標(biāo)記免疫技術(shù)

1、羅紅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室二OO四年三月標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù) 第八章第八章 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù) 類(lèi)型：類(lèi)型：l放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）l免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA） 廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。 特點(diǎn):靈敏度高(10-9-10-15g/L)、

2、特異性強(qiáng)、 重復(fù)性好等標(biāo)記物:常用的核素有兩大類(lèi)射線(xiàn)： 131I、125I、57Cr和60Co射線(xiàn)：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I 性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)記物 對(duì)被標(biāo)記物的免疫活性影響小 測(cè)量方法簡(jiǎn)便、已推廣 半衰期較長(zhǎng)、核素豐度高標(biāo)記方法125I的標(biāo)記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：l直接標(biāo)記法 氯胺T法和乳過(guò)氧化物酶法l間接標(biāo)記法 聯(lián)接標(biāo)記法適用分子 原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)記 肽類(lèi)、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán)操作簡(jiǎn)便、易標(biāo)記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標(biāo)記間接標(biāo)記 甾類(lèi)化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán),需添加可避免氧

3、化還原劑對(duì)被標(biāo)記物活性的損傷等添加基團(tuán)可能影響被標(biāo)記物活性標(biāo)記物純化 對(duì)游離的125I等試劑與標(biāo)記物進(jìn)行分離 方法：分子篩凝膠過(guò)濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）標(biāo)記物鑒定l放射化學(xué)純度 單位標(biāo)記物中結(jié)合在被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95。l免疫活性 標(biāo)記過(guò)程中，被標(biāo)記物活性損傷程度。B/T80， B/T 抗原損傷。l比放射性 單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度. 常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。 比放射性 方法更靈敏；過(guò)高 輻射自損傷大，對(duì)標(biāo)記物免疫活性影響大，儲(chǔ)存穩(wěn)定性差 。抗血清鑒定 多克隆抗體的抗血清是

4、放射免疫分析的主要試劑之一，其質(zhì)量直接影響方法的特異性和靈敏度。l親合力 選用親和常數(shù)K值大(1091012 L/mol)抗血清l特異性 其程度可直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性 l滴度 最大稀釋度。在本技術(shù)方法中是指結(jié)合50標(biāo)記抗原時(shí)的抗血清的稀釋度。放射免疫分析（ RIA ）基本原理 采用定量的標(biāo)記抗原（Ag）和非標(biāo)記抗原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。 以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系。B/F 60() 50 40 30 20 10 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0 4.8 5.6 Ag(ng/ml) 測(cè)定方法與步驟1.抗原抗體反

5、應(yīng)：平衡法或非平衡法2.分離結(jié)合與游離標(biāo)記物 沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。如第二抗體沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分離徹底，迅速；分離試劑和過(guò)程不影響反應(yīng)平衡；操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好且經(jīng)濟(jì)。 3.放射性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(射線(xiàn))或液體閃爍計(jì)數(shù)儀( 射線(xiàn)) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算待檢抗原濃度。 免疫放射分析（IRMA）基本原理 單位點(diǎn)IRMA： 利用過(guò)量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其分離，測(cè)定上清液的放射量。l雙位點(diǎn)IRMA 先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合,然后再用過(guò)量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相抗原的另一

6、抗原決定簇結(jié)合,形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物,洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體,測(cè)定固相上的放射性。IRMA與RIA的異同點(diǎn) l標(biāo)記物標(biāo)記物 在RIA中 核素標(biāo)記抗原，抗原有不同種類(lèi)，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，標(biāo)記時(shí)需用不同的核素和不同的方法。在IRMA中 核素標(biāo)記抗體?？贵w為蛋白質(zhì)，有利于碘化標(biāo)記，不同抗體標(biāo)記方法基本相同。標(biāo)記抗體的比活度高，提高了分析的靈敏度。l反應(yīng)速率 反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度呈正比，在IRMA中標(biāo)記抗體是過(guò)量的，而且不存在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合復(fù)雜的反應(yīng)，所以反應(yīng)速度較RIA快。在RIA中抗體量是微量的，所以一定要用高親和力的多克隆抗體，而在IRMA中應(yīng)用親和力較低的單克隆體也能得到滿(mǎn)意的結(jié)

7、果。l反應(yīng)原理 RIA為競(jìng)爭(zhēng)抑制，測(cè)得放射性的量與受檢抗原呈反比。IRMA為非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，劑量反應(yīng)曲線(xiàn)為正相關(guān)的直線(xiàn)關(guān)系。l特異性 在雙位點(diǎn)IRMA中，一般均應(yīng)用針對(duì)不同位點(diǎn)的單克隆抗體，其交叉反應(yīng)率低于應(yīng)用多克隆抗體的RIA。 l檢測(cè)范圍 通常RIA的工作范圍為2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，而RIMA可達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。 l分析誤差 RIA中加入的抗體和標(biāo)記抗原都是定量的，加樣誤差可嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果。IRMA中標(biāo)記和固相抗體在反應(yīng)中都是過(guò)量的，只有受檢標(biāo)本的加樣誤差才會(huì)影響分析結(jié)果。因此，IRMA的批內(nèi)和批間變異均比較小。l其他 RIA可以測(cè)定大分子量與小分子量的物質(zhì)，雙位點(diǎn)IRMA只能測(cè)定在分子上具有2個(gè)

