海島棉乙烯響應(yīng)因子GbERF1-like在抗黃萎病反應(yīng)中的功能解析

1、海島棉乙烯響應(yīng)因子 GbERF1-like 在抗黃萎病反響中的功能解析棉花黃萎病是影響棉花生產(chǎn)的主要病害 , 乙烯信號(hào)路徑在棉花與黃萎病菌的 互作中扮演著重要的角色。明確乙烯在棉花抗黃萎病反響中的調(diào)節(jié)機(jī)制, 并調(diào)控乙烯信號(hào)路徑來(lái)改進(jìn)棉花的抗病性對(duì)棉花抗病育種和生產(chǎn)具有重要意義。本研究從海島棉品種"7124"中克隆了乙烯信號(hào)路徑的一個(gè) ERFs類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子 基因 GbERF1-like, 并對(duì)其在棉花抗黃萎病反響中的作用機(jī)制開(kāi)展了研究 ,取得 的主要結(jié)果有：1、克隆了 GbERF1-like的全長(zhǎng)序列,其ORFF!為537 bp,編碼179 個(gè)氨基酸的多肽，含有一個(gè)59個(gè)氨基酸

2、的ERFs類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。 序列聚類(lèi)顯示 GbERF1-like 與 GhERF1(AY181251.1), GhERF8(JN656957.1), TbERF (XM₀07035031.1 , GbERF5 (JN003808.1 )和 AtERF1(AB008103具有較高的同源性。表達(dá)分析顯示 GbERF1-like 在棉花的不同組織都有表達(dá) ,并能快速響應(yīng) ET、MeJA處理。相對(duì)于感病的陸地棉,GbERF1-like在抗病的海島棉接種黃萎病菌 "V991 后上調(diào)表達(dá)迅速 , 并且持續(xù)的時(shí)間長(zhǎng)。2、通過(guò)農(nóng)桿菌介

3、導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了 GbERF1-like 在棉花中的超量表達(dá)系COV20 C0V5t抑制表達(dá)系 Ci8、Ci6,以及GbERF1-like在擬南芥中的超量表達(dá) 純系A(chǔ)OV12 AOV5接種鑒定分析說(shuō)明,GbERF1-like的超量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因棉 花和擬南芥的抗病性 , 而抑制 GbERF1-like 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花抗病性降低?；虮磉_(dá)分析說(shuō)明GbERF1-like在棉花中能正調(diào)控PR3 PR4的表達(dá),負(fù)調(diào)控PR1 PR5的表達(dá)。但在擬南芥中 GbERF1-like能促進(jìn) AtPR3 AtPR4及AtPDF1.2 的表達(dá)，但抑制AtPR2的表達(dá)。此外, 表達(dá)分析還顯示木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基

4、因表達(dá)受 GbERF1-like 表達(dá)水 平的影響，GhPAL5 GhC4H1 GhC3H、1 GhHCT、GhCCoAOMT和 GhF5H2等基因在GbERF1-like 超量表達(dá)棉花中表達(dá)上升 , 而在其抑制轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)量下降。類(lèi) 似的結(jié)果在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn) , 這暗示 GbERF1-like 可能在植物中參與木質(zhì)素合 成的調(diào)控。此外,與Mock相比，接種黃萎病菌后GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花、擬南芥中木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)更為顯著。用Wiesner方法對(duì)棉花莖的木質(zhì)素染色結(jié)果顯示,Mock處理及"V991 處理后的各棉花材料均可被染為 紅色,所有接種處

5、理的著色明顯比 Mock深。在Mock處理的各材料間,GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花染色最深,而GbERF1-like 抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花染色最淺。 木質(zhì)素總量測(cè)定與染色結(jié)果相符 接菌處理后,WT轉(zhuǎn)基因系莖的木質(zhì)素總量均比 Mock處理對(duì)應(yīng)材料顯著增加。在Mock及"V991 接種處理后,GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花、擬南芥中木質(zhì)素總量分別比 WT增加6.9%-44.3%,而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花中木質(zhì)素總量比 WT降低13.2%-23.4%。木質(zhì)素單體測(cè)定說(shuō)明,與Mock相比, 各材料的G和S單體在接菌后都增加。在Mock及"

6、;V991 接種處理后,棉花G單體含量在超表達(dá)材料中比 WT高但沒(méi)有到達(dá)顯著水平,RNAi系的G單體含量比 WT1著降低,在5.9%-12.4%之間。轉(zhuǎn)基 因擬南芥與 WT相比,G單體含量增加幅度在11.2%-31.6%之間。各棉花材料的S單體含量在兩種處理中，超表達(dá)材料含量較野生型增加10.8%-33.6%,而抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系下降，降低了 7.4%-12.9%。擬南芥的S單體 增加不明顯。3、分析顯示GhHCT和 AtPAL3兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列均含有 TAAT-boxCAAT-box及GCCGCC-bd的ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。利用酵母單雜交分析說(shuō)明GbERF1-like與GhHC

7、T和AtPAL3的啟動(dòng)子之間存在互作。利用雙分子熒光檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí) GbERF1-like 在棉花原生質(zhì)體中可以結(jié)合GhHCT和AtPAL3基因的啟動(dòng)子，并提高這兩個(gè)木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性。 以上結(jié)果證明 GbERF1-like 直接參與了棉花及擬南芥的木質(zhì)素合成調(diào)控。4、為了進(jìn)一步證明 GbERF1-like 介導(dǎo)的棉花抗黃萎病增強(qiáng)與木質(zhì)素合成激活有關(guān), 我們利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對(duì) GbERF1-like 超量表達(dá)棉花材料 COV2沖的GhHCT進(jìn)行了抑制。分子檢測(cè)、接種鑒定及木質(zhì)素含量測(cè)定說(shuō)明，在抑制GhHCT俵達(dá)后,GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料的抗病性明顯降低，其莖

8、部 木質(zhì)素含量減少。同時(shí)木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)均受到影響 , 木質(zhì)素合成上游基因 , 如GhPAL1 (Gbscaffold40957.1 )、GhPAL5 (Gbscaffold11559.9 )、GhC4H(Gbscaffold12103.1 )普遍表現(xiàn)為表達(dá)量降低 ,而木質(zhì)素合成下游的基因那么普遍 表現(xiàn)為表達(dá)水平上升 , 如 GhCCR(Gbscaffold2152.13 ) , GhCAD(Gorai.009G192400.1 ) , GhFSH (Gbscaffold12698.2 )和 GhCOMT (Gorai.004G125600.1 )。以上結(jié)果證明木質(zhì)素合成增強(qiáng)在 GbERF1-like 介導(dǎo)的 棉花抗黃萎病反響中具有重要作用。5、通過(guò)酵母雙雜交篩選鑒定到局部與 GbERF1-like 互作的蛋白因子。局部因子為前期己報(bào)道參與棉花抗病反響的蛋白,如MAPK, MLP, DIRIGENT(Cai et al.,2021;Yang et al.,2021;