miR9b致胚胎心臟畸形的機(jī)制？

1、國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)家自然科學(xué)基金標(biāo)書(shū)寫(xiě)作分析標(biāo)書(shū)寫(xiě)作分析mir-19b致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究思路與背景介紹思路與背景介紹v 心臟發(fā)育很重要心臟發(fā)育很重要v 從胎兒畸形心臟從胎兒畸形心臟-正常心臟中尋找研究線索正常心臟中尋找研究線索-差異差異mirnav mirna19b差異明顯、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其在物種間功能保守差異明顯、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其在物種間功能保守v 做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)： mirna19b過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致斑馬魚(yú)心臟畸形（功能）斑馬魚(yú)心臟畸形（功能）v 讀心臟發(fā)育文獻(xiàn)：讀心臟發(fā)育文獻(xiàn)：影響影響wnt、bmp、tgfbeta是懷疑的可能機(jī)制（機(jī)

2、制）是懷疑的可能機(jī)制（機(jī)制）v 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)： mirna19b下游靶標(biāo)是下游靶標(biāo)是wnt1v 臨床標(biāo)本確定：臨床標(biāo)本確定：wnt是變化的、與是變化的、與mirna19b關(guān)系是一致的關(guān)系是一致的v 提出問(wèn)題提出問(wèn)題：究竟是不是這個(gè)機(jī)制？：究竟是不是這個(gè)機(jī)制？（主線與研究?jī)?nèi)容）（主線與研究?jī)?nèi)容）mir-19b致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究v 三個(gè)關(guān)鍵詞：三個(gè)關(guān)鍵詞： mir-19b 、先心、先心、wnt （mir-19b、心臟畸形、機(jī)制）、心臟畸形、機(jī)制）mir-19b致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究確定有無(wú)創(chuàng)新確定有無(wú)創(chuàng)新v 源頭創(chuàng)新

3、：源頭創(chuàng)新： mir-19b與先心關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道與先心關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道v 切入點(diǎn)：切入點(diǎn)： mir-19b（主要論述點(diǎn)）（主要論述點(diǎn)）確定科學(xué)問(wèn)題確定科學(xué)問(wèn)題v 一個(gè)科學(xué)問(wèn)題：一個(gè)科學(xué)問(wèn)題： mir-19b致胚胎心臟畸形的機(jī)制？致胚胎心臟畸形的機(jī)制？v 一條主線：一條主線： wnt機(jī)制機(jī)制 （經(jīng)典通路、研究的內(nèi)容）（經(jīng)典通路、研究的內(nèi)容）提取關(guān)鍵詞提取關(guān)鍵詞1.mir-19b與先心關(guān)系：因果關(guān)系嗎？與先心關(guān)系：因果關(guān)系嗎？ 臨床先心標(biāo)本：臨床先心標(biāo)本： 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)mir-19b差異表達(dá)差異表達(dá) 斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)：斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)： mir-19b過(guò)表達(dá)出現(xiàn)心臟畸形過(guò)表達(dá)出現(xiàn)心臟畸形 缺乏：缺乏： mir-19b沉

4、默與表型之間的關(guān)系沉默與表型之間的關(guān)系2.wnt與先心關(guān)系：與先心關(guān)系：ok3.mir-19b與與wnt關(guān)系：怎樣想到的？有證據(jù)嗎？關(guān)系：怎樣想到的？有證據(jù)嗎？ 臨床先心標(biāo)本臨床先心標(biāo)本 mir-19b與與wnt表達(dá)變化的方向表達(dá)變化的方向 斑馬魚(yú)標(biāo)本斑馬魚(yú)標(biāo)本 mir-19b過(guò)表達(dá)時(shí)過(guò)表達(dá)時(shí)wnt通路變化通路變化 缺乏：缺乏： mir-19b沉默時(shí)沉默時(shí)wnt通路變化通路變化 mir-19b一定通過(guò)一定通過(guò)wnt通路作用嗎？通路作用嗎？ mir-19b與與wnt有直接結(jié)合位點(diǎn)嗎？有直接結(jié)合位點(diǎn)嗎？mir-19b wnt 先心先心？具體分析（畫(huà)圖）具體分析（畫(huà)圖）確定研究?jī)?nèi)容確定研究?jī)?nèi)容一條主

5、線下的三個(gè)層次一條主線下的三個(gè)層次 （一）整體驗(yàn)證（一）整體驗(yàn)證（mir-19b與心臟畸形）及與心臟畸形）及相關(guān)性評(píng)價(jià)（相關(guān)性評(píng)價(jià)（wnt）： mir-19b表達(dá)異常表達(dá)異常對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育及對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育及wnt信號(hào)通路的影響信號(hào)通路的影響 （二）機(jī)制分析：（二）機(jī)制分析：mirna-19b影響影響wnt信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制 1. mir-19b與與wnt1過(guò)表達(dá)過(guò)表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)心臟畸形的影響對(duì)斑馬魚(yú)心臟畸形的影響 2. mir-19b與與wnt1沉默表達(dá)沉默表達(dá)對(duì)斑馬魚(yú)心臟畸形的影響對(duì)斑馬魚(yú)心臟畸形的影響 （三）機(jī)制驗(yàn)證：（三）機(jī)制驗(yàn)證：

6、mir-19b對(duì)對(duì)wnt1的調(diào)控的調(diào)控機(jī)制機(jī)制 v 故事講述：故事講述：1）先心防治現(xiàn)狀與危害）先心防治現(xiàn)狀與危害 研究的必要性、意義研究的必要性、意義 2）目前有關(guān)遺傳學(xué)研究進(jìn)展）目前有關(guān)遺傳學(xué)研究進(jìn)展 國(guó)內(nèi)外進(jìn)展，提出國(guó)內(nèi)外進(jìn)展，提出mirna 3）有關(guān)）有關(guān)mirna與先心與先心 找到更新的會(huì)有價(jià)值找到更新的會(huì)有價(jià)值 4）mir-19b的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn) 與先心關(guān)系無(wú)，創(chuàng)新性與先心關(guān)系無(wú)，創(chuàng)新性 5）在斑馬魚(yú)的研究結(jié)果在斑馬魚(yú)的研究結(jié)果 整體功能指標(biāo)整體功能指標(biāo) 6）信息分析其可能機(jī)制信息分析其可能機(jī)制 wnt通路引出通路引出 7）臨床標(biāo)本臨床標(biāo)本+斑馬魚(yú)看斑馬魚(yú)看wnt通路通路 論證其機(jī)制的

7、可能性論證其機(jī)制的可能性 8）課題擬研究思路）課題擬研究思路 展現(xiàn)全貌展現(xiàn)全貌 9）研究成功將帶來(lái)的價(jià)值）研究成功將帶來(lái)的價(jià)值 研究?jī)r(jià)值研究?jī)r(jià)值寫(xiě)作策略寫(xiě)作策略標(biāo)書(shū)初步寫(xiě)作標(biāo)書(shū)初步寫(xiě)作摘要與立項(xiàng)依據(jù)部分摘要與立項(xiàng)依據(jù)部分(限限400字字)：mirnas 在胚胎心臟發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。前期應(yīng)用下在胚胎心臟發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。前期應(yīng)用下一代測(cè)序和一代測(cè)序和mirna芯片篩選均發(fā)現(xiàn)心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織中芯片篩選均發(fā)現(xiàn)心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織中mir-19b 表達(dá)異常，表達(dá)異常，mir-19b 過(guò)表達(dá)可致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育畸形；生物信息學(xué)分析發(fā)過(guò)表達(dá)可致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育畸形；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)現(xiàn)

