特異性dc疫苗治療慢性乙型肝炎療效及治療后血清icam-1、icam-3水平的研究

1、特異性dc疫苗治療慢性乙型肝炎療效及 治療后血清icam-1、icam-3水平的研究【摘要】目的 檢測特異性dc疫苗治療慢性乙型肝炎患者前后hbv-dna的變 化，及治療后療效好與療效差者血清i cam-1. icam-3的水平的變化，探討dc疫 苗療效及其影響因素。方法 選取慢性乙型肝炎患者37例，抽取患者外周血, 分離樹突細胞行體外培養(yǎng)、擴增后以表面抗原致敏，制備成特異性dc疫苗，自體 回輸，回輸2次為1個療程(間隔2周)，每位患者均治療2個療程。檢測治療前 后患者hbv-dna的變化，檢測治療后療效好與差者血清icam-1. icam-3水平的變 化。結果 37例慢性乙型肝炎患者經(jīng)dc疫

2、苗治療后，19例hbv-dna載量下降 > 2. ologlo, 18 例 hbv-dna 載 量下降 <2. ologlo,有效率 51.4% ( x 2=25. 56, p< 0.001)。血清icam-l、icam-3水平,在有效與無效兩組間比較差 異無顯著性(p>o. 05 )0結論特異性dc疫苗治療慢性乙型肝炎，可顯著降低hbv-dna載量,icam-l、icam-3可能不是影響其療效的主要因子?！娟P鍵詞】特異性dc疫苗icam樹突細胞乙型肝炎abstract objective to observe the efficacy and

3、changes of hbv-dna, icam-1 and icam-3 in chronic hepati-tis b patients treated with specific dc vaccine. methods the subjects were taken peripheral blood dendri t ic cel is f rom 37 chronic hepat i t is b pat ients, dcs were cultured and proliferated in vitro with hbsag to prepare the specific dc va

4、ccine, and transfused twice for a course of treatment ( interval 2 weeks ) . after two courses of treatment, changes of hbv-dna, icam-1 and icam-3 were observed. results after dc transfusion, the levels of hbvdna in 19 cases were decreased > 2. 0 log 10. the effective rate was 51.4% ( x 2=25. 56,

5、 p< 0. 001 ) there was no obvious differences in levels of icam-1 and icam-3 ( p> 0. 05 ) conclusion specific dc vaccine can obviously decrease the level of hbv-dna. perhaps icam-1 and icam-3 are not the main factors.key words specific dc vaccine; cell adhesion molecules; dendritic cel

6、ls; hepatitis b自1970年至今，隨著樹突細胞的發(fā)現(xiàn)及對樹突細胞(dc)的體外分離、 擴增和培養(yǎng)技術方面的基礎研究，dc用于乙型肝炎的治療在動物、體外及臨床試 驗中，取得了很好的療效1 3。目前已經(jīng)成為臨床研究的一個“熱點”，但在 臨床的應用中仍缺乏有力的依據(jù)，本實驗通過體外分離、培養(yǎng)、擴增慢性乙型肝 炎患者外周血的dc,以hbsag致敏，制成特異性dc疫苗，經(jīng)皮下行自體回輸， 觀察特異性dc疫苗治療前后患者hbv-dna及治療后血清icam-1. icam-3水平, 判定dc治療慢性乙型肝炎的療效，通過對特異性dc疫苗治療后療效好與療效差 的慢性乙型肝炎患者血清icam-1.

7、icam-3水平的比較，了解其是否為影響dc疫 苗療效的主要因子。為臨床dc治療慢性乙型肝炎提供理論依據(jù)。1 材料與方法1. 1 材料1. 1. 1 研究對象 選取2004年5月2007年5月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院 肝病中心門診或住院慢性乙型肝炎患者37例，其中男30例，女7例；年齡18 63歲,平均37歲。所有病hbv-dna1. 0 x 105copies/mlo入選患者無其他病毒合并感染及嚴重并發(fā)癥，治療前半年內未使用過任何抗病毒及調節(jié)機體免疫 的藥物，全部獲得了知情同意。診斷標準符合2000年修訂的病毒性肝炎防治方 案4 及2005年慢性乙型肝炎防治指南。1. 1. 2 主要試劑1. 1

