植物抗病基因工程的基本原理與方法

1、編輯課件1 植物抗病基因工程是通過分子生物學技術獲得對植物病植物抗病基因工程是通過分子生物學技術獲得對植物病害（病毒、細菌、真菌、線蟲等病害）具有一定抗性的轉基害（病毒、細菌、真菌、線蟲等病害）具有一定抗性的轉基因植株。因植株。 1983年首例轉基因煙草問世。年首例轉基因煙草問世。 1994年首批轉基因作物如延熟西紅柿和抗除草劑棉花等獲得批準年首批轉基因作物如延熟西紅柿和抗除草劑棉花等獲得批準進行商品化生產。目前，國內外已報道的轉基因作物有進行商品化生產。目前，國內外已報道的轉基因作物有1 6種種70多個品系。多個品系。 自自1986年年3月以后，我國已研究的轉基因作物月以后，我國已研究的轉基

2、因作物47類，涉及的轉基因類，涉及的轉基因103種。正式公布的轉基因作物：棉花、大豆、西紅柿、青椒和矮牽牛。種。正式公布的轉基因作物：棉花、大豆、西紅柿、青椒和矮牽牛。 目前，已經商品化的轉基因作物所轉入的外源基因主要是抗性基目前，已經商品化的轉基因作物所轉入的外源基因主要是抗性基因，只有少數(shù)是改良作物品種性狀的。因，只有少數(shù)是改良作物品種性狀的。 編輯課件21.1 1.1 導入植物抗病相關基因和病原菌致病相關基因導入植物抗病相關基因和病原菌致病相關基因在植物抗性基因的利用方面在植物抗性基因的利用方面 根據(jù)已有的根據(jù)已有的R基因結構特征，設計新的基因結構特征，設計新的R基因?；?。 異源表達異

3、源表達R基因。基因。 向同一株植物中導入多個向同一株植物中導入多個R基因?；颉Ｔ诓≡鸁o毒基因的利用方面在病原菌無毒基因的利用方面 轉病原菌無毒基因。轉病原菌無毒基因。 將病原菌無毒基因和相應的將病原菌無毒基因和相應的R基因一起導入植物?；蛞黄饘胫参?。 導入與植物抗病信號有關的基因。導入與植物抗病信號有關的基因。編輯課件31.2 1.2 導入植物防衛(wèi)基因導入植物防衛(wèi)基因 Broglie(1991),et al. 在克隆菜豆幾丁質基因的基礎上將在克隆菜豆幾丁質基因的基礎上將CH5B基因修飾改造，通過基因修飾改造，通過Ti質粒轉化煙草，獲得幾丁質酶質粒轉化煙草，獲得幾丁質酶高效表達的轉基因植

4、株，具有協(xié)同拮抗枯萎病菌的效果。高效表達的轉基因植株，具有協(xié)同拮抗枯萎病菌的效果。 M.J.Carmona(1993),et al.，將來源于大麥基因組克隆的，將來源于大麥基因組克隆的硫素基因和來源于小麥硫素基因和來源于小麥cDNA克隆的硫素基因轉化到煙草中，克隆的硫素基因轉化到煙草中，獲得了對獲得了對P.s.pv.tabaci具有較高抗性的植株。具有較高抗性的植株。 美國孟山都（美國孟山都（Monsanto）公司將真菌編碼葡萄糖氧化）公司將真菌編碼葡萄糖氧化酶基因導入馬鈴薯中，獲得了對酶基因導入馬鈴薯中，獲得了對Ecc引起的細菌性軟腐病具引起的細菌性軟腐病具有良好抗性的植株。有良好抗性的植株

5、。編輯課件41.3 1.3 導入降解病原物致病因子基因導入降解病原物致病因子基因 H. Anzai(1989),et al.分離到了抗煙毒素（分離到了抗煙毒素（tabtoxin）的基因的基因ttr，將基因，將基因ttr與與CaMV 35S啟動子融合成嵌合基啟動子融合成嵌合基因，通過農桿菌介導的轉化法轉入煙草，獲得因，通過農桿菌介導的轉化法轉入煙草，獲得ttr高表達高表達量的轉基因植株，對煙毒素和病原菌的侵染均表現(xiàn)出良量的轉基因植株，對煙毒素和病原菌的侵染均表現(xiàn)出良好的抗性。好的抗性。 菜豆毒素（菜豆毒素（phaseolotoxin）是一種非寄主?；远荆┦且环N非寄主?；远舅?，產菜豆毒素的素，

6、產菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通過菌株通過argK基因基因合成一種不被菜豆毒素抑制的合成一種不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，從而對該毒酶，從而對該毒素不敏感。將素不敏感。將argK基因導入煙草和菜豆，獲得的轉基因基因導入煙草和菜豆，獲得的轉基因煙草和菜豆對煙草和菜豆對P.s.pv.phaseolicola有較高的抗性。有較高的抗性。編輯課件51.4 1.4 導入其它蛋白基因導入其它蛋白基因 賈士榮賈士榮,等等(1993)和和M.Hassan (1993),et al.向馬鈴薯向馬鈴薯導入導入cecropin基因后提高了馬鈴薯對青枯病的抗性?；蚝筇岣吡笋R鈴薯對青枯病