8、wnt1 為為mir-19b 的靶基因，在心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織中的靶基因，在心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織中wnt1 蛋白蛋白表達(dá)下調(diào)表達(dá)下調(diào), wnt 信號(hào)通路下游蛋白信號(hào)通路下游蛋白gsk3表達(dá)上調(diào)，提示表達(dá)上調(diào)，提示mir-19b 可能通可能通過(guò)影響過(guò)影響wnt 信號(hào)通路致胚胎心臟畸形。本研究擬在體觀察信號(hào)通路致胚胎心臟畸形。本研究擬在體觀察mirna-19b 致致斑馬魚(yú)胚胎心臟畸形；應(yīng)用基因沉默和過(guò)表達(dá)，論證斑馬魚(yú)胚胎心臟畸形；應(yīng)用基因沉默和過(guò)表達(dá)，論證mirna-19b 影響影響wnt 信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；進(jìn)一步構(gòu)建信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；進(jìn)一步構(gòu)建mir-19

9、b 表達(dá)載體和含表達(dá)載體和含野生型或突變體的野生型或突變體的wnt1 啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染入啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染入p19 細(xì)胞，揭示細(xì)胞，揭示mir-19b 對(duì)對(duì)wnt1 的調(diào)控機(jī)制。研究具有源頭創(chuàng)新性，并的調(diào)控機(jī)制。研究具有源頭創(chuàng)新性，并可能闡明可能闡明mir-19b 致胚胎心臟畸形的機(jī)制，為先天性心臟病在胚胎期的早致胚胎心臟畸形的機(jī)制，為先天性心臟病在胚胎期的早期防治提供幫助。期防治提供幫助。立項(xiàng)依據(jù)立項(xiàng)依據(jù) 脊椎動(dòng)物的心臟是胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成并行駛功能的器官，脊椎動(dòng)物的心臟是胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成并行駛功能的器官，其發(fā)生需經(jīng)由多細(xì)胞系特化、管狀

10、結(jié)構(gòu)形成、最后精確組裝成成熟其發(fā)生需經(jīng)由多細(xì)胞系特化、管狀結(jié)構(gòu)形成、最后精確組裝成成熟4個(gè)心腔結(jié)構(gòu)等發(fā)育過(guò)程，需要一系列重要的形態(tài)發(fā)生事件，包括細(xì)個(gè)心腔結(jié)構(gòu)等發(fā)育過(guò)程，需要一系列重要的形態(tài)發(fā)生事件，包括細(xì)胞決定、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化等胞決定、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化等1，其間有多條信號(hào)通路（如，其間有多條信號(hào)通路（如wnt 信號(hào)通路、信號(hào)通路、notch 信號(hào)通路等）參與其發(fā)育調(diào)控信號(hào)通路等）參與其發(fā)育調(diào)控2,3，以保證胚胎心，以保證胚胎心臟形成在時(shí)間和空間的協(xié)調(diào)發(fā)育。由于心臟的血液循環(huán)功能對(duì)脊椎臟形成在時(shí)間和空間的協(xié)調(diào)發(fā)育。由于心臟的血液循環(huán)功能對(duì)脊椎動(dòng)物的生存起關(guān)鍵作用，心臟發(fā)育畸形不但嚴(yán)重影響動(dòng)

11、物生后的宮動(dòng)物的生存起關(guān)鍵作用，心臟發(fā)育畸形不但嚴(yán)重影響動(dòng)物生后的宮外生活質(zhì)量，而且常導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等外生活質(zhì)量，而且常導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等4，因此有關(guān)胚胎心臟畸形，因此有關(guān)胚胎心臟畸形的研究近年來(lái)受到普遍重視，并已成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病早期防治的研究近年來(lái)受到普遍重視，并已成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病早期防治的一個(gè)熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。的一個(gè)熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。 現(xiàn)已知，現(xiàn)已知，mirnas 參與調(diào)控胚胎心臟的發(fā)育，在心肌細(xì)胞的生參與調(diào)控胚胎心臟的發(fā)育，在心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用長(zhǎng)及分化過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用5。已有研究報(bào)道靶向敲除。已有研究報(bào)道靶向敲除特異的特異的mirna 與心臟畸形密切相

12、關(guān)，其中敲除小鼠的與心臟畸形密切相關(guān)，其中敲除小鼠的mirna-1-2 導(dǎo)致導(dǎo)致50%小鼠發(fā)生室間隔缺損而死亡小鼠發(fā)生室間隔缺損而死亡, 存活小鼠解剖發(fā)現(xiàn)心室穿孔存活小鼠解剖發(fā)現(xiàn)心室穿孔6；敲除敲除mirna-133a-1/mirna-133a-2 的小鼠胚胎發(fā)生心臟心室壁變薄的小鼠胚胎發(fā)生心臟心室壁變薄和心室發(fā)育缺陷和心室發(fā)育缺陷7；在敲除斑馬魚(yú)胚胎；在敲除斑馬魚(yú)胚胎mirna-138 的研究中，發(fā)現(xiàn)的研究中，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)心房和心室發(fā)育異常，心肌前體細(xì)胞成熟受阻斑馬魚(yú)心房和心室發(fā)育異常，心肌前體細(xì)胞成熟受阻8。雖然上述。雖然上述與心臟畸形相關(guān)與心臟畸形相關(guān)mirnas 的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展

13、，但目前明確的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前明確對(duì)胚胎具有心臟致畸作用的對(duì)胚胎具有心臟致畸作用的mirnas 并不多，因而采用下一代測(cè)序并不多，因而采用下一代測(cè)序或生物芯片等技術(shù)篩選與胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異或生物芯片等技術(shù)篩選與胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異mirnas，對(duì)，對(duì)其表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究顯得尤為重要其表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究顯得尤為重要9。 近年來(lái)，采用下一代測(cè)序或生物芯片等技術(shù)主要用于篩選模式動(dòng)物近年來(lái)，采用下一代測(cè)序或生物芯片等技術(shù)主要用于篩選模式動(dòng)物（斑馬魚(yú)、小鼠）胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異（斑馬魚(yú)、小鼠）胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異mirnas，未見(jiàn)文獻(xiàn)對(duì)心臟，未見(jiàn)文獻(xiàn)對(duì)心臟畸形流產(chǎn)胎兒

14、心臟組織相關(guān)的差異畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織相關(guān)的差異mirnas 的篩選研究報(bào)道的篩選研究報(bào)道5。本研究小。本研究小組利用我院產(chǎn)前超聲診斷科對(duì)孕中期胎兒進(jìn)行系統(tǒng)超聲檢查的優(yōu)勢(shì)，收集組利用我院產(chǎn)前超聲診斷科對(duì)孕中期胎兒進(jìn)行系統(tǒng)超聲檢查的優(yōu)勢(shì)，收集到超聲篩查并確診的胎兒左心發(fā)育不良孕婦（孕到超聲篩查并確診的胎兒左心發(fā)育不良孕婦（孕21w）3 例，家屬?gòu)膬?yōu)生例，家屬?gòu)膬?yōu)生優(yōu)育的角度要求流產(chǎn)；同時(shí)收集到未婚先孕來(lái)我院要求流產(chǎn)的同胎齡優(yōu)育的角度要求流產(chǎn)；同時(shí)收集到未婚先孕來(lái)我院要求流產(chǎn)的同胎齡3 例例正常胎兒的孕婦作為對(duì)照（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖正常胎兒的孕婦作為對(duì)照（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖1），征得醫(yī)院倫理委員會(huì)和），征

