T-RFLP推薦課件

1、2021/8/221T-RFLPT-RFLP技術(shù)桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院 程駿2021/8/222T-RFLP簡介 T-RFLP中文全稱是末端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以稱為16sRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)。它是將目標(biāo)DNA片段的一個(gè)末端(通常是5端)用熒光標(biāo)記，這樣在酶切后，分析的目標(biāo)只限于有熒光標(biāo)記的末端限制性片段上。酶切后產(chǎn)生長度不等的末端限制性長度片段經(jīng)過毛細(xì)管電泳分離，并經(jīng)ABI自動(dòng)測(cè)序儀上檢測(cè)和計(jì)算后，輸出末端限制性片段長度的大小和熒光強(qiáng)度圖。測(cè)序儀上輸出的圖譜含有的不同波

2、峰越多，則表明微生物種類越豐富。通過比較不同樣品圖譜間波峰的異同，就可以得到不同樣品中菌群的差異。2021/8/223T-RFLP原理 T-RFLP的技術(shù)原理是根據(jù)的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5末端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，常用熒光物質(zhì)有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析樣中的DNA，以它為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR產(chǎn)物的一段就帶有這種熒光標(biāo)記，然后PCR產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，一般選用酶切位點(diǎn)為4bp的限制性內(nèi)切酶。由于在不同細(xì)菌的擴(kuò)增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，酶切后就會(huì)產(chǎn)生很多不同長度的限制性片段。消化產(chǎn)物用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)定，只有末端帶有熒光

3、性標(biāo)記的片段能被檢測(cè)到。因?yàn)椴煌L度的末端限制性片段必然代表不同的細(xì)菌，通過檢測(cè)這些末端標(biāo)記的片段就可以反應(yīng)微生物群落的組成情況。 這種方法還可以進(jìn)行定量分析，在基因掃描圖譜上，每個(gè)峰面積占總峰面積的百分?jǐn)?shù)代表這個(gè)末端限制性片段的相對(duì)數(shù)量，即末端限制性片段的數(shù)量越大其所對(duì)應(yīng)的面積越大 。2021/8/224T-RFLP流程簡單的流程圖：3.1把樣本的基因組提取出來3.2以提取出來的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物的5端帶有熒光標(biāo)記物3.3將純化過的PCR產(chǎn)物用限制性酶進(jìn)行酶切3.4將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到大概的電泳條帶圖，以方便檢測(cè)酶切是否完全3.5酶切產(chǎn)物在DNA測(cè)序儀(ABI

4、 3730，美國)中進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，所得電泳圖譜用片段分析軟件Genescan(ABI，美國)進(jìn)行分析3.6圖譜分析及數(shù)據(jù)分析PCR（純化）2021/8/225我的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)方法 最初是要研究IL-10這個(gè)基因?qū)τ谌梭w有什么作用，因此用了兩種小鼠來做研究，一組是正常小鼠，一組是IL-10基因敲除的小鼠，通過T-RFLP這個(gè)技術(shù)來研究兩組小鼠在腸道菌群上的差異，從而了解IL-10基因?qū)τ趧?dòng)物腸道菌群的影響，得到這一方面的研究成果。2021/8/226具體的實(shí)驗(yàn)步驟一、提取樣本的基因組我提取的是小鼠糞便的基因組，用自己實(shí)驗(yàn)室配制的糞便基因組提取試劑盒來抽提，基因組提取的結(jié)果良好。2021/

5、8/227二、PCRPCR條件：95，5 min變性95，30 S退火55，30 S 37個(gè)循環(huán)延伸72，2min 72，10 min，4保存。然后用DNA凝膠回收試劑盒（上海中亞）對(duì)PCR產(chǎn)物做一個(gè)回收，以去掉PCR反應(yīng)中的雜帶，保證只有800bp大小的DNA片段，去掉雜帶。 2021/8/228下面是一次實(shí)驗(yàn)十六個(gè)樣本PCR后的電泳圖，我們PCR得到的DNA片段一定要是800bp位置的，不可出現(xiàn)雜帶，而且對(duì)于PCR的污染要求很嚴(yán)格，因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)用的引物是通用引物，基本上所有的生物基因組都可以P出這樣的條帶，所以對(duì)于所用試劑、耗材、環(huán)境要求很高，否則最后結(jié)果沒有說服性。750bp2021/8

6、/229三、酶切選用Hha作為實(shí)驗(yàn)的限制性內(nèi)切酶，酶切位點(diǎn)是GCGC酶切體系采用40 L, PCR 產(chǎn)物為6 L,在37 C 酶切6 h, 反應(yīng)完成后, Hha在65 C 水浴中20 min失活。酶切時(shí)間一定要控制好，不能太短，酶切沒有結(jié)束就停止，因此要酶切一段時(shí)間進(jìn)行一次電泳，看條帶結(jié)果，決定是否停止酶切，一般都需要48小時(shí)。2021/8/2210下面是一張酶切不完全的電泳圖2021/8/2211四、送去做T-RFLP的測(cè)序 這個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)序是送去生工做的測(cè)序，用的是DNA測(cè)序儀ABI3730，大約34天能拿到，因此我的實(shí)驗(yàn)部分大約兩周能做一次。2021/8/2212五、圖譜分析和數(shù)據(jù)分析這是兩

7、個(gè)同組樣本的圖譜，波峰大致上是相同的，這樣表明這兩個(gè)樣本數(shù)據(jù)是比較可靠的。2021/8/22132021/8/2214T-RFLP統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)于每個(gè)圖譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理，去除熒光強(qiáng)度小于100和片段大小35或者500的片段數(shù)據(jù)，將剩下片段的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并去除相對(duì)豐度小于1的片段78。這批樣本一共十六個(gè)，分為對(duì)照組和干預(yù)組，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到右邊的數(shù)據(jù)，和圖譜吻合。2021/8/2215 此外還作了聚類分析，就是將T-RFLP的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成10矩陣（1表示有，0表示無），利用SPSS16.0中的聚類分析工具（Classifiy-hierarchical Analysis），采用非加權(quán)配對(duì)算法平均法對(duì)每組樣本進(jìn)行聚類分析。 接下來用軟件SPSS16.0進(jìn)行物種豐度（S）、BCI和Shannon-Weiner指數(shù)（H）的計(jì)算，就不再一一贅述。2021/8/2216總結(jié) IL-10基因的發(fā)現(xiàn)及IL-10細(xì)胞因子在動(dòng)物體中的重要作用越來越引起大家的注意，特別是其在免疫系統(tǒng)中的作用。通過T-RFLP技術(shù)得到的數(shù)據(jù)，我們可以初步判定IL-10基因?qū)τ谛∈蟮哪c道菌群是有很大影響的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之間腸道菌群存在很大差異，至少有一種或多種菌群在數(shù)量上差異很大。 由于在時(shí)間、知識(shí)