7、的抗性。 J.M.Jaynes(1993),et al.將將cecropinB基因導入煙草基因導入煙草后獲得的轉基因植株，提高了其對后獲得的轉基因植株，提高了其對R.solanacearum引起引起病害的抗性。病害的抗性。 黃大年黃大年,等等(1997)將將cecropinB和和cecropinD基因導入基因導入水稻幼胚，獲得的轉基因水稻植株可明顯地提高對水稻水稻幼胚，獲得的轉基因水稻植株可明顯地提高對水稻白葉枯病的抗性，同時也獲得了高抗水稻條斑病和水稻白葉枯病的抗性，同時也獲得了高抗水稻條斑病和水稻白葉枯病的高抗品系。白葉枯病的高抗品系。編輯課件6 至今已分離的供植物基因工程應用的目的至今已

8、分離的供植物基因工程應用的目的基因有基因有100多個，其中研究得比較多的是抗病毒、多個，其中研究得比較多的是抗病毒、細菌和真菌的基因，能殺死害蟲或使害蟲拒食的細菌和真菌的基因，能殺死害蟲或使害蟲拒食的基因，能抵抗各種除草劑的基因，能抗逆境如干基因，能抵抗各種除草劑的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高溫鹽堿等的基因，能提高植物體中旱、高寒、高溫鹽堿等的基因，能提高植物體中蛋白質含量或蛋白質品質的基因等等。這些基因蛋白質含量或蛋白質品質的基因等等。這些基因中有些是來自植物本身，有些來自微生物，還有中有些是來自植物本身，有些來自微生物，還有少數(shù)是人工合成的。少數(shù)是人工合成的。編輯課件72.1 2.1 目

9、的基因的分離和鑒定目的基因的分離和鑒定 對已知序列進行分子克隆對已知序列進行分子克隆 從蛋白質到基因序列從蛋白質到基因序列PCR擴增擴增構建構建cDNA文庫文庫構建基因組文庫構建基因組文庫 與已知基因緊密連鎖基因的分離與已知基因緊密連鎖基因的分離編輯課件8 根據(jù)植株或細胞表型變異進行基因分離根據(jù)植株或細胞表型變異進行基因分離轉座子標簽法轉座子標簽法圖位克隆法圖位克隆法基因挽救技術基因挽救技術基因組相減法基因組相減法cDNA差式顯示差式顯示轉座子導入細胞轉座子導入細胞目的形狀突變株目的形狀突變株構建核構建核DNA文庫文庫用轉座子序列作用轉座子序列作探針進行雜交探針進行雜交分析轉座子兩側序分析轉座

10、子兩側序列并以此作探針列并以此作探針野生型野生型細胞核細胞核DNA構建構建 核核DNA 文庫文庫完整的目的完整的目的性狀基因性狀基因轉座子標簽法流程圖轉座子標簽法流程圖編輯課件92.2 2.2 表達載體的構建表達載體的構建 目的基因分離后，往往需要經過修飾才能應用于目的基因分離后，往往需要經過修飾才能應用于植物基因工程。構建植物表達載體就是在目的基因的植物基因工程。構建植物表達載體就是在目的基因的5端加上啟動子，在基因的端加上啟動子，在基因的3端加上中止子，以便使外源端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表達，充分發(fā)揮其功能。基因能在植物中有效地表達，充分發(fā)揮其功能。加入啟動子區(qū)加入啟動

11、子區(qū) 目前植物基因工程中外源基因常選用的啟動子主要目前植物基因工程中外源基因常選用的啟動子主要有有3類：第一類是從類：第一類是從Ti質粒的質粒的T-DNA序列上分離的啟動序列上分離的啟動區(qū)。具有真核生物轉基因起始所需的區(qū)。具有真核生物轉基因起始所需的TATA盒和盒和CAT盒；盒；第二類是第二類是CaMV的的35S和和19S啟動子；第三類是從植物啟動子；第三類是從植物本身分離出來的啟動子。本身分離出來的啟動子。編輯課件10加入轉錄的加尾序列加入轉錄的加尾序列 真核生物為保證一個結構基因表達完全末端需要有真核生物為保證一個結構基因表達完全末端需要有一個加尾序列。其功能一方面保證轉錄的終止；另一一個

12、加尾序列。其功能一方面保證轉錄的終止；另一方面保證形成有活性的方面保證形成有活性的mRNA鏈。植物基因工程中常鏈。植物基因工程中常用的加尾序列是用的加尾序列是AATAAA。插入內含子插入內含子 內含子是真核生物基因組結構的特點之一。在基因內含子是真核生物基因組結構的特點之一。在基因工程中，多數(shù)不用在目的基因中插入這種片段就能得到工程中，多數(shù)不用在目的基因中插入這種片段就能得到有效的表達，因此，認為它是基因產物功能非必需的。有效的表達，因此，認為它是基因產物功能非必需的。但是在實際操作中，如果在目的基因適當?shù)奈恢貌迦脒@但是在實際操作中，如果在目的基因適當?shù)奈恢貌迦脒@種序列，其表達量可以提高幾十到

