頂空氣相色譜在藥物檢測中的應用

1、海 南 大 學課程論文題 目：頂空氣相色譜在藥物研究的應用 學 號： 20090412310018 姓 名： 潘成凱 年 級： 09級 學 院： 材料與化工學院 系 別： 生物工程系 專 業(yè)： 生物工程 指導教師： 趙富春老師 完成日期：2012 年 12 月 26 日 頂空氣相色譜在藥物研究的應用09生工 潘成凱 20090412310018摘要:關鍵字：頂空氣相色譜分析法是對液體或固體試樣中的揮發(fā)性成分進行分析的最有效方法，是色譜分析的一種特殊形式，這一方法從氣相色譜儀角度講是一種進樣系統(tǒng)，即“頂空進樣系統(tǒng)”。頂空進樣就是樣品在一密閉的恒溫系統(tǒng)中，揮發(fā)組分氣液（氣固）兩相達到平衡時，從上部

2、空間取樣，然后用氣相色譜分析法進行測定。根據(jù)取樣和進樣方式的不同，頂空分析有靜態(tài)分析和動態(tài)分析1。靜態(tài)頂空是指將樣品密封在頂空瓶子中，在一定的溫度下加熱，使得氣液（固）之間達到氣液平衡，然后取氣相部分進入GC檢測。根據(jù)一次的檢測結果進而確定待檢測樣品中揮發(fā)性成分的含量。如果進行多次取樣，直至樣品中揮發(fā)性組分完全萃取出來，這就是動態(tài)頂空GC。靜態(tài)頂空氣相色譜簡單便宜，而動態(tài)頂空氣相色譜價格昂貴，不易操作【2】。一、頂空氣相色譜簡介1.1原理頂空氣相色譜利用液(固)體中的揮發(fā)性組分i在密閉恒溫系統(tǒng)中達平衡后，氣相和液(固)相中揮發(fā)性組分比值恒定的原理，對平衡后液(固)體上部的蒸氣進行氣相色譜分析。

3、頂空瓶中試樣上面的蒸汽壓相當?shù)蜁r，峰面積Ai的大小與試樣上面的氣相中揮發(fā)性組分i的蒸汽壓pi成正比，在真實體系中，當系統(tǒng)達到平衡時，Ai=fi*pi=ki*xi（fi為校正因子，pi為i的飽和蒸汽壓，xi為組分i的摩爾分數(shù)），通過頂空分析，可確定試樣中待測組分的含量【3】。靜態(tài)頂空氣相色譜是將適量樣品密封在留有充分空間的容器中，在一定溫度下放置一段時間使氣液（或氣固）兩相達到平衡，取容器上方的氣體進行G C 分析。按達到氣液（或氣固）平衡的次數(shù)可分為一次頂空進樣法和多次頂空進樣法。按儀器模式可分為頂空氣體直接進樣模式、平衡加壓采樣模式和加壓定容采樣進樣模式【4】。動態(tài)頂空氣相色譜是在未達到氣液

4、平衡狀況下進行多次取樣，直至樣品的揮發(fā)性組分完全萃取出來為止，因此又稱氣相連續(xù)萃取。常用的方法是向樣品中不斷通入惰性氣體（氣體萃取劑），揮發(fā)性成分即隨萃取氣體從樣品溢出，然后由吸附裝置（捕集器）收集，解吸后進入G C 儀分析，這種動態(tài)頂空GC 通常稱為吹掃- 捕集頂空氣相。動態(tài)頂空分析根據(jù)捕集模式可以分為吸附劑捕集模式和冷阱捕集模式5。1.2儀器構造及部件頂空氣相色譜儀具有一般色譜儀的結構，在進樣系統(tǒng)有自己獨特的一面，其由載氣系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離柱、檢測系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)5部分組成，載氣系統(tǒng)主要作用是使樣品能順利進入分離柱，進樣系統(tǒng)主要是負責將樣品汽化，分離柱是色譜的核心部件，決定了色譜的分離