15、得醫(yī)院倫理委員會(huì)和孕婦家屬的同意，對(duì)流產(chǎn)胎兒進(jìn)行尸檢并留取胎兒的心臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研孕婦家屬的同意，對(duì)流產(chǎn)胎兒進(jìn)行尸檢并留取胎兒的心臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。我們?cè)谀戏结t(yī)科大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金究。我們?cè)谀戏结t(yī)科大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金（ m i r n a 在 胎 兒 先 天 性 心 臟 病 中 的 差 異 表 達(dá) 研 究 ， 項(xiàng) 目 號(hào) ：在 胎 兒 先 天 性 心 臟 病 中 的 差 異 表 達(dá) 研 究 ， 項(xiàng) 目 號(hào) ：nfykdx2010012，2010.12011.12，在研）的資助下，同時(shí)應(yīng)用下一代，在研）的資助下，同時(shí)應(yīng)用下一代測(cè)序和生物芯片技術(shù)對(duì)孕中

16、期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織的測(cè)序和生物芯片技術(shù)對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織的mirna 表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)8 個(gè)個(gè)mirna 在左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟在左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織與正常對(duì)照之間存在組織與正常對(duì)照之間存在3 倍以上的差異表達(dá)，并和倍以上的差異表達(dá)，并和real-time pcr 驗(yàn)證驗(yàn)證的結(jié)果一致（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖的結(jié)果一致（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖26）。其中）。其中mirna-19b 在進(jìn)化上高度保守在進(jìn)化上高度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中表（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中表1）；在斑馬魚(yú)、犬、人的胚胎心臟發(fā)育早期及生后均）；在斑馬魚(yú)、犬、人的胚胎心臟發(fā)育早期及生后

17、均有表達(dá)有表達(dá)11,12；已有研究應(yīng)用；已有研究應(yīng)用mirna 芯片篩選成人擴(kuò)張性心肌病人心臟組芯片篩選成人擴(kuò)張性心肌病人心臟組織發(fā)現(xiàn)織發(fā)現(xiàn)mirna-19b 表達(dá)異常的報(bào)道表達(dá)異常的報(bào)道10；結(jié)合我們發(fā)現(xiàn)；結(jié)合我們發(fā)現(xiàn)mirna-19b 在孕中在孕中期左心發(fā)育不良胎兒心臟組織中表達(dá)明顯上調(diào)，提示期左心發(fā)育不良胎兒心臟組織中表達(dá)明顯上調(diào)，提示mirna-19b在心臟在心臟發(fā)育早期起到重要的作用。我們采用體外合成發(fā)育早期起到重要的作用。我們采用體外合成mirna-19b 前體顯微注射前體顯微注射入斑馬魚(yú)受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精后入斑馬魚(yú)受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精后72 h 斑馬魚(yú)心臟擴(kuò)大，心肌管未能環(huán)斑馬

18、魚(yú)心臟擴(kuò)大，心肌管未能環(huán)化，提示胚胎期化，提示胚胎期mirna-19b 過(guò)表達(dá)可致胚胎心臟畸形（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖過(guò)表達(dá)可致胚胎心臟畸形（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖7）。鑒于）。鑒于mirna-19b 致胚胎心臟畸形及其機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道，因此有必致胚胎心臟畸形及其機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道，因此有必要開(kāi)展在體實(shí)驗(yàn)研究，并深入探討其機(jī)制。要開(kāi)展在體實(shí)驗(yàn)研究，并深入探討其機(jī)制。 現(xiàn)已知，心臟起源于中胚層，其胚胎時(shí)期的發(fā)生發(fā)育主要受現(xiàn)已知，心臟起源于中胚層，其胚胎時(shí)期的發(fā)生發(fā)育主要受wnt 信號(hào)信號(hào)通路通路2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）信號(hào)通路）信號(hào)通路1

19、3、notch 信號(hào)通路信號(hào)通路3等調(diào)控。其中，雖然等調(diào)控。其中，雖然bmp 信號(hào)通路與信號(hào)通路與notch 信號(hào)通信號(hào)通路在胚胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但均需通過(guò)路在胚胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但均需通過(guò)wnt 信號(hào)通路來(lái)完信號(hào)通路來(lái)完成心肌細(xì)胞的特化，提示成心肌細(xì)胞的特化，提示wnt 信號(hào)通路在胚胎心臟發(fā)育中的重要作用。經(jīng)信號(hào)通路在胚胎心臟發(fā)育中的重要作用。經(jīng)典的典的wnt 信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程2，配，配體體wnt1 蛋白是其激動(dòng)分子，當(dāng)配體蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白（蛋白是其激動(dòng)分子，當(dāng)配體蛋白與細(xì)胞

20、表面卷曲蛋白（frizzled）家族的七次跨膜受體結(jié)合后，能夠通過(guò)激活胞質(zhì)中家族的七次跨膜受體結(jié)合后，能夠通過(guò)激活胞質(zhì)中dsh（dishevelled）蛋）蛋白，抑制白，抑制gsk3（glycogen synthase kinase 3）的磷酸激酶活性，拮抗）的磷酸激酶活性，拮抗-連環(huán)蛋白（連環(huán)蛋白（-catenin）的降解，使其在胞質(zhì)中大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)）的降解，使其在胞質(zhì)中大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合合tcf/lef 家族的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活下游不同靶基因如家族的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活下游不同靶基因如cyclin d 等，呈等，呈現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)2。因此，經(jīng)典的。因此，經(jīng)典的w

21、nt 信號(hào)通路中，信號(hào)通路中，wnt1 是該信號(hào)通路是該信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，的啟動(dòng)因子，gsk3是其功能的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，而是其功能的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，而-catenin 則是其功能的執(zhí)則是其功能的執(zhí)行者。行者。 我們通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)我們通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)mirna-19b 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)14，發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)wnt 信信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白wnt1 為其潛在靶基因，兩者的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上高為其潛在靶基因，兩者的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上高度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖8）；本研究小組前期對(duì)孕鼠子代心臟發(fā)育異常的）；本研究小組前期對(duì)孕鼠子代心臟發(fā)育異常的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)孕鼠

22、子代心臟畸形與實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)孕鼠子代心臟畸形與wnt 信號(hào)通路密切相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)15，因而我，因而我們聯(lián)想到是否們聯(lián)想到是否wnt 信號(hào)通路也在信號(hào)通路也在mirna-19b 致胚胎心臟畸形中起到重要的致胚胎心臟畸形中起到重要的作用。我們進(jìn)一步對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織中作用。我們進(jìn)一步對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織中wnt 信號(hào)通路信號(hào)通路中關(guān)鍵分子（中關(guān)鍵分子（wnt1、gsk3、-catenin）的蛋白和基因水平進(jìn)行研究，發(fā)）的蛋白和基因水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)-catenin 表達(dá)下調(diào)，表達(dá)下調(diào)， gsk3 表達(dá)上調(diào)，兩者表達(dá)上調(diào)，兩者mrna 和蛋白水平的變化幅和

