構(gòu)巢曲霉高親和性鈣離子吸收系統(tǒng)參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的機(jī)制研究

1、構(gòu)巢曲霉高親和性鈣離子吸收系統(tǒng)參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的機(jī)制研究曲霉屬在全球共有上百類不同的霉菌種類 , 它包含了以黑曲霉、米曲霉為代 表的具有經(jīng)濟(jì)效益的工業(yè)曲霉 , 還有一類是與侵染性真菌感染相關(guān)的煙曲霉、黃 曲霉等病原曲霉。由于構(gòu)巢曲霉和工業(yè)真菌、病原真菌有著較近的親緣關(guān)系 , 另 外它作為絲狀真菌的模式生物 , 有其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) ,可作為研究極性生長(zhǎng)和產(chǎn) 孢等方面的優(yōu)良材料。以鈣離子介導(dǎo)的信號(hào)通路 (Ca2+signaling pathway) 廣泛地參與了真核生物 中的各種生理活動(dòng)過(guò)程 , 包括生長(zhǎng)發(fā)育、胞吐、細(xì)胞骨架的重排、肌肉收縮、趨 化性、細(xì)胞分裂、分化、程序性細(xì)胞死亡等 ,在酵母中

2、,也發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮了 重要作用。構(gòu)巢曲霉雖然與酵母親緣關(guān)系相近 , 但絲狀真菌有其生長(zhǎng)所獨(dú)特的功 能, 更適用于研究與真菌的侵染力和致病性密切相關(guān)的極性生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的功能基 因, 本課題就以此為切入點(diǎn)展開(kāi)深入研究。在真菌中存在兩大類不同的鈣離子吸收系統(tǒng) , 即高親和性鈣離子吸收系統(tǒng) (HACS和低親和性鈣離子吸收系統(tǒng)(LACS),其中高親和性鈣離子吸收系統(tǒng)由 CchA和MidA兩個(gè)主要組分構(gòu)成,當(dāng)胞外鈣離子可獲得性比擬低時(shí),高親和性鈣離 子吸收系統(tǒng)就作為主要的鈣離子進(jìn)入通道而發(fā)揮作用 , 反之當(dāng)胞外鈣離子濃度升 高后那么由低親和性鈣離子吸收系統(tǒng)來(lái)行使該功能。 本課題通過(guò)基因定點(diǎn)敲除技術(shù)、 乙

3、醇脫氫酶啟動(dòng)子 (alcA promoter) 替換技術(shù)分別構(gòu)建了敲除菌株和可調(diào)控菌株 來(lái)研究CchA和MidA在構(gòu)巢曲霉中的功能和特征。在低鈣的根底培養(yǎng)基上，當(dāng)關(guān)閉CchA MidA的表達(dá)時(shí)，可調(diào)控菌株和敲除菌 株的表型是完全-致的,它們?cè)诟着囵B(yǎng)基MMPD上均表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)抱缺陷，另外,比擬有趣地是 , 我們發(fā)現(xiàn)突變株的產(chǎn)孢缺陷表型與其接種量有一定的關(guān)系 ,接種量越高病態(tài)表型越明顯 , 由于突變菌株在菌落上表達(dá)出產(chǎn)孢缺陷 ,為了進(jìn)一步 觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異 , 我們通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡更清晰直觀地展示了 突變菌株于野生型在分生孢子梗和分生孢子數(shù)量上的差異 , 但這種產(chǎn)孢缺陷可以 通過(guò)

4、在胞外添加鈣離子和滲透逆境而得到改善；CchA、MidA 的缺失不僅會(huì)影響菌株的產(chǎn)孢功能 , 而且也會(huì)造成突變菌株的菌絲極性生長(zhǎng)喪失 , 頂端菌絲膨脹突 起,再者, 突變菌株在菌絲延伸的過(guò)程中不時(shí)地出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)和多級(jí)分枝, 這與野生型菌株在相同的培養(yǎng)調(diào)節(jié)下的線性生長(zhǎng)是有很大區(qū)別的；另外 , 我們還發(fā)現(xiàn)突 變菌株表達(dá)出對(duì)細(xì)胞壁抑制劑的相對(duì)抗性 , 且細(xì)胞壁的主要組分幾丁質(zhì)和葡聚糖 的含量均有所增加 , 該結(jié)果也與流式細(xì)胞儀上檢測(cè)到葡聚糖含量增加的情況是一 致的。以上現(xiàn)象均說(shuō)明： CchA、 MidA 參與了菌絲主軸極性生長(zhǎng)、產(chǎn)孢以及細(xì)胞 壁的完整性等多方面的生理活動(dòng)并發(fā)揮了重要的作用。與此同時(shí),

5、我們還發(fā)現(xiàn)CchA MidA單敲和雙敲菌株在以上方面均表現(xiàn)出類似 的表型,這也就提示我們CchA和MidA在構(gòu)巢曲霉中可能是以復(fù)合體的形式存在， 并共同行使作用 ,通過(guò)酵母雙雜交的陽(yáng)性結(jié)果又進(jìn)一步為該結(jié)論提供了強(qiáng)有力的 依據(jù)。接下來(lái),為了對(duì)鈣信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行深入研究 ,我們把目標(biāo)鎖定在了其下游蛋白 鈣調(diào)磷酸酶 (Calcineurin), 之前研究說(shuō)明鈣調(diào)磷酸酶是鈣信號(hào)通路中的樞紐蛋 白,于是我們就對(duì)Calcineurin和鈣離子通道蛋白CchA在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的相互 調(diào)節(jié)關(guān)系展開(kāi)研究。我們發(fā)現(xiàn)在正常的生長(zhǎng)狀態(tài)下,Calcineurin 和CchA的雙敲菌株加成了各自 單敲菌株的缺陷表型,而在應(yīng)答

6、離子逆境脅時(shí),在Calcineurin單敲菌株的菌絲極性生長(zhǎng)沒(méi)有得到恢復(fù)的情況下,Calcineurin與CchA的雙敲菌株的極性生長(zhǎng)反 而得到了明顯的恢復(fù) , 這說(shuō)明在不受到任何脅迫的刺激下 ,Calcineurin 和 CchA不是簡(jiǎn)單的上下游關(guān)系,除了 CchA是Calcineurin的上游外,還有在其他平行通 路方面有各自獨(dú)特的功能 ,但在應(yīng)答離子滲透逆境脅迫時(shí) ,Calcineurin 和 CchA 那么表達(dá)出反向調(diào)節(jié)的作用。綜上所述 , 本課題以構(gòu)巢曲霉模式生物為研究對(duì)象 , 系統(tǒng)研究了高親和性鈣離子吸收系統(tǒng)及鈣調(diào)磷酸酶 Calcineurin 在共同調(diào)節(jié)曲 霉形態(tài)建成中的功能 , 具體描述了高親和性鈣離子吸收系統(tǒng)在真菌極性生長(zhǎng)、產(chǎn) 抱和細(xì)胞壁完整方面所發(fā)揮的功能以及鈣離子通道CchA和 Calcineurin 生離子鹽逆境等條件下對(duì)極性生長(zhǎng)的相互調(diào)節(jié)作用以及相應(yīng)的作用機(jī)理 , 這不僅為探索 鈣信號(hào)系統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)功能提供理論知識(shí) ,也可