8、以上抗原表位的物質(zhì)。在RIA中應(yīng)用的為多克隆抗體，親和力和特異性要求較高，但用量很少。IRMA中標(biāo)記抗體和固相抗體用量較多，一般均用來(lái)源豐富、特異性較高的單克隆抗體。 放射免疫技術(shù)的應(yīng)用 常用于各種激素、微量蛋白、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。 問(wèn)題：放射性污染、常用核素半衰期短、試劑盒穩(wěn)定期不長(zhǎng)不易自動(dòng)化儀器分析等。第九章 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。 是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)檢測(cè)的敏感性和直觀(guān)性結(jié)合起來(lái)的一種方法。 基本原理 利用熒光素標(biāo)記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標(biāo)本中的待檢抗原特

9、異結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，透過(guò)濾色板發(fā)出一定波長(zhǎng)的光，使結(jié)合在標(biāo)本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡觀(guān)察底物片上熒光染色形態(tài)，來(lái)判斷有無(wú)待檢抗原或抗體。第一節(jié) 熒光的基本知識(shí)異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITCFITC） 為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為389.4389.4，最，最大吸收光波長(zhǎng)為大吸收光波長(zhǎng)為490-495nm490-495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)，最大發(fā)射光波長(zhǎng)520-520-530nm530nm，呈現(xiàn)明亮的，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光黃綠色熒光，是應(yīng)用最廣泛的熒，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。光素。主要優(yōu)點(diǎn)：主要優(yōu)點(diǎn)：人眼對(duì)黃綠色較為敏感；人

10、眼對(duì)黃綠色較為敏感；通常切片通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色，標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色，降低背景干擾 。四乙基羅丹明（四乙基羅丹明（RB200RB200） 為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大吸收光波長(zhǎng)為長(zhǎng)為570nm570nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為595595600nm600nm，呈，呈橘紅色熒光橘紅色熒光。常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。常用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?四甲基異硫氰酸羅丹明（四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITCTRITC） 最大吸引光波長(zhǎng)為最大吸引光波長(zhǎng)為550nm5

11、50nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為為620nm620nm，呈，呈橙紅色熒光橙紅色熒光。其異硫氰基可與蛋白。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。 熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，一些化合物對(duì)熒光有猝滅作用，因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光抗體的制備熒光抗體的制備 作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求： 應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。 熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。

12、 熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。 與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)，與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。 標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。熒光抗體是將熒光素（如FITCFITC）與特異性抗體以化學(xué)方式共價(jià)結(jié)合而成。 標(biāo)記方法：攪拌法(適合大樣品) 透析法(適合小樣品)標(biāo)記抗體的純化：透析法 層析分離法 F/PF/P比率： 將制備的熒光抗體稀釋至A A2802801.01.0，分別測(cè)讀A A280280（蛋白質(zhì)特異吸收峰）和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰 F/PF/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/PF/P1.51.5為宜，用于活細(xì)胞染色的以F/

13、PF/P2.42.4為宜。 抗體效價(jià)：效價(jià)越大標(biāo)記抗體的特異性越高非特異熒光越少。效價(jià)在1:16-1:32者較為理想 抗體特異性 ：免疫電泳和交叉免疫電泳觀(guān)察特異性沉淀線(xiàn)或沉淀峰，在紫外線(xiàn)照射下發(fā)出強(qiáng)烈熒光 第二節(jié) 免疫熒光顯微技術(shù)基本原理：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀(guān)察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光。 直接法直接法 熒光抗體染色直接法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異 熒光染色因素少，缺點(diǎn)：靈敏度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體間接間接法間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測(cè)抗原，也

14、可檢測(cè)抗體。免疫熒光技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用l在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中主要用于菌種的鑒定。l免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)是梅毒特異性診斷常用方法之一。l用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。l在寄生蟲(chóng)感染診斷中，間接免疫熒光試驗(yàn)（IFAT）是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)瘧疾抗體的方法。 l免疫熒光法還是檢測(cè)自身抗體的好工具，在自身免疫病的實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用廣泛。其突出優(yōu)點(diǎn)是能以簡(jiǎn)單方法同時(shí)檢測(cè)抗體和與抗體起特異反應(yīng)的組織成分，并能在同一組織中同時(shí)檢查抗不同組織成分的抗體。l熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析（flowcytometry）?？捎糜跈z測(cè)細(xì)胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細(xì)胞亞群等的檢測(cè)。