23、蛋白水平的變化幅度一致；而度一致；而wnt1 mrna 表達(dá)不變，蛋白表達(dá)水平下調(diào)（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖表達(dá)不變，蛋白表達(dá)水平下調(diào)（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖9），提示），提示wnt 信號(hào)通路在信號(hào)通路在mirna-19b 致胚胎心臟畸形中起作用，致胚胎心臟畸形中起作用，wnt1 可可能和能和mirna-19b 直接結(jié)合，抑制直接結(jié)合，抑制wnt1 的翻譯，但不影響其轉(zhuǎn)錄，這和的翻譯，但不影響其轉(zhuǎn)錄，這和mirna 通過(guò)堿基配對(duì)方式結(jié)合靶基因通過(guò)堿基配對(duì)方式結(jié)合靶基因mrna 的的3utr，導(dǎo)致靶基因的翻譯，導(dǎo)致靶基因的翻譯受抑制，但不影響其轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)是一致的受抑制，但不影響其轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)是一致的16，但這并不能

24、作為，但這并不能作為mirna-19b 與與wnt1 直接作用的證據(jù)，為了確認(rèn)直接作用的證據(jù)，為了確認(rèn)wnt1 是是mirna-19b 的直接靶位點(diǎn)，可的直接靶位點(diǎn)，可以采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行鑒定以采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行鑒定17。前期通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)。前期通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)wnt1 啟動(dòng)子的一段堿基序列啟動(dòng)子的一段堿基序列“uuugcac”和和mirna-19b上的保守序列上的保守序列“aaacgug”互補(bǔ)結(jié)合（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖互補(bǔ)結(jié)合（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖8），這可用于進(jìn)行熒光素酶報(bào)），這可用于進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)揭示告基因?qū)嶒?yàn)揭示mirna-19b 是否通過(guò)這個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)直

25、接結(jié)合靶基因是否通過(guò)這個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)直接結(jié)合靶基因wnt1，進(jìn)而調(diào)控進(jìn)而調(diào)控wnt 信號(hào)通路。信號(hào)通路。 鑒于上述分析和我們已獲得的研究結(jié)論，本研究擬以早期心臟發(fā)生中鑒于上述分析和我們已獲得的研究結(jié)論，本研究擬以早期心臟發(fā)生中發(fā)揮重要作用的發(fā)揮重要作用的wnt 信號(hào)通路為切入點(diǎn)，深入探討信號(hào)通路為切入點(diǎn)，深入探討mirna-19b 致胚胎心臟致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制。首先通過(guò)分析發(fā)育畸形的機(jī)制。首先通過(guò)分析mirna-19b 過(guò)表達(dá)或表達(dá)沉默時(shí)斑馬魚(yú)心過(guò)表達(dá)或表達(dá)沉默時(shí)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育情況（如心臟發(fā)育異常個(gè)體的百分比、心率）及對(duì)臟發(fā)育情況（如心臟發(fā)育異常個(gè)體的百分比、心率）及對(duì)wnt 信號(hào)通路的信號(hào)

26、通路的影響（原位雜交觀察斑馬魚(yú)心肌中影響（原位雜交觀察斑馬魚(yú)心肌中wnt信號(hào)通路中相關(guān)基因信號(hào)通路中相關(guān)基因wnt1、gsk3、-catenin 的表達(dá)水平），獲得的表達(dá)水平），獲得mirna-19b 影響影響wnt 信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形較充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；繼而分別構(gòu)建育畸形較充分的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；繼而分別構(gòu)建wnt1 與與mirna-19b 的過(guò)表達(dá)或的過(guò)表達(dá)或沉默表達(dá)載體，通過(guò)雙載體轉(zhuǎn)染（沉默表達(dá)載體，通過(guò)雙載體轉(zhuǎn)染（“mirna-19b 沉默沉默+ wnt1 過(guò)表達(dá)過(guò)表達(dá)”或或“mirna-19b 過(guò)表達(dá)過(guò)表達(dá)+wnt1 沉默沉默”） 觀察斑馬魚(yú)心臟發(fā)育情況，論證觀察斑

27、馬魚(yú)心臟發(fā)育情況，論證mirna-19b影響影響wnt 信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；進(jìn)一步構(gòu)建信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；進(jìn)一步構(gòu)建mirna-19b 表達(dá)載體和含野生型或突變體的表達(dá)載體和含野生型或突變體的wnt1 啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染入中胚層來(lái)源的基因質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染入中胚層來(lái)源的p19 細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性及及wnt 信號(hào)通路中關(guān)鍵分子信號(hào)通路中關(guān)鍵分子wnt1、gsk3、-catenin 的基因和蛋白表達(dá)水的基因和蛋白表達(dá)水平的變化，揭示平的變化，揭示mirna-19b 對(duì)對(duì)wnt1 的調(diào)控機(jī)制。由

28、于的調(diào)控機(jī)制。由于mirna-19b 致胚胎致胚胎心臟畸形及其機(jī)制研究目前未見(jiàn)報(bào)道，本研究具有源頭創(chuàng)新性。研究若成心臟畸形及其機(jī)制研究目前未見(jiàn)報(bào)道，本研究具有源頭創(chuàng)新性。研究若成功，將為闡明功，將為闡明mirna-19b 致胚胎心臟畸形的機(jī)制提供新的線索，為先天性致胚胎心臟畸形的機(jī)制提供新的線索，為先天性心臟病在妊娠期的早期防治提供新的理論依據(jù)。心臟病在妊娠期的早期防治提供新的理論依據(jù)。寫(xiě)作點(diǎn)評(píng)寫(xiě)作點(diǎn)評(píng)mir-19b致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究致胚胎心臟畸形的機(jī)制研究(限限400字字)：mirnas 在胚胎心臟發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。前期應(yīng)用下在胚胎心臟發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。前期應(yīng)用下一代測(cè)序和

29、一代測(cè)序和mirna芯片篩選均發(fā)現(xiàn)心臟畸形芯片篩選均發(fā)現(xiàn)心臟畸形流產(chǎn)胎兒流產(chǎn)胎兒心臟組織中心臟組織中mir-19b 表達(dá)異常，表達(dá)異常，mir-19b 過(guò)表達(dá)可致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育畸形；生物信息學(xué)分析發(fā)過(guò)表達(dá)可致斑馬魚(yú)心臟發(fā)育畸形；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)現(xiàn)wnt1 為為mir-19b 的靶基因，在心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織中的靶基因，在心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織中wnt1 蛋白蛋白表達(dá)下調(diào)表達(dá)下調(diào), wnt 信號(hào)通路下游蛋白信號(hào)通路下游蛋白gsk3表達(dá)上調(diào)，提示表達(dá)上調(diào)，提示mir-19b 可能通可能通過(guò)影響過(guò)影響wnt 信號(hào)通路致胚胎心臟畸形。本研究擬在體觀察信號(hào)通路致胚胎心臟畸形。本研究擬在體觀察mi

30、rna-19b 致致斑馬魚(yú)胚胎心臟畸形；應(yīng)用基因沉默和過(guò)表達(dá)，論證斑馬魚(yú)胚胎心臟畸形；應(yīng)用基因沉默和過(guò)表達(dá)，論證mirna-19b 影響影響wnt 信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；進(jìn)一步構(gòu)建信號(hào)通路致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；進(jìn)一步構(gòu)建mir-19b 表達(dá)載體和含表達(dá)載體和含野生型或突變體的野生型或突變體的wnt1 啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染入啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染入p19 細(xì)胞，揭示細(xì)胞，揭示mir-19b 對(duì)對(duì)wnt1 的調(diào)控機(jī)制。研究具有源頭創(chuàng)新性，并的調(diào)控機(jī)制。研究具有源頭創(chuàng)新性，并可能闡明可能闡明mir-19b 致胚胎心臟畸形的機(jī)制，為先天性心臟病在胚

