活化Notch2信號促進高糖條件下破骨細胞分化體外探究

1、活化notch2信號促進高糖條件下破骨細胞分化體外探究摘要目的探討活化notch2信號對高糖條件下核因子 kb受體活化因子配體（rankl）誘導破骨細胞分化的影響，初步明確notch2信號在髙糖條件下破骨細胞分化中的 作用。方法體外培養(yǎng)小鼠破骨前體細胞，在高糖條件下采 用rankl刺激破骨前體細胞。實驗分為葡萄糖和甘露醇等滲 對照組，每組設5個濃度（0、5、10、20、40 mmol l-1）,通過實時定量聚合酶鏈反應檢測notch2基因的表達水 平，抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）染色檢測破骨細胞分化情 況。構建含notch2細胞內(nèi)片段（icn2 ）的病毒載體 （pmx-icn2）,轉染包裝細

2、胞，收獲病毒上清液感染破骨前 體細胞；將病毒載體分為icn2-oe （icn2過表達）和empty （僅感染pmx載體）兩組，通過蛋白質印跡法檢測icn2蛋 白的表達水平；并在高糖條件下（20.40 mmoll-1）用rankl 刺激icn2-0e和empty組，設甘露醇等滲對照組，用trap 染色檢測破骨細胞分化情況。結果rankl誘導破骨細胞分化過 程中，葡萄糖濃度為20、40 mmoll-1時，破骨細胞數(shù)分 別為110. 3±6. 8和72. 0±8. 0, notch2相對表達量分別為 1. 65±0. 23 和 1. 10±0. 11； 20、

3、40 mmol lt 甘露醇組的 破骨細胞數(shù)分別為152. 7±7. 0和157. 0±12.5, notch2相 對表達量分別為2. 82±0. 28和2. 42±0. 27,組間差異有統(tǒng) 計學意義（p0. 05）；葡萄糖濃度分別為5、10 mmoll-l時與等滲 甘露醇組間的差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）,隨著葡萄糖濃度的繼續(xù)升高，破骨細胞數(shù)目減少，葡萄糖濃度為 20、40 mmoll-1時與等滲甘露醇組間的差異具有統(tǒng)計學意 義（p0. 05）；葡萄糖濃度分別為5、10 mmoll-1時與等滲 甘露醇組間表達的差異無統(tǒng)計學意義（p>0.

4、05）,隨著葡萄 糖濃度的繼續(xù)升高，notch2受體表達逐漸降低，葡萄糖濃度 為20、40 mmoll-l時與等滲甘露醇組間的差異具有統(tǒng)計 學意義（p0.05）。該結果提示高糖環(huán)境可以抑制rankl誘 導的notch2受體表達。2.3活化notch2信號促進高糖環(huán)境下rankl誘導的破骨細胞分化pmx-icn2表達載體經(jīng)xba i酶切，得到預期大小分別 為1 587、2 619、4 299 bp的片段，結果如圖2所示，初 步表明逆轉錄病毒載體pmx-icn2構建成功。對dna測序結 果進一步分析表明此重組表達載體構建正確。從圖3中可看 出：與empty組（感染pmx空載體病毒上清液）細胞相比，

5、 icn2-0e的icn2表達水平升高，該結果提示notch2信號被 活化。從表3中可以看出：活化notch2信號后，甘露醇濃 度為20、40 mmollt 時，icn2-0e組破骨細胞數(shù)量多于 empty組，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)；葡萄糖濃度為20、40 mmoll-1時，icn2-0e組破骨細 胞數(shù)量多于empty組，兩組間的差異具有統(tǒng)計學意義 (p<0. 05)；但是在 20、40 mmol l-1 時，icn2-0e 組破骨 細胞數(shù)量少于對照組(等滲甘露醇濃度組)，且二者間的差 異具有統(tǒng)計學差異(p0.05)。該結果提示活化notch2信號不但可以促進高滲狀態(tài)下r

6、ankl誘導 的破骨細胞分化，而且可以促進高糖環(huán)境下rankl誘導的破 骨細胞分化，但活化notch2信號不能夠完全阻止高糖對破 骨細胞分化的抑制作用，說明可能有多種信號途徑參與了高 糖抑制破骨細胞分化的過程。3討論國內(nèi)外有關高糖刺激對體外破骨細胞分化影響的研究 結果仍不一致。一方面，有研究5表明高濃度葡萄糖通過提高破骨前體細胞表面核因子kb受體 (re-ceptor activator of nuclear factor kappa b, rank) 的表達水平，從而促進rankl誘導破骨細胞的分化及其骨吸 收功能；另一方面，也有研究6表明高濃度葡萄糖通過降低細胞核因子k b (nuclea