5、性能，檢測系統(tǒng)用于對樣品進行檢測并轉化為信息進行放大，溫度控制系統(tǒng)則對汽化室、分離室、檢測室進行溫度的控制。頂空氣相色譜的進樣系統(tǒng)需要一個恒溫浴的過程，使樣品汽化充滿取樣品，普通的氣相色譜是用進樣針進樣，進樣體積在ul級別，樣品為液體；頂空進樣進樣體積在ml級別，進入氣相色譜的為氣體?！?】贊1.3檢測方法、條件及其發(fā)展特點頂空氣相色譜頂空分析源于分析固體或液體頂部蒸氣相中的有機揮發(fā)性物質，其出現(xiàn)早于氣相色譜法。1939年Harger等對水相中醇含量的測定為該方法的雛形。到1958年，頂空氣相色譜作為一種獨立的樣品處理技術和氣相色譜聯(lián)用進行揮發(fā)物和半揮發(fā)物的分析方法出現(xiàn)報道【7】。早期恒溫浴的

6、溫度在120到150，現(xiàn)在已經(jīng)升到190甚至更高，擴大了頂空進樣器的應用范圍。現(xiàn)在適合頂空氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器(FID)、熱導檢測器(TCD)、氮磷檢測器 、火焰光度檢測器、電子捕獲檢測器、質譜檢測器等。二、頂空氣相色譜在藥物研究的應用1、頂空氣相色譜在中藥物質分析中的應用翁雪香等【8】利用頂空固相微萃取技術富集筒篙揮發(fā)性化合物，用手動的固相微萃取裝置頂空萃取30 min, 萃取溫度為60。提取物在GC 進樣口( 270 ) 脫附2 min, 載氣為氦氣，檢測器溫度280，然后進行GC- MS 檢測分析。經(jīng)氣-質聯(lián)用儀分析，共分離鑒定出25種化合物，大約占總峰面積99. 8%，

7、主要的化合物有蒎烯38.6%、羅勒烯19.3%、2-己烯醛9.0%，1，6，10-十五碳三烯6.4%、乙酸冰片酯4.30%、大根香葉烯2.7%和金合歡烯1.1%和2-乙基-4丁醇8%等。用氣相頂空技術得到的結果，與溶劑提取法得到的結果相比，是一種測定茼蒿易揮發(fā)性成分簡單、迅速、有效的方法。薛健等【9】采用頂空吹掃法進行采樣，在氣相色譜220時進樣，進樣量為2.0微升，分流比1：50，檢測室溫度200的條件下進行測定，結果檢測出的100多個成分中有30多種化合物相同，而相差2倍以上的有15種化合物，相差5倍以上的有4種化合物，而其余成分不同，為頂空色譜在道地與非道地藥材的區(qū)別上提供了一定的理論指

8、導。魏寧漪【10】等利用頂空進樣和固相微萃取進樣，將40mg對照樣品置于20ml頂空樣品瓶中，加熱溫度為120，時間0.5小時，頂空時進樣2ml，在270時進行進樣，載氣為氦氣，流速1ml/min，進行氣相色譜檢測，結果顯示，可以檢測出其中的樟腦、龍腦、己酸、苯酚、辛酸等摻假成分。徐娟華【11】采用頂空氣相譜法測定雞肝散中7種揮發(fā)油成分含量。以乙酸乙酯為溶劑, 頂空條件為平衡溫度90，時間為30min，氣體1ml自動進樣，氣相采用程序升溫法: 初始溫度60 , 以30/min升至90 ,再以5/min升至180 ; 進樣口溫度200 , 檢測器溫度240。7種成分能較好分離, a- 蒎烯、B-

9、 蒎烯、L, 8- 桉葉醚、樟腦、芳樟醇、乙酸龍腦酯和龍腦平均回收率分別為96. 6%、97.0%、97. 8%、99.9%、96.5%、97.4%、97.1%.由此可知，頂空氣相色譜能夠很好的對中藥材中的揮發(fā)油進行檢測。于生等22于150 對藥材粉末加熱60m in 后取頂空氣體0.5ml, 進樣口200，F(xiàn)ID220檢測。通過對10批貓爪草藥材色譜圖的統(tǒng)計分析, 標定了12個共有峰。認為此方法簡便, 穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好, 具有可操作性。陳建偉 23 在頂空溫度95，平衡10 min 后進入色譜，進樣口溫度為180，F(xiàn)ID在280進行檢測，分析結果發(fā)現(xiàn)3種中藥的頂空氣相色譜特征指紋圖各異, 貯