13、幾百倍。因此，有人種序列，其表達量可以提高幾十到幾百倍。因此，有人推測，內含子可能在基因翻譯中起增強子的作用。推測，內含子可能在基因翻譯中起增強子的作用。編輯課件11加入翻譯起始密碼子加入翻譯起始密碼子 由于植物中由于植物中mRNA的翻譯起始密碼子多數(shù)也是的翻譯起始密碼子多數(shù)也是AUG，因此，要在目的基因功能蛋白的編碼序列前加上適當?shù)囊虼?，要在目的基因功能蛋白的編碼序列前加上適當?shù)暮塑账嵝蛄?。核苷酸序列。加入終止密碼子加入終止密碼子 植物基因工程中所使用的植物基因工程中所使用的mRNA翻譯終止密碼子有翻譯終止密碼子有UAA、UAG、UGA三種。一般在目的基因功能蛋白的三種。一般在目的基因功能蛋

14、白的編碼序列后直接加上對應的堿基序列。實驗中通常采用編碼序列后直接加上對應的堿基序列。實驗中通常采用的是的是Ti質粒中的質粒中的Nos終止子。終止子。加入增強序列加入增強序列編輯課件12加入與植物中特定加入與植物中特定DNA同源的序列同源的序列 為了實現(xiàn)將目的基因和植物基因組有效整合，植物基因為了實現(xiàn)將目的基因和植物基因組有效整合，植物基因工程中常在目的基因兩端接上能和植物特定基因能整合的工程中常在目的基因兩端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以結合植物基因組表達調控規(guī)律，通過調整所加同面也可以結

15、合植物基因組表達調控規(guī)律，通過調整所加同源序列的堿基序列有效地控制外源基因的插入位點和表達源序列的堿基序列有效地控制外源基因的插入位點和表達時間，使目的基因更便于操作以及整合后更好地發(fā)揮作用。時間，使目的基因更便于操作以及整合后更好地發(fā)揮作用。加入報道基因加入報道基因 常用的報道基因：常用的報道基因：lacZ、ocs、cat、npt、lux和和gus編輯課件132.3 2.3 目的基因向植物的轉化目的基因向植物的轉化 近年來，植物的遺傳轉化技術得到了迅近年來，植物的遺傳轉化技術得到了迅速的發(fā)展，已建立了多種轉化系統(tǒng)，如以農桿速的發(fā)展，已建立了多種轉化系統(tǒng)，如以農桿菌菌Ti質粒及質粒及Ri質粒為

16、載體的轉化系統(tǒng)，以質粒為載體的轉化系統(tǒng)，以PEG介導的原生質化學導入法、電激法、基因槍法、介導的原生質化學導入法、電激法、基因槍法、花管導入法等等?？傊?，植物細胞遺傳轉化系花管導入法等等?？傊?，植物細胞遺傳轉化系統(tǒng)可分為兩大類：以載體為介導的基因轉化統(tǒng)可分為兩大類：以載體為介導的基因轉化（vector mediated gene transfer）和）和DNA直接直接轉化（轉化（naked DNA transfer）。）。 編輯課件142.4 2.4 轉化植物細胞的篩選及轉基因植物的鑒定轉化植物細胞的篩選及轉基因植物的鑒定 植物外植體經過農桿菌或植物外植體經過農桿菌或DNA直接轉化后，大部分直

17、接轉化后，大部分細胞是沒有轉化的，只有極少數(shù)是轉化的，這就需要采用細胞是沒有轉化的，只有極少數(shù)是轉化的，這就需要采用特定的的方式將未轉化細胞與轉化細胞區(qū)分開來，淘汰未特定的的方式將未轉化細胞與轉化細胞區(qū)分開來，淘汰未轉化的細胞，然后利用植物細胞的全能性在適宜的環(huán)境條轉化的細胞，然后利用植物細胞的全能性在適宜的環(huán)境條件下使轉化的細胞再生成可育的轉基因植株。件下使轉化的細胞再生成可育的轉基因植株。 目前，轉化細胞與非轉化細胞的區(qū)分及非轉化細胞目前，轉化細胞與非轉化細胞的區(qū)分及非轉化細胞的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草劑基因，總稱篩選的淘汰常采用抗菌素抗性基因及抗除草劑基因，總稱篩選標記。植物基因工程中常用的篩選標記是標記。植物基因工程中常用的篩選標記是npt（neomycin phosphotransferase）基因和）基因和cat（chloramphenicol acetyltr-ansferase ）基因）基因編輯課件15概概 況況 世界上已批準世界上已批準 進行商品化轉基因進行商品化轉基因作物：作物：大豆、玉米、棉花、大豆、玉米、棉花、 西