7、r factor kappa b, nf-kb)的活性而抑制破骨細胞分化。破骨前體細胞在向破骨細胞分化的過程中，受到多種信 號通路的精確調(diào)控以及所處微環(huán)境的綜合影響。破骨前體細 胞向破骨細胞分化及其骨吸收過程中，需要葡萄糖作為基本 的能量代謝物質。根據(jù)預實驗結果和以往的文獻報道7, 人體內(nèi)正常血糖濃度大約為5. 5 mmoll-1,本實驗選擇葡萄糖濃度為5、10、20、40 mmollt的a-mem培養(yǎng)基培養(yǎng)破骨前體 細胞。從本實驗的研究結果可以看出，各組均有破骨細胞形 成，隨著葡萄糖濃度的升高，多數(shù)實驗組破骨細胞的數(shù)量少 于等滲對照組，二者間差異具有統(tǒng)計學意義。這說明rankl 能誘導破骨前

8、體細胞向破骨細胞分化，而高糖環(huán)境可以抑制 破骨細胞分化，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性，總體趨勢是濃度越 大，抑制破骨細胞分化的能力越強。破骨細胞分化的機制是一種復雜的多水平調(diào)控機制 8-9,多因素相互作用可以促進或抑制破骨細胞的分化。 對破骨細胞分化調(diào)控機制的探討是國內(nèi)外的研究熱點。 notch信號是細胞與細胞之間直接作用的主要信號通路之 一，參與調(diào)控細胞的增殖、分化等生物學過程。經(jīng)典notch 信號通路由受體配體相互作用后，導致notch受體胞內(nèi)段icn 從膜上釋放，icn進入細胞核，將與dna結合的抑制蛋白轉 化為轉錄激活因子，激活下游靶基因的表達10。notch信 號通路的關鍵核轉錄因子rbp-

9、j和nf-kb通過競爭性與活 化 t 細胞核因子 1 (nuclear factor of activated t-cell 1,nfatcl)啟動子區(qū)域結合，在rankl誘導破骨細胞分化 過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用3。利用丫-分泌酶抑制劑阻斷notch信號或是通過shrna干擾阻斷notch2 信號可抑制rankl誘導的破骨細胞的分化過程，而活化 notch2信號可促進rankl誘導的破骨細胞分化過程。由于破 骨前體細胞主要表達notch2受體3,提示notch信號的綜合效應可能為正向調(diào)控rankl誘導破 骨細胞分化過程。本實驗結果提示，隨著葡萄糖濃度的升高, 實驗組細胞表面notch2受體的

10、表達水平低于對照組，二者 之間差異具有統(tǒng)計學意義。這說明rankl能提高細胞表面 notch2受體的表達水平，而高糖環(huán)境可以抑制notch2受體 的表達，提示notch2信號可能參與調(diào)控高糖環(huán)境下rankl 誘導的破骨細胞分化過程。目前，notch2信號在高糖狀態(tài)下，對破骨細胞分化的調(diào) 控作用還少有研究。已有研究表明，外源性notch分子胞內(nèi) 區(qū)組成性活化形式icn的表達與notch配體激活notch受體 后對靶細胞的作用相類似，外源性icn基因在靶細胞持續(xù)表 達導致notch信號過度活化11-12 o因此，本實驗研究通 過逆轉錄病毒系統(tǒng)將具有notch2活性的胞內(nèi)片段icn2導入破骨前體細胞

11、，觀 察高糖條件下，活化notch2信號對破骨細胞分化的影響。 本實驗結果提示，活化notch2信號后，在相同的葡萄糖濃 度下，實驗組破骨細胞的數(shù)量多于對照組（轉染空載體），二者間差異具有統(tǒng)計學意義。該結果說明激活notch2信號能促進高糖條件下破骨細 胞的分化，提示notch2信號可能正向調(diào)控髙糖環(huán)境下破骨 細胞的分化過程。結合考慮高糖抑制nf-kb活性的研究結 果，notch2信號可能與nf-kb具有協(xié)同作用，可見高糖作 用下破骨細胞的分化機制相當復雜，除上述因素外，還有其 他信號參與其中。致謝：感謝日本福岡齒科大學分子生物學系岡部幸司教 授在本課題實施中給予的大力幫助！參考文獻1 tei

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