10、藏4年的牡丹皮僅含微量的丹皮酚。頂空氣相色譜法在鑒定芳香類中藥的品質及其質量監(jiān)控方面, 具有簡便、快速、準確及專屬性強的優(yōu)點。2、頂空氣相色譜在藥物溶劑殘留分析中的應用梁祈【12】等采用頂空氣相色譜法測定了頭抱氨節(jié)中有機殘留溶劑甲醇的含量，用0.5 m ol/L氫氧化鈉溶液為溶劑制備供試品溶液, 頂空熱平衡溫度: 80 , 采樣針溫度: 105 , 傳輸管溫度: 110 , 熱平衡時間: 30 min, 壓力平衡時間: 0. 3 min, 進樣時間: 0. 03 min。在120時進樣，采用FID檢測器，溫度為280。結果顯示，測定結果準確、可靠，可作為頭抱氨節(jié)中甲醇殘留的檢測方法。黃勇【13

11、】等用頂空氣相色譜法同時測定赤芍提取物中2種殘留有機溶劑，頂空平衡溫度為70，平衡時間40 m in。色譜柱溫60，載氣為氦氣，進樣口溫度為220，進樣體積0.5ml，得出提取物中乙醇、正丁醇殘留測定結果,含乙醇不得過1 000 g /g, 正丁醇不得過20g /g, 遠低于ICH 規(guī)定0.5% ( 5 000ug /g)的限度要求。頂空進樣避免了難揮發(fā)物質對色譜柱的污染以及一些不必要的干擾, 又增加了揮發(fā)性被分析物的靈敏度, 非常適合于揮發(fā)性有機溶劑殘留分析。魏晶晶等【14】利用頂空進樣，結合毛細管色譜柱，對常用的在生產藥物機制被過程中常用到的27種有機揮發(fā)性化合物進行測定，頂空條件為80恒

12、溫震蕩30min，以1：1的分流比進樣，進樣口溫度為220，檢測器溫度300，結果顯示分離度絕大多數(shù)均大于1.5，峰面積與濃度呈良好的線性關系，精密度良好。何偉15 采用頂空氣相色譜法測定銀杏葉提取物中有機溶劑乙醇的殘留量。采用CP- 624色譜柱,載氣為氮氣, 柱溫采取程序升溫的方法; FID 檢測器溫度250 ; 進樣口溫度180 。結果顯示乙醇在20. 6 412.0g /mL范圍內呈良好的線性關系, r= 0. 9996平均回收率為99.85%, RSD 為1.62%, 最低檢測限為13ng。認為該方法簡單、靈敏、準確, 可用于銀杏葉提取物中乙醇殘留量的測定。劉敬蘭等16利用頂空氣相色

13、譜法測定了維生素B12 中丙酮溶劑的殘留量,其色譜條件為10 % 二硝基對苯二甲酸封端的聚乙二醇20 M (FFAP 2 m x 3 m m ) 不銹鋼柱, 柱溫80 , 氣化室及檢測器溫度為150 ; 載氣流量5 0 m L/min。通過試驗發(fā)現(xiàn)其最佳平衡時間為60 m in , 最佳平衡溫度為60 , 在0300 ug 的范圍內峰面積和丙酮含量間呈現(xiàn)良好的線性關系。潘雪萍【17】采用頂空氣相色譜法測定鹽酸托泊替康中的殘留有機溶劑。通過實驗發(fā)現(xiàn)，頂空的最佳條件為溫度80，最佳平衡時間為30min，氣相的進樣口溫度為250，流速，分流比為，柱溫箱溫度，檢測器溫度。測定批樣品，均未檢出乙腈、乙酸

14、乙酯和二氧六環(huán)，檢出了甲醇和丙酮，各殘留量符合要求。方法學驗證結果表明，該方法簡單、快捷、靈敏，可有效用于該藥有機溶劑殘留量的控制。張宏等 26 測定水飛薊提取物中的正己烷和醋酸乙酯的殘留量。試驗采用FFAT ( 2- 硝基對苯二甲酸封端的聚乙二醇20M 柱)石英毛細管柱, 程序升溫方式, 頂空條件為平衡溫度為130 e , 平衡時間30 m in,測定結果表明水飛薊提取物中兩種溶劑殘留量均符合要求。王騰等 30 采用HP- 5色譜柱, 柱溫80 , 頂空瓶加熱溫度80 , 平衡15 m in, 以正丁醇為內標測定注射用銀杏葉( 凍干)中甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯殘留量。該方法線性良好, 精密