15、 第十章第十章 酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù) 第一節(jié) 酶免疫技術(shù)概述基本原理 利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。 基本特點(diǎn)： 標(biāo)記后保留酶和抗原(抗體)的活性 酶促反應(yīng)專(zhuān)一性，保證特異性 底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性 酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定 操作簡(jiǎn)便，安全易行主要試劑的制備與要求一、酶與酶作用底物（一）用于標(biāo)記酶的要求：l酶活性高l標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性l酶催化底物后信號(hào)易判定或測(cè)定l酶活性不受樣品中其他成分的影響l酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無(wú)害，價(jià)廉（二）常用酶及其底物1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 常用底

16、物：l鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性l四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無(wú)需避光，無(wú)致癌性，但水溶性差。2. 堿性磷酸酶（AP） 常用底物為對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。 * AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物收率 低于HRP，且價(jià)高，故應(yīng)用不如HRP普及。二、酶標(biāo)記抗體或抗原l基本要求： 酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化l 酶標(biāo)記方法 1.交聯(lián)法 以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法 用過(guò)碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體

17、（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。三、固相載體l基本要求 結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡(jiǎn)便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。l固相載體的種類(lèi)與選擇1.塑料制品 材料經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，最常用。2.微顆粒 結(jié)合容量大，反應(yīng)迅速，逐漸普遍用于自動(dòng)化分析。3.膜載體 硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜等微孔濾膜，廣泛應(yīng)用于定性或半定量的斑點(diǎn)ELISA。四、免疫吸附劑原理：非共價(jià)鍵吸附或共價(jià)鍵化學(xué)偶聯(lián)（包被）。一般采用偏堿性（pH9.6）的碳酸鹽溶液（ELISA板）。封閉：15牛血清白蛋白或520小牛血清。 酶免疫技術(shù)的分類(lèi)

18、 酶免疫組化 用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體 酶免疫技術(shù) 均相酶免疫測(cè)定 酶免疫測(cè)定 固相酶免疫測(cè)定 異相酶免疫測(cè)定 （ELISA） 液相酶免疫測(cè)定l 均相酶免疫測(cè)定Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E 基本原理：利用酶標(biāo)抗體結(jié)合抗原形成復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變的原理，在不將復(fù)合物與游離酶標(biāo)抗體分離的情況下，直接測(cè)定系統(tǒng)中總的標(biāo)記酶活性的改變，進(jìn)而推算出待檢樣品中的抗原量。l異相酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay,EIA） 基本原理：在抗原抗體反應(yīng)后，先將抗原抗體復(fù)合物與游離的酶標(biāo)抗體分離，再測(cè)定酶標(biāo)記的復(fù)合物催化底物

19、顯色的活性，最后推算出樣品中抗原的含量。液相EIA：分離劑分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記物。固相EIA：固相載體結(jié)合酶標(biāo)復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)抗體。如ELISA。Ag+Ab-E Ag Ab-E + Ab-E第二節(jié) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) l使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性持其免疫活性 l在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起

20、反應(yīng)體表面的抗原或抗體起反應(yīng)l用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。 l加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析ELISAELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定

21、抗體，在這種測(cè)定方法中有體，在這種測(cè)定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑：v固相的抗原或抗體，固相的抗原或抗體，v酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，v酶作用的底物。酶作用的底物。 1雙抗體夾心法特點(diǎn)：l非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)l常用于抗原的檢測(cè)l適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)l所用兩種抗體分別針對(duì)同一個(gè)抗原分子的不同抗原決定簇 2間接法3.競(jìng)爭(zhēng)法特點(diǎn)：l用于抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。l酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。l反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限

22、量的，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。l反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測(cè)定的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。4.捕獲法（反向間接法） 主要用于 血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。 基本原理： 固相抗IgM待檢標(biāo)本(IgM)抗原(與特異抗體結(jié)合)E酶標(biāo)抗體底物 第三節(jié) 膜載體的酶免疫測(cè)定 固相膜免疫測(cè)定與ELISA相類(lèi)似,其特點(diǎn)是以微孔膜作為固相.標(biāo)記物可用酶和各種有色微粒子,如彩色乳膠、膠體金等。常用固相膜為硝酸纖維素膜。類(lèi)型：免疫滲濾試驗(yàn)：穿流形式 免疫層析試驗(yàn)：橫流形式 斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)（dot-ELISA）

23、免疫印跡法 (Western blot) 免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT） 亦被稱(chēng)為Western blot分三個(gè)階段進(jìn)行 :lSDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）l電轉(zhuǎn)移 l酶免疫定位 lSDS-PAGE 抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽(yáng)泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶） l電轉(zhuǎn)移 將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1-2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。 l酶免疫定位 將印有蛋白質(zhì)條帶的硝

24、酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDA-PAGE加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。 第四節(jié) 酶免疫測(cè)定的應(yīng)用病原體及其抗體廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、病原體及其抗體廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。病毒如肝炎病毒、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如鏈球菌、結(jié)核分風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、幽門(mén)螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲(chóng)如弓形體、阿米枝桿菌、幽門(mén)螺桿菌和布氏桿菌等；寄生蟲(chóng)如弓形體、阿米巴、瘧原蟲(chóng)等。巴、瘧原蟲(chóng)等。蛋白質(zhì)如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分