31、胎期的早致胚胎心臟畸形的機(jī)制，為先天性心臟病在胚胎期的早期防治提供幫助。期防治提供幫助。 mir-19b是我們應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)、結(jié)合是我們應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)、結(jié)合mirna芯片，篩選芯片，篩選發(fā)現(xiàn)的一條在左心發(fā)育不良流產(chǎn)胚胎心肌組織中表達(dá)顯著上調(diào)的發(fā)現(xiàn)的一條在左心發(fā)育不良流產(chǎn)胚胎心肌組織中表達(dá)顯著上調(diào)的mirna。前期發(fā)現(xiàn)：前期發(fā)現(xiàn)：mir-19b過(guò)表達(dá)可致斑馬魚(yú)出現(xiàn)心臟畸形表型；過(guò)表達(dá)可致斑馬魚(yú)出現(xiàn)心臟畸形表型；生物信息學(xué)預(yù)測(cè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)wnt1是是mir-19b的靶基因，我們則發(fā)現(xiàn)畸形胚胎心的靶基因，我們則發(fā)現(xiàn)畸形胚胎心肌組織中肌組織中wnt信號(hào)通路也明顯受抑（信號(hào)通路也明顯受抑（wn

32、t1表達(dá)下調(diào)、表達(dá)下調(diào)、gsk3表達(dá)上表達(dá)上調(diào)），提示調(diào)），提示mir-19b致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制與致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制與wnt信號(hào)通路有信號(hào)通路有關(guān)。關(guān)。本研究擬：在體觀察本研究擬：在體觀察mir-19b過(guò)表達(dá)、表達(dá)沉默與斑馬魚(yú)胚胎過(guò)表達(dá)、表達(dá)沉默與斑馬魚(yú)胚胎心臟畸形、心臟畸形、wnt信號(hào)通路變化間的關(guān)系；以信號(hào)通路變化間的關(guān)系；以wnt信號(hào)通路為切入點(diǎn)，信號(hào)通路為切入點(diǎn)，結(jié)合嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸技術(shù)和過(guò)表達(dá)技術(shù)，評(píng)判結(jié)合嗎啡啉修飾的反義寡核苷酸技術(shù)和過(guò)表達(dá)技術(shù)，評(píng)判mir-19b致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；采用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，揭示致胚胎心臟發(fā)育畸形的機(jī)制；采用熒光素酶報(bào)告基

33、因技術(shù)，揭示mir-19b對(duì)對(duì)wnt1的分子調(diào)控機(jī)制。的分子調(diào)控機(jī)制。mir-19b致胚胎心臟發(fā)育畸形及致胚胎心臟發(fā)育畸形及機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究有源頭創(chuàng)新性，可為早期先心病的防治機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究有源頭創(chuàng)新性，可為早期先心病的防治提供新線索和潛在的干預(yù)靶標(biāo)。提供新線索和潛在的干預(yù)靶標(biāo)。 立項(xiàng)依據(jù)立項(xiàng)依據(jù) 脊椎動(dòng)物的心臟是胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成并行駛功能的器官，脊椎動(dòng)物的心臟是胚胎發(fā)育過(guò)程中最早形成并行駛功能的器官，其發(fā)生需經(jīng)由多細(xì)胞系特化、管狀結(jié)構(gòu)形成、最后精確組裝成成熟其發(fā)生需經(jīng)由多細(xì)胞系特化、管狀結(jié)構(gòu)形成、最后精確組裝成成熟4個(gè)心腔結(jié)構(gòu)等發(fā)育過(guò)程，需要一系列重要的形態(tài)發(fā)生事件，包

34、括細(xì)個(gè)心腔結(jié)構(gòu)等發(fā)育過(guò)程，需要一系列重要的形態(tài)發(fā)生事件，包括細(xì)胞決定、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化等胞決定、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化等1，其間有多條信號(hào)通路（如，其間有多條信號(hào)通路（如wnt 信號(hào)通路、信號(hào)通路、notch 信號(hào)通路等信號(hào)通路等）參與其發(fā)育調(diào)控）參與其發(fā)育調(diào)控2,3，以保證胚胎心，以保證胚胎心臟形成在時(shí)間和空間的協(xié)調(diào)發(fā)育。由于心臟的血液循環(huán)功能對(duì)脊椎臟形成在時(shí)間和空間的協(xié)調(diào)發(fā)育。由于心臟的血液循環(huán)功能對(duì)脊椎動(dòng)物的生存起關(guān)鍵作用，心臟發(fā)育畸形不但嚴(yán)重影響動(dòng)物生后的宮動(dòng)物的生存起關(guān)鍵作用，心臟發(fā)育畸形不但嚴(yán)重影響動(dòng)物生后的宮外生活質(zhì)量，而且常導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等外生活質(zhì)量，而且常導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎等4，因

35、此有關(guān)胚胎心臟畸形，因此有關(guān)胚胎心臟畸形的研究近年來(lái)受到普遍重視，并已成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病早期防治的研究近年來(lái)受到普遍重視，并已成為預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域疾病早期防治的一個(gè)熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。的一個(gè)熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。 現(xiàn)已知，現(xiàn)已知，mirnas 參與調(diào)控胚胎心臟的發(fā)育，在心肌細(xì)胞的生參與調(diào)控胚胎心臟的發(fā)育，在心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用長(zhǎng)及分化過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用5。已有研究報(bào)道靶向敲除。已有研究報(bào)道靶向敲除特異的特異的mirna 與心臟畸形密切相關(guān)，其中敲除小鼠的與心臟畸形密切相關(guān)，其中敲除小鼠的mirna-1-2 導(dǎo)致導(dǎo)致50%小鼠發(fā)生室間隔缺損而死亡小鼠發(fā)生室間隔缺損而死亡, 存活

36、小鼠解剖發(fā)現(xiàn)心室穿孔存活小鼠解剖發(fā)現(xiàn)心室穿孔6；敲除敲除mirna-133a-1/mirna-133a-2 的小鼠胚胎發(fā)生心臟心室壁變薄的小鼠胚胎發(fā)生心臟心室壁變薄和心室發(fā)育缺陷和心室發(fā)育缺陷7；在敲除斑馬魚(yú)胚胎；在敲除斑馬魚(yú)胚胎mirna-138 的研究中，發(fā)現(xiàn)的研究中，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)心房和心室發(fā)育異常，心肌前體細(xì)胞成熟受阻斑馬魚(yú)心房和心室發(fā)育異常，心肌前體細(xì)胞成熟受阻8。雖然上述。雖然上述與心臟畸形相關(guān)與心臟畸形相關(guān)mirnas 的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前明確的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前明確對(duì)胚胎具有心臟致畸作用的對(duì)胚胎具有心臟致畸作用的mirnas 并不多，因而采用下一代測(cè)序并不多

37、，因而采用下一代測(cè)序或生物芯片等技術(shù)篩選與胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異或生物芯片等技術(shù)篩選與胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異mirnas，對(duì)，對(duì)其表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究顯得尤為重要其表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究顯得尤為重要9。 近年來(lái)，采用下一代測(cè)序或生物芯片等技術(shù)主要用于篩選模式動(dòng)物近年來(lái)，采用下一代測(cè)序或生物芯片等技術(shù)主要用于篩選模式動(dòng)物（斑馬魚(yú)、小鼠）胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異（斑馬魚(yú)、小鼠）胚胎期心臟畸形相關(guān)的差異mirnas，未見(jiàn)文獻(xiàn)對(duì)心臟，未見(jiàn)文獻(xiàn)對(duì)心臟畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織相關(guān)的差異畸形流產(chǎn)胎兒心臟組織相關(guān)的差異mirnas 的篩選研究報(bào)道的篩選研究報(bào)道5。本研究小。本研究小組利用我院產(chǎn)前超聲診斷科對(duì)孕中

