2022年蛋白組學(xué)研究高異黃酮抑制A549細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)

1、蛋白組學(xué)討論高異黃酮抑制 a549細(xì)胞增殖的靶點(diǎn) 基金項(xiàng)目 黑龍江省齊齊哈爾市科技攻關(guān)項(xiàng)目 no.sfgg-202114 通訊作者 * 寧德利，博士，講師，從事生物化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)討論摘要：目的： 以肺癌 a549 細(xì)胞為討論對(duì)象，探討高異黃酮對(duì)a549 細(xì)胞作用的蛋白靶點(diǎn)；方法： 從玉竹中提取高異黃酮并作用于肺癌細(xì)胞a549； mtt比色法觀看不同濃度高異黃酮作用于 a549 細(xì)胞的結(jié)果；通過 2-ed 分析差異蛋白； 結(jié)果： 與空白對(duì)比比較，高異黃酮呈劑量和時(shí)間依靠性抑制a549 細(xì)胞的增殖，并發(fā)覺32 個(gè)點(diǎn)發(fā)生了可重復(fù)性變化；在變化點(diǎn)中有 5 個(gè)蛋白為候選有意義蛋白； 結(jié)論： 5 個(gè)靶點(diǎn)

2、蛋白（ peroxiredoxin 2, hsp 70variant 2, mitochondrial receptor subunit, heat shock cognate 71 kda protein, p38 kinase ）與細(xì)胞的凋亡有關(guān)；關(guān)鍵詞：高異黃酮； a549細(xì)胞； 2-ed非小細(xì)胞肺癌 nsclc是常見的癌癥之一；高異黃酮類化合物取自中草藥玉竹，具有抗血管生成、免疫調(diào)劑和抗腫瘤作用等多種活性，但抗腫瘤的詳細(xì)靶點(diǎn)尚未可知；蛋白質(zhì)組學(xué)可以鑒定腫瘤發(fā)生和治療過程中靶點(diǎn)蛋白，可為進(jìn)一步的診斷及治療供應(yīng)試驗(yàn)依據(jù)；1.材料1.1 細(xì)胞株a549 細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科高?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中

3、心，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)；1.2 藥物及試劑玉竹藥材購自黑龍江省齊齊哈爾市康盛飲片廠；玉竹藥材粉碎，經(jīng)前期工作后，半制備液相色譜分別，得到高異黃酮類化合物單體； 試劑： acrylamide 、bis-acrylamide、urea、thio urea 、 -mercaptoethanol、teme、d edta-na、chap、spms、fdtt、sodium thiosulfate均購自美國 sigma 公司；1.3 儀器 等電聚焦電泳系統(tǒng) ettanipgphor3，美國 ge公司 、垂直電泳系統(tǒng)ettandaltsix，美國 ge公司 、mcv-13161ft型超凈臺(tái) 日本 san

4、yo公司 ，5417r型離心機(jī) 德國 eppendorf 公司 ；2 方法-12.1 mtt法觀看細(xì)胞抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 a549 細(xì)胞制成 1.0 ×104 個(gè)· ml-1 的細(xì)胞懸液接種于 96 孔板costar 公司 中，置于 37， 5% co2 培育箱中培育； 24 h 貼壁后， dmso為對(duì)比組，高異黃酮藥物干預(yù)組各加入濃度為12.5 、25、50、100 mg·l 的單體 0.08 ml，培育 6、12、24h 后，每孔加入新奇配制的質(zhì)量濃度為5 g ·l-1 的 mtt 0.02 ml ，37 細(xì)胞培育箱中連續(xù)培育 4 h ；吸棄孔內(nèi)上

5、清液，加入 0.15 ml dmso，在微孔板上充分振蕩混勻 10 min ，用酶標(biāo)儀在 570 nm 波特長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度值 od，各濃度組均設(shè) 3 個(gè)平行孔， 獨(dú)立重復(fù) 3 次試驗(yàn)，繪制量效曲線；生長(zhǎng)抑制率ir%=1 試驗(yàn)組平均 od值/ 對(duì)比組平均od值 ×100%；2.2 蛋白提取及雙向凝膠電泳收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期空白和經(jīng) 50 mg·l-1 藥品處理的 a549 細(xì)胞，用無 kci 裂解液；勻漿液 4， 10,000g ，10 分鐘離心，收集上清液；蛋白經(jīng)2d-clean up 純化后用 2d-quant 定量；1雙向電泳參考文獻(xiàn)并作修改，等電點(diǎn)聚焦使用 ipgph

6、or 系統(tǒng)（ amersham pharmacia biotech inc.），線性 ph 4-7的 24cm預(yù)制膠條（ amersham pharmacia biotech inc.）及包含 urea 8 m 、2% chap、s dtt 20 mm、0.5%v/v ipg buffer的緩沖液；sds-page的進(jìn)行使用的是 12.5%聚丙烯酰胺凝膠；凝膠掃描是使用 powerlook 2100xl掃描儀（ umax, xinzhu, china ，而分析是用 imagemaster 2d 編輯軟件（ version 4.01;ge healthcare, usa ）；對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行三次重

7、復(fù)電泳；2.3 質(zhì)譜分析將酶解肽段樣品離心 , 取 1l上清與 1l含 10mg/ml 基質(zhì) chca的 50%乙腈/0.1%tfa后，在靶板上點(diǎn)樣， ultraflextm maldi-tof-ms/ms 質(zhì)譜儀檢測(cè)；加速電壓是20kv, 反射式正離子檢測(cè)；所獲得的 pmf用 masco搜t 索引擎在 ncbinr 數(shù)據(jù)庫中查詢 , 容忍度為士 0.1 并可容忍一個(gè)胰蛋白酶位點(diǎn)漏切；3 結(jié)果3.1 高異黃酮單體鑒定 玉竹中提取的高異黃酮化合物經(jīng)半制備液相，再經(jīng)esi- ms/ms、1h-nmr與 13c-nmr譜鑒定，得到 3-4'-羥基苯甲基 -5,7-二羥基 -6,8- 二甲基-

8、 苯丙二氫吡喃-4- 酮c19h20 o6 ；3.2 mtt檢測(cè) 結(jié)果顯示，高異黃酮對(duì) a549 細(xì)胞的存活率具有抑制作用 ,且隨著劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，呈正相關(guān)；與空白組相比，12、24 h 時(shí)， 25 mg·l-1 組有顯著性差異 p0.05 ； 6、12、24 h 時(shí)， 50、100 mg·l-1 組有顯著性差異 p0.01 ； 圖 1 ；圖 1高異黃酮對(duì)肺癌 a549 細(xì)胞存活率的影響3.3 高異黃酮處理 a549細(xì)胞的 2-de 分析濃度 50 mg·l-1 的高異黃酮作用 a549細(xì)胞 12h 后，與未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞進(jìn)行雙向電泳，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：在a549細(xì)胞的 2-de 圖譜上一共檢測(cè)到了 297±13 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過兩個(gè)處理 2-de 圖譜的比對(duì)，發(fā)覺其中有 39 個(gè)點(diǎn)發(fā)生了可重復(fù)性變化；在這 32 個(gè)變化點(diǎn)中，有 17 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度下調(diào)，其中包括7 點(diǎn)消逝； 15 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度上調(diào)；在變化點(diǎn)中有 5 個(gè)蛋白為候選有意義蛋白 見圖 2 和表 1 ；圖 2 a549 細(xì)胞的 2-