8、. 2. 1 dc疫苗制備試劑 rhgm-csf. rhil-4. rpmi1640培養(yǎng)液、鼠抗人 cd40, cd83,購于河北博海生物工程有限公司，hbsag購于中國預防醫(yī)學科學院 病毒所。1.1.2.2 elisa試劑 icam-1. i cam-3 elisa試劑盒，國外生產(chǎn)國內組裝, 試劑號分別為 eia05821, qrct-225998eia/utl。1.1.2. 3 主要儀器 co2培養(yǎng)箱（thermo forma,美國），倒置顯微鏡 （olympus, h本），可在450mm處進行計數(shù)的全自動酶標儀（thermo,芬蘭），37°c 恒溫箱（sbhw-iv,北京），可

9、調多道移液器及槍頭（eppendorf,德國），離心機 （ld-25-2,北京），振蕩混勻器（xw-80a,上海）。1.2 實驗方法采用自身前后對照實驗，在無菌條件下抽取受試者外周靜脈血20ml,肝素抗凝，在百級實驗室進行下面操作：生理鹽水1: 1稀釋抗凝血, 層加到淋巴細胞分離液2000r/min離心30min,分離出外周血單核細胞并計數(shù), 用1640液選2次，再加入含有體積分數(shù)150ml/l入ab血清的1640完全培養(yǎng)基重 懸細胞,以2x109/l的細胞濃度加入一次性6孔培養(yǎng)板中,于37c 50ml/lc02 飽和濕度下培養(yǎng)4h,棄上清液，再用1640培養(yǎng)液輕洗2次，除去非貼壁細胞，加 入

10、含8335 |li kat/l rhgm-gsft 8335 p kat/l rhil-4的完全培養(yǎng)基，隔日換液，培 養(yǎng)至第6天再加入終濃度為2. 5mg/l的hbsag,4h后加入終濃度為10p g/l的tnf, 繼續(xù)在37°c 50ml/l c02飽和濕度下培養(yǎng)1天，收獲dc用生理鹽水洗滌2次并計 數(shù)，即刻在受試者腋下部位常規(guī)消毒后經(jīng)皮下注入體內。同時取細胞洗液做無菌 實驗?；剌?次為1個療程（間隔2周），每名患者均治療2個療程。分別檢測治 療前及治療結束1月后患者hbv-dna。留取患者治療結束后的血清，凍存于-86 冰箱。用elisa法集中檢測icam-1. icam-3。1

11、.3 統(tǒng)計學處理計量資料用exd ± s表示，進行t檢驗、計量資料進行x 2檢驗，全部資料均用sas8. 1軟件處理。2 結果2. 1 dc疫苗治療前后病毒學應答情況 37例患者dc治療前后hbv-dna下 降2. ologl0的19例，有效率51.4%。見表1。表1 dc疫苗治療前后病毒學 應答情況2. 2 回輸后血清icam-1. icam-3的水平 見表2、表3。dc治療后有效者 19例,無效者18例，對兩組間icam-1. icam-3分別進行t檢驗,icam-1方差齊 性檢驗：p=0. 1372>0. 1,方差齊。t 檢驗：t=0. 33,df=31,p=0.

12、 7421>0. 05, 差異無顯著性。icam-3方差齊性檢驗：p=0. 1223>0. 1,方差齊。t檢驗： t=1.49,df=31,p=0. 1475>0. 05,差異無顯著性。表2 dc疫苗治療后血清 icam-1水平在兩組間比較 表3 dc疫苗治療后血清icam-3水平兩組間比較3 討論樹突細胞(dendritic cells, dc )是由美國學者steinman于1973年發(fā) 現(xiàn)的，是目前所知的機體內功能最強大的抗原提呈細胞57。dc是機體免疫 應答的始動者，在免疫應答的誘導中具有獨特的地位。它是抗原與t細胞之間的 “橋梁”，可通過mh