38、期胎兒進(jìn)行系統(tǒng)超聲檢查的優(yōu)勢(shì)，收集組利用我院產(chǎn)前超聲診斷科對(duì)孕中期胎兒進(jìn)行系統(tǒng)超聲檢查的優(yōu)勢(shì)，收集到超聲篩查并確診的胎兒左心發(fā)育不良孕婦（孕到超聲篩查并確診的胎兒左心發(fā)育不良孕婦（孕21w）3 例，家屬?gòu)膬?yōu)生例，家屬?gòu)膬?yōu)生優(yōu)育的角度要求流產(chǎn)；同時(shí)收集到未婚先孕來(lái)我院要求流產(chǎn)的同胎齡優(yōu)育的角度要求流產(chǎn)；同時(shí)收集到未婚先孕來(lái)我院要求流產(chǎn)的同胎齡3 例例正常胎兒的孕婦作為對(duì)照（正常胎兒的孕婦作為對(duì)照（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖1 1），征得醫(yī)院倫理委員會(huì)和），征得醫(yī)院倫理委員會(huì)和孕婦家屬的同意，對(duì)孕婦家屬的同意，對(duì)流產(chǎn)胎兒流產(chǎn)胎兒進(jìn)行尸檢并留取胎兒的心臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研進(jìn)行尸檢并留取胎兒的心臟組織進(jìn)

39、行實(shí)驗(yàn)研究。我們?cè)谀戏结t(yī)科大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金究。我們?cè)谀戏结t(yī)科大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金（ m i r n a 在 胎 兒 先 天 性 心 臟 病 中 的 差 異 表 達(dá) 研 究 ， 項(xiàng) 目 號(hào) ：在 胎 兒 先 天 性 心 臟 病 中 的 差 異 表 達(dá) 研 究 ， 項(xiàng) 目 號(hào) ：nfykdx2010012，2010.12011.12，在研，在研）的資助下，同時(shí)應(yīng)用下一代）的資助下，同時(shí)應(yīng)用下一代測(cè)序和生物芯片技術(shù)對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織的測(cè)序和生物芯片技術(shù)對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織的mirna 表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜進(jìn)行分

40、析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)8 個(gè)個(gè)mirna 在左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟在左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織與正常對(duì)照之間存在組織與正常對(duì)照之間存在3 倍以上的差異表達(dá)，并和倍以上的差異表達(dá)，并和real-time pcr 驗(yàn)證驗(yàn)證的結(jié)果一致（的結(jié)果一致（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖26）。其中）。其中mirna-19b 在進(jìn)化上高度保守在進(jìn)化上高度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中表見(jiàn)工作基礎(chǔ)中表1）；在斑馬魚(yú)、犬、人的胚胎心臟發(fā)育早期及生后均）；在斑馬魚(yú)、犬、人的胚胎心臟發(fā)育早期及生后均有表達(dá)有表達(dá)11,12；已有研究應(yīng)用；已有研究應(yīng)用mirna 芯片篩選成人擴(kuò)張性心肌病人心臟組芯片篩選成人擴(kuò)張性心肌病人心臟組織發(fā)現(xiàn)織發(fā)現(xiàn)

41、mirna-19b 表達(dá)異常的報(bào)道表達(dá)異常的報(bào)道10；結(jié)合我們發(fā)現(xiàn)；結(jié)合我們發(fā)現(xiàn)mirna-19b 在孕中在孕中期左心發(fā)育不良胎兒心臟組織中表達(dá)明顯上調(diào)，提示期左心發(fā)育不良胎兒心臟組織中表達(dá)明顯上調(diào)，提示mirna-19b在心臟在心臟發(fā)育早期起到重要的作用。我們采用體外合成發(fā)育早期起到重要的作用。我們采用體外合成mirna-19b 前體顯微注射前體顯微注射入斑馬魚(yú)受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精后入斑馬魚(yú)受精卵，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受精后72 h 斑馬魚(yú)心臟擴(kuò)大，心肌管未能環(huán)斑馬魚(yú)心臟擴(kuò)大，心肌管未能環(huán)化，提示胚胎期化，提示胚胎期mirna-19b 過(guò)表達(dá)可致胚胎心臟畸形（過(guò)表達(dá)可致胚胎心臟畸形（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖見(jiàn)工作

42、基礎(chǔ)中圖7）。鑒于）。鑒于mirna-19b 致胚胎心臟畸形及其機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道，因此有必致胚胎心臟畸形及其機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道，因此有必要開(kāi)展在體實(shí)驗(yàn)研究，并深入探討其機(jī)制。要開(kāi)展在體實(shí)驗(yàn)研究，并深入探討其機(jī)制。 前期研究中，本研究小組在南方醫(yī)科大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究中，本研究小組在南方醫(yī)科大學(xué)生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金開(kāi)放研究基金mirna 在胎兒先天性心臟病中的差異表達(dá)研究，項(xiàng)目號(hào)：在胎兒先天性心臟病中的差異表達(dá)研究，項(xiàng)目號(hào)：nfykdx 2009012，醫(yī)學(xué)倫理號(hào)：粵婦倫字醫(yī)學(xué)倫理號(hào)：粵婦倫字( 2009) 3 號(hào)號(hào) 的資助下，以孕的資助下，以孕21 周超聲診斷為左

43、心發(fā)育不良、自然流產(chǎn)的周超聲診斷為左心發(fā)育不良、自然流產(chǎn)的胚胎樣本為胚胎樣本為研究對(duì)象，采用下研究對(duì)象，采用下一代測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物芯片的應(yīng)用，以兩種高通量技術(shù)同時(shí)篩選左心發(fā)一代測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物芯片的應(yīng)用，以兩種高通量技術(shù)同時(shí)篩選左心發(fā)育不良胚胎心臟中的差異育不良胚胎心臟中的差異mirnas，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種高通量篩選數(shù)據(jù)中同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種高通量篩選數(shù)據(jù)中同時(shí)出現(xiàn)的、時(shí)出現(xiàn)的、3 倍以上的差異倍以上的差異mirnas 8 個(gè)，且個(gè)，且real-time pcr 驗(yàn)證結(jié)果與其驗(yàn)證結(jié)果與其初篩結(jié)果基本一致（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖初篩結(jié)果基本一致（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖18）。其中，）。其中，人人mir-19b

44、差異高表達(dá)差異高表達(dá)于孕中期左心發(fā)育不良胚胎心臟組織中，且因：于孕中期左心發(fā)育不良胚胎心臟組織中，且因：該該mirna 在進(jìn)化上高度在進(jìn)化上高度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中表保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中表1）；）；斑馬魚(yú)、犬等多種生物的胚胎心臟中該斑馬魚(yú)、犬等多種生物的胚胎心臟中該mirna 均有表達(dá)均有表達(dá)10,11；mirna芯片篩選研究發(fā)現(xiàn)，成人擴(kuò)張性心肌病芯片篩選研究發(fā)現(xiàn)，成人擴(kuò)張性心肌病患者心肌重構(gòu)的心肌組織中患者心肌重構(gòu)的心肌組織中mir-19b 異常表達(dá)異常表達(dá) 12 ，均提示，均提示mir-19b 在心臟在心臟發(fā)育早期可能具有重要作用，而引起本研究小組的關(guān)注。發(fā)育早期可能具有重要作用，而引起本研究

