測(cè)結(jié)果的改變時(shí)，試驗(yàn)的有效性應(yīng)重新檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（稀釋度不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)要求做2支陰性對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分