13、c i類和ii類分子遞呈病毒肽，從而激活cd4+t、cd8+t細胞。 但在慢性乙型肝炎病人中，dc在數(shù)量以及功能上都存在不同程度的改變，抗原提 呈及分泌細胞因子等功能受到不同程度的抑制。dc的質量及功能的改變會導致 thl/th2失衡及細胞免疫功能低下，這是引起hbv感染慢性化發(fā)生的主要原因8 。 在實驗通過體外分離、培養(yǎng)、擴增慢性乙型肝炎患者外周血的dc,以hbsag致敏, 制成特異性dc疫苗，經(jīng)皮下行自體回輸，觀察特異性dc疫苗治療前后患者 hbv-dna變化，發(fā)現(xiàn)37例慢性乙型肝炎患者中19例病毒載量下降2. ologlo, 有效率51.4% ( x 2=25. 56,p<

14、0. 001 )o提示特異性dc疫苗可有效降低慢性乙 型肝炎患者的病毒載量，為治療慢性乙型肝炎的有效方法之一。粘附分子(cell adhesion molecules, cam )是眾多介導細胞間或細胞與細胞外基質間相互接觸和 結合分子的統(tǒng)稱。cma以受體-配體結合的形式發(fā)揮作用，使細胞與細胞間，細胞 與基質間，或細胞-基質-細胞間發(fā)生粘附，參與細胞的識別，細胞的活化和信號 轉導，細胞的增殖與分化，細胞的伸展與移動，是免疫應答、炎癥發(fā)生、凝血、 腫瘤轉移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過程的分子基礎。根據(jù)其結構特 點可分為整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族、鈣粘蛋白家族及一些尚 未歸類

15、的粘附分子。主要功能為：(1)免疫細胞識別中的輔助受體和協(xié)同活化信 號；(2)炎癥過程中白細胞與血管內皮細胞粘附；(3)淋巴細胞歸巢等。icam-1 及icam-3隸屬于免疫球蛋白超家庭，icam-3是體內重要的協(xié)同刺激分子，介導t 細胞與抗原提呈細胞(apc )細胞之間的粘附及參與樹突細胞與t細胞相互作用， 誘導t細胞早期活化、粘附和增殖，在乙型肝炎的免疫過程中亦為重要角色。本 實驗顯示dc治療后血清中icam-1. icam-3在有效與無效兩組間比較差異無顯著 性(p> 0. 05 )o這與部分文獻描述不相符9, 10,提示icam-1. icam-3可能 不是影響dc疫苗治

16、療慢性乙型肝炎療效的主要因子，或是由于觀察例數(shù)較少，或 由于患者個人體質的差別等因素造成。人體免疫系統(tǒng)是一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，應 進一步做多因素研究，了解免疫細胞、免疫因子等諸多因素之間的交互作用?！緟⒖嘉墨I】1蒲驍麟，束永前，張錦英抗原負載的樹突細胞對細胞因子誘導的殺傷細胞的影響江蘇大學學報，2005, 15 ( 1 ): 6-9.2 李用國，羅云萍，蘭英華，等樹突細胞hbsag疫苗抗乙型肝炎病毒免疫的 體外研究中華傳染病雜志，2002, 20 ( 6 ): 333-336.3 佟立新，劉樹賢，郭力紅，等自體樹突細胞聯(lián)合抗病毒治療對hbv慢性感 染者的臨床效應世界華人消化雜志，2007, 15

17、 ( 11 )： 1232-1236.4 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會病毒性肝炎防治方案. 中華肝臟病雜志,2000, 8: 324-329.5 王全楚，聶青和樹突狀細胞實用肝臟病雜志，2003, 6 ( 3 ): 151.6 羅道升樹突細胞相關基礎研究進展國外醫(yī)學免疫學分冊，2005, 28 ( 1 ): 51-55.7 sk md fazle akbar,nor io hori ike,morikazu onj i .1mmune therapy inc1uding dendritic cel 1 based therapy in chronic hepatitis b virus infection.world j gastronterol,2006,12 ( 18 ) : 2876-2883.8 辛永寧，宣世英，孫櫻慢性乙型肝炎th1/th2細胞的免疫功能研究進展. 臨床肝膽病雜志，2005, 21 ( 3 ): 182-184.9 blei