15、度、重現(xiàn)性RSD 均小于5%, 平均回收率在93. 06% 113. 78%, 四種溶劑殘留量均符合要求。3、頂空氣相色譜法在中藥外源性雜質引入的檢測廖遠熹等 18 采用靜態(tài)頂空氣相色譜- 質譜聯(lián)用技術鑒別市售柴胡是否經(jīng)硫黃熏制。將2g樣品置于10ml頂空瓶，試驗采用HP- 5MS毛細管色譜柱, 程序升溫方式, 進樣口溫度為200，以50比1的分流比進樣，以氦氣為載氣, 頂空溫度120 , 預熱30m in。結果表明: 與未經(jīng)硫黃熏制的陰性樣品比較, 9種市售柴胡中有7種經(jīng)過了不同程度的熏制, 該方法可廣泛應用于中藥材硫黃的檢出。4、頂空氣相色譜法測定使用大孔吸附樹脂后的殘留物袁海龍【19】等

16、采用頂空進樣方式, 氫火焰( FID)檢測器, 利用程序升溫方式, 以氦氣為載氣, 頂空溫度為60 , 加熱時間為30 m in,氣相色譜進樣口溫度為200，檢測器溫度240， 用以測定經(jīng)D101大孔吸附樹脂分離的茵陳蒿有效部位中可能含有的正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、二苯乙烯等殘留物及裂解產物。結果表明該中藥有效部位中未檢測出以上7種殘留物. 采用頂空進樣, 取得了很好的效果。鄧海星【20】等采用頂空毛細管氣相色譜法測定胡黃連提取物中大孔樹脂殘留物，在80下平衡40 m in, 采用頂空進樣方式，檢測器為氫火焰離子化檢測器,溫度270 ; 進樣器250 , 以5比1的分流比進

17、樣。結果顯示7種殘留物的峰面積與濃度的線性關系良好。姚干等21 用頂空溫度85 , 以二甲亞砜為溶劑, 對采用HPD450大孔吸附樹脂分離純化所得的梔子提取物中可能含有的正己烷、苯、正庚烷、甲苯等殘留物進行測定; 再用頂空溫度85 e , 以1% 甲醇為溶劑, 測定梔子提取物中可能含有的二甲苯、苯乙烯、1, 4- 二乙基苯和1, 2- 二乙基苯等殘留物。結果表明, 三批梔子提取物均未檢出上述8種殘留物, 最低檢測限在50ng /m l以下。許勇【24】等采用頂空進樣毛細管氣相色譜法測定燈盞花素提取物中大孔樹脂有機溶劑殘留物，在頂空溫度90下平衡30min，進樣口240，300FID檢測，結果顯

18、示，待測物正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯與內標物正丁醇獲得了較好的分離。8 種有機殘留物，結果均未檢出。李麗敏【25】等用頂空溫度95平衡30min，氣相進樣口溫度240，柱溫60，檢測器溫度為300對三七葉苷中大孔樹脂有機溶劑殘留物進行檢測，結果顯示，沒有殘留物剩余。此法簡單高效，可作為測定方法。王焱27在平衡溫度85下加熱55min，進樣口溫度180，F(xiàn)ID 檢測器180，柱溫40，載氣為氮氣對加參片中大孔樹脂有機殘留溶劑。結果表明各殘留溶劑均未檢出，符合限度要求。該方法適用于中藥復方制劑加參片中大孔樹脂殘留溶劑的控制。另外, 鄒亮等 28 測定了

19、苦蕎麥總黃酮提取物中可能由AB - 8大孔樹脂中殘留的正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、乙苯和苯乙烯。楊玲等 29 測定黃芩提取物中可能含有的D-101大孔吸附樹脂帶來的正己烷、苯、甲苯、二甲苯、二乙苯、苯乙烯、二乙烯苯等殘留物。三、前景頂空氣相色譜法是一種對藥物成分檢測的快速而簡便的分析方法, 該方法具有較高的靈敏度和分析速度, 對分析人員和環(huán)境危害小, 操作簡便, 是一種符合綠色分析化學要求的分析手段。為了保證藥品的安全性, 中藥材提取物中有機溶劑殘留量的測定就成為研究者關注的問題, 也是藥品質量的檢測的重點關注的問題, 對這些溶劑的測定在中國藥典2 005 版附錄作原則性規(guī)定。隨著分析儀器的發(fā)展和分析技術的提高, 頂空氣相色譜在藥物分析中的應用將會越來越廣泛。參考文獻：【1】1Kolb B,Ettre L S.Static headspace-gas chromatography:theory and practiceM.New Jersey:John Wiley&Sons,2006【2】張軍 車海先 ，淺議頂空氣相色譜【J】，食品安全