45、小組的關(guān)注。 鑒于斑馬魚(yú)是一種新興的模式生物，不但胚胎小，而且擁有并不完全鑒于斑馬魚(yú)是一種新興的模式生物，不但胚胎小，而且擁有并不完全依賴心血管系統(tǒng)生存的生命特征（即使整個(gè)心血管系統(tǒng)缺失，也能通過(guò)氧依賴心血管系統(tǒng)生存的生命特征（即使整個(gè)心血管系統(tǒng)缺失，也能通過(guò)氧的被動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制而生存，并繼續(xù)發(fā)育一段時(shí)間），能為心臟發(fā)育研究提供的被動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制而生存，并繼續(xù)發(fā)育一段時(shí)間），能為心臟發(fā)育研究提供極為有利的條件，是活體評(píng)估心臟發(fā)育相關(guān)基因功能的常用技術(shù)平臺(tái)極為有利的條件，是活體評(píng)估心臟發(fā)育相關(guān)基因功能的常用技術(shù)平臺(tái)13，因此，我們首先體外合成用于人因此，我們首先體外合成用于人mir-19b 過(guò)表達(dá)研究的

46、過(guò)表達(dá)研究的mir-19b 前體前體（mirna-19b precursor，pre-mir-19b），顯微注射入斑馬魚(yú)受精卵，來(lái)），顯微注射入斑馬魚(yú)受精卵，來(lái)評(píng)估評(píng)估m(xù)ir-19b 在胚胎心臟發(fā)育中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)在胚胎心臟發(fā)育中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)mir-19b 導(dǎo)致導(dǎo)致斑馬魚(yú)出現(xiàn)心包水腫，心臟環(huán)化不完全，心房、心室結(jié)構(gòu)異常（見(jiàn)工作基斑馬魚(yú)出現(xiàn)心包水腫，心臟環(huán)化不完全，心房、心室結(jié)構(gòu)異常（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖礎(chǔ)中圖9），初步獲得了），初步獲得了mir-19b 致胚胎心臟發(fā)育畸形的形態(tài)學(xué)依據(jù)。由于致胚胎心臟發(fā)育畸形的形態(tài)學(xué)依據(jù)。由于mir-19b 致胚胎心臟畸形及其機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)

47、報(bào)道，致胚胎心臟畸形及其機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道，因此進(jìn)一步論因此進(jìn)一步論證證mir-19b 與心臟發(fā)育畸形之間的關(guān)系、深入分析其分子調(diào)控機(jī)制就顯得與心臟發(fā)育畸形之間的關(guān)系、深入分析其分子調(diào)控機(jī)制就顯得十分必要。十分必要。 現(xiàn)已知，心臟起源于中胚層，其胚胎時(shí)期的發(fā)生發(fā)育主要受現(xiàn)已知，心臟起源于中胚層，其胚胎時(shí)期的發(fā)生發(fā)育主要受wnt 信號(hào)信號(hào)通路通路2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）信號(hào)通路）信號(hào)通路13、notch 信號(hào)通路信號(hào)通路3等調(diào)控。其中，等調(diào)控。其中，雖然雖然bmp 信號(hào)通路與信號(hào)通路與notch 信號(hào)通信號(hào)通路在胚

48、胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但均需通過(guò)路在胚胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但均需通過(guò)wnt 信號(hào)通路來(lái)完信號(hào)通路來(lái)完成心肌細(xì)胞的特化，提示成心肌細(xì)胞的特化，提示wnt 信號(hào)通路在胚胎心臟發(fā)育中的重要作用。信號(hào)通路在胚胎心臟發(fā)育中的重要作用。經(jīng)經(jīng)典的典的wnt 信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程2，配，配體體wnt1 蛋白是其激動(dòng)分子，當(dāng)配體蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白（蛋白是其激動(dòng)分子，當(dāng)配體蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白（frizzled）家族的七次跨膜受體結(jié)合后，能夠通過(guò)激活胞質(zhì)中家族的七次跨膜受體結(jié)合后，能夠通過(guò)激活胞質(zhì)中dsh（

49、dishevelled）蛋）蛋白，抑制白，抑制gsk3（glycogen synthase kinase 3）的磷酸激酶活性，拮抗）的磷酸激酶活性，拮抗-連環(huán)蛋白（連環(huán)蛋白（-catenin）的降解，使其在胞質(zhì)中大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)）的降解，使其在胞質(zhì)中大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合合tcf/lef 家族的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活下游不同靶基因如家族的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活下游不同靶基因如cyclin d 等，呈等，呈現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)2。因此，經(jīng)典的。因此，經(jīng)典的wnt 信號(hào)通路中，信號(hào)通路中，wnt1 是該信號(hào)通路是該信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，的啟動(dòng)因子，gsk3是其功能的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，而是其功能的

50、調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，而-catenin 則是其功能的執(zhí)則是其功能的執(zhí)行者。行者。 我們通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)我們通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)mirna-19b 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)14，發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)wnt 信信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白wnt1 為其潛在靶基因，兩者的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上高為其潛在靶基因，兩者的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上高度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖度保守（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖8）；本研究小組前期對(duì)孕鼠子代心臟發(fā)育異常的）；本研究小組前期對(duì)孕鼠子代心臟發(fā)育異常的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)孕鼠子代心臟畸形與實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)孕鼠子代心臟畸形與wnt 信號(hào)通路密切相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)15，因而我，因而我們聯(lián)想到是否們聯(lián)想到

51、是否wnt 信號(hào)通路也在信號(hào)通路也在mirna-19b 致胚胎心臟畸形中起到重要的致胚胎心臟畸形中起到重要的作用。我們進(jìn)一步對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織中作用。我們進(jìn)一步對(duì)孕中期左心發(fā)育不良流產(chǎn)胎兒心臟組織中wnt 信號(hào)通路信號(hào)通路中關(guān)鍵分子（中關(guān)鍵分子（wnt1、gsk3、-catenin）的蛋白和基因水平進(jìn)行研究，發(fā)）的蛋白和基因水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)-catenin 表達(dá)下調(diào)，表達(dá)下調(diào)， gsk3 表達(dá)上調(diào)，兩者表達(dá)上調(diào)，兩者mrna 和蛋白水平的變化幅和蛋白水平的變化幅度一致；而度一致；而wnt1 mrna 表達(dá)不變，蛋白表達(dá)水平下調(diào)（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖表達(dá)不變，蛋白表達(dá)水平下調(diào)（見(jiàn)

52、工作基礎(chǔ)中圖9），提示），提示wnt 信號(hào)通路在信號(hào)通路在mirna-19b 致胚胎心臟畸形中起作用，致胚胎心臟畸形中起作用，wnt1 可可能和能和mirna-19b 直接結(jié)合，抑制直接結(jié)合，抑制wnt1 的翻譯，但不影響其轉(zhuǎn)錄，這和的翻譯，但不影響其轉(zhuǎn)錄，這和mirna 通過(guò)堿基配對(duì)方式結(jié)合靶基因通過(guò)堿基配對(duì)方式結(jié)合靶基因mrna 的的3utr，導(dǎo)致靶基因的翻譯，導(dǎo)致靶基因的翻譯受抑制，但不影響其轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)是一致的受抑制，但不影響其轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)是一致的16，但這并不能作為，但這并不能作為mirna-19b 與與wnt1 直接作用的證據(jù)，為了確認(rèn)直接作用的證據(jù)，為了確認(rèn)wnt1 是是mirna-

53、19b 的直接靶位點(diǎn)，可的直接靶位點(diǎn)，可以采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行鑒定以采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行鑒定17。前期通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)。前期通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)wnt1 啟動(dòng)子的一段堿基序列啟動(dòng)子的一段堿基序列“uuugcac”和和mirna-19b上的保守序列上的保守序列“aaacgug”互補(bǔ)結(jié)合（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖互補(bǔ)結(jié)合（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖8），這可用于進(jìn)行熒光素酶報(bào)），這可用于進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)揭示告基因?qū)嶒?yàn)揭示mirna-19b 是否通過(guò)這個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)直接結(jié)合靶基因是否通過(guò)這個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)直接結(jié)合靶基因wnt1，進(jìn)而調(diào)控進(jìn)而調(diào)控wnt 信號(hào)通路。信號(hào)通路。 為探索為探索mir-19b

54、 致胚胎心臟畸形的可能機(jī)制，尋找深入研究的有用線致胚胎心臟畸形的可能機(jī)制，尋找深入研究的有用線索索，我們進(jìn)一步采用生物信息學(xué)分析的方法，來(lái)預(yù)測(cè)，我們進(jìn)一步采用生物信息學(xué)分析的方法，來(lái)預(yù)測(cè)mir-19b 可能的下游可能的下游靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，wnt 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白wnt1 為其潛在的作用靶點(diǎn)，為其潛在的作用靶點(diǎn)，且且mir-19b 與靶基因與靶基因wnt1 的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上也高度保守、同源性達(dá)的互補(bǔ)結(jié)合序列在進(jìn)化上也高度保守、同源性達(dá)100%（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖10）。由于：）。由于：心臟起源于中胚層，其胚胎時(shí)期的心臟起源于中胚層，其胚胎

55、時(shí)期的發(fā)生發(fā)育主要受發(fā)生發(fā)育主要受wnt、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）、）、notch 等信號(hào)通路的調(diào)控等信號(hào)通路的調(diào)控2-3, 14，bmp、notch 信號(hào)通路盡管在胚信號(hào)通路盡管在胚胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但均需通過(guò)胎心臟早期發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但均需通過(guò)wnt 信號(hào)通路來(lái)完成心肌信號(hào)通路來(lái)完成心肌細(xì)胞的特化，提示了細(xì)胞的特化，提示了wnt 信號(hào)通路在胚胎心臟發(fā)育中的重要性；信號(hào)通路在胚胎心臟發(fā)育中的重要性；本研究本研究小組在先前國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目號(hào)小組在先前國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目號(hào)30672245）資助下

56、，開(kāi)展孕期葉酸）資助下，開(kāi)展孕期葉酸缺乏影響子代心臟發(fā)育的機(jī)制研究時(shí)，也證實(shí)了缺乏影響子代心臟發(fā)育的機(jī)制研究時(shí)，也證實(shí)了wnt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常與信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常與胚胎心臟發(fā)育畸形之間的密切關(guān)系胚胎心臟發(fā)育畸形之間的密切關(guān)系 15，因此我們?cè)O(shè)想因此我們?cè)O(shè)想mir-19b 可能通過(guò)調(diào)可能通過(guò)調(diào)控在種系進(jìn)化上高度保守、在心臟發(fā)育早期極為重要的控在種系進(jìn)化上高度保守、在心臟發(fā)育早期極為重要的wnt1 而發(fā)揮作用，而發(fā)揮作用，以以wnt 信號(hào)途徑為機(jī)制研究的切入點(diǎn)，有可能幫助我們揭示信號(hào)途徑為機(jī)制研究的切入點(diǎn)，有可能幫助我們揭示mir-19b 致胚致胚胎心臟畸形的分子機(jī)制。胎心臟畸形的分子機(jī)制。 現(xiàn)已

57、知，現(xiàn)已知，經(jīng)典的經(jīng)典的wnt 信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞增殖及凋亡信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞命運(yùn)、細(xì)胞增殖及凋亡等過(guò)程等過(guò)程2，配體配體wnt1 蛋白是其激動(dòng)分子，當(dāng)配體蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白蛋白是其激動(dòng)分子，當(dāng)配體蛋白與細(xì)胞表面卷曲蛋白（frizzled）家族的七次跨膜受體結(jié)合后，能夠通過(guò)激活胞質(zhì)中）家族的七次跨膜受體結(jié)合后，能夠通過(guò)激活胞質(zhì)中dsh（dishevelled）蛋白，抑制）蛋白，抑制gsk3（ glycogen synthase kinase 3）的磷酸激）的磷酸激酶活性，拮抗酶活性，拮抗-連環(huán)蛋白（連環(huán)蛋白（-catenin）的降解，使其在胞質(zhì)中大量聚集，并）的降解，

58、使其在胞質(zhì)中大量聚集，并進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)2。因此，經(jīng)典的。因此，經(jīng)典的wnt 信號(hào)通路中，信號(hào)通路中，wnt1 是是該信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，該信號(hào)通路的啟動(dòng)因子，gsk3 是其功能的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，而是其功能的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)，而-catenin 則是其則是其功能的執(zhí)行者。據(jù)此，功能的執(zhí)行者。據(jù)此，我們以孕中期左心發(fā)育不良胚胎心臟組織為檢測(cè)樣本，我們以孕中期左心發(fā)育不良胚胎心臟組織為檢測(cè)樣本，采用采用real time pcr、western blot 技術(shù)，檢測(cè)了技術(shù)，檢測(cè)了wnt 信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵分子（分子（wnt1、gsk3、-catenin）的基

59、因、蛋白表達(dá)水平變化。）的基因、蛋白表達(dá)水平變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕中期左心發(fā)育不良胚胎心肌組織中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕中期左心發(fā)育不良胚胎心肌組織中wnt1、-catenin 基因基因與蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，與蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，gsk3基因與蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)，提示左心發(fā)基因與蛋白的表達(dá)則顯著上調(diào)，提示左心發(fā)育不良胚胎心肌組織中存在育不良胚胎心肌組織中存在wnt 信號(hào)通路明顯受抑的現(xiàn)象。其中，信號(hào)通路明顯受抑的現(xiàn)象。其中，gsk3、-catenin 在基因、蛋白表達(dá)水平的變化幅度基本一致，在基因、蛋白表達(dá)水平的變化幅度基本一致，wnt1 基因、蛋白表基因、蛋白表達(dá)水平的變化幅度則不一致，左心發(fā)育不良胚胎

60、心肌組織中達(dá)水平的變化幅度則不一致，左心發(fā)育不良胚胎心肌組織中wnt1 蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)下調(diào)的程度更高（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖下調(diào)的程度更高（見(jiàn)工作基礎(chǔ)中圖11），符合我們的預(yù)期，此與），符合我們的預(yù)期，此與mirna與與靶基因特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)后主要抑制其蛋白翻譯、不抑制其轉(zhuǎn)錄等特點(diǎn)相靶基因特異性堿基互補(bǔ)配對(duì)后主要抑制其蛋白翻譯、不抑制其轉(zhuǎn)錄等特點(diǎn)相一致一致16。該研究結(jié)果提示，。該研究結(jié)果提示，wnt1 可能不僅僅是可能不僅僅是mir-19b 調(diào)控的下游靶基因，調(diào)控的下游靶基因，而且而且mir-19b 在致胚胎心臟發(fā)育畸形中的作用極可能通過(guò)影響在致胚胎心臟發(fā)育畸形中的作用極可能通過(guò)影響wnt 信號(hào)