超全干細胞重點知識總結(jié)

1、第九章 干細胞第一節(jié) 干細胞概述一、干細胞 ( stem cells)與個體發(fā)育正常生物個體發(fā)育的過程是按嚴格的時空程序進行的一系列細胞分裂、分化和細胞凋亡相互協(xié)調(diào) 作用的結(jié)果。從一個受精卵、全能胚胎干細胞或組織譜系干細胞最終分化為具有獨特功能體細胞所組成的組織 器官 ,這是一個彼此協(xié)調(diào)而又制約的復(fù)雜過程, 這一過程通常被稱為發(fā)育的遺傳程序 (geneticprogram) , 被記錄在細胞基因組的結(jié)構(gòu)中。 不同物種有不同的遺傳程序 ,這可能是物種在長期進化過 程中逐漸形成的。在哺乳動物個體發(fā)育的不同階段 ,包括胚胎、 幼年和成年個體的各個發(fā)育時期 ,都存在著發(fā)育潛能參 差不同的干細胞。 干細

2、胞最終演變?yōu)楠毺亟Y(jié)構(gòu)和功能的體細胞或成熟生殖細胞,這過程即是所謂 細胞分化 。從分子水平而言 ,可以認為細胞分化是部分基因選擇性地被激活或差異性表達 ,從而控制 專一性蛋白質(zhì)的合成和排布的結(jié)果。 對正常細胞分化來說 ,最重要的是多個基因表達過程在數(shù)量和 時空上的精確聯(lián)系和密切配合 ,并受不同層次的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)精確無誤地調(diào)節(jié)和控制。 干細胞 在胚胎和成體組織內(nèi)部的活動 ,包括干細胞基本特性的分子機制和調(diào)節(jié)控制、胚胎細胞的遷移活 動、時空程序與相鄰胚胎細胞的相互作用,對細胞增殖和分化的關(guān)系等 ,雖已有所了解 ,但由于技術(shù)上的原因 ,直接證據(jù)還很少 ,因此 ,干細胞增殖和分化問題仍是今天發(fā)育生物

3、學(xué)研究的主題內(nèi)容之一.二、干細胞的定義和分類因干細胞是指一類具有 自我更新和產(chǎn)生分化后代 這兩種基本特性的細胞。 一個充滿生命力的雌雄兩性機體都是由兩類不同的組織和器官構(gòu)成的。一類是全部由體細胞組成 的 ,另一類是以生殖細胞為主的 ,也包括一些由體細胞組成的組織和器官構(gòu)成的。 前者是執(zhí)行機體生 命活動各種生理功能的 ;后者一切都為了保證生殖系統(tǒng)的卵巢和辜丸中的卵子和精子的發(fā)育和成 熟并延續(xù)生命的。 對人類來講 ,從一個受精卵的單細胞要產(chǎn)生 200 多種不同類別的細胞來構(gòu)成各種 組織和器官 ,必然要靠全能性的早期胚胎干細胞通過自我更新和產(chǎn)生分化后代來實現(xiàn)的。自我更新 是指干細胞可進行均等分裂 ,

4、產(chǎn)生兩個遺傳特性上完全一樣的干細胞,均等分裂是大多數(shù)細胞的特性 ,而產(chǎn)生分化后代 指的是干細胞還可進行不均等分裂,產(chǎn)生的兩個子代細胞中一個仍是干細胞 ,而另一個是遺傳特性有所不同的 ,要開始走上分化道路的定向祖細胞。早期胚胎細胞是全能的 ,它既可產(chǎn)生體細胞 ,又能產(chǎn)生生殖細胞 ,這包括從早期的卵裂球和囊胚期的 ICM 細胞以及后來胚胎的 3 個胚層已分化后的生殖嵴區(qū)的原始生殖細胞;而分化的后代細胞可從包括全能細胞向多能細胞和細胞譜系的各級祖細胞發(fā)展,這些細胞仍舊可通過均等和不均等兩種分裂方式進行繁殖 ,一直到最后的終未分化體細胞。干細胞可分為兩類 : 一類干細胞包括從早期囊胚 ICM (inn

5、er cell mass)細胞分離并在體外培養(yǎng)和建 系的 胚胎干細胞 (embryonic stem cells, 簡稱 ES 細胞 )和從胚胎生殖嵴 原始生殖細胞 (primordial germ cells, PGC) 分離建系的 胚胎生殖細胞 (embryonic germ cells, 簡稱 EG 細胞 ) ; 另一類是先在成年組織 和器官 ,以后在胎兒組織被證明其存在 ,隨后個別也在體外培養(yǎng)和建系成功的干細胞, 稱為 組織干細胞( tissue stem cells) ,又稱成體干細胞 (adult stem cells) 。三、胚胎干細胞研究簡史哺乳動物早期胚胎體積小 ,又在母體子

6、宮內(nèi)發(fā)育 ,因此 ,要在體內(nèi)對各類干細胞的分化及其機制進行 實驗研究幾乎不可能。 從 20 世紀 50 年代開始 ,人們一直在致力于尋找一個既能在體外增殖,又具有胚胎細胞全能性 (totipotency) 或多能性 的 (pluripotency) 并通過適當條件能被誘導(dǎo)分化為各種類型分 化細胞的實驗?zāi)Ｐ汀?20世紀 50年代末美國發(fā)育生物學(xué)家 Stevens (1967)將著床前發(fā)育階段的小鼠 胚胎(包括受精卵 ) 或 12 天胚齡的胚胎生殖嵴異位移植到同系成年小鼠辜丸或腎臟被膜下,移植后7 天 ,發(fā)現(xiàn)有 80%接種灶出現(xiàn)并發(fā)展為畸胎瘤。從中分離、培養(yǎng)和建立了胚胎性癌細胞 (embryona

7、lcarcinoma cell, EC)系 ,揭開了胚胎性干細胞早期研究的序幕。EC 細胞既具有惡性生長又具有早期胚胎細胞發(fā)育多潛能性的雙重性質(zhì)。 在 20 世紀 70 年代 , EC 細胞常用作研究哺乳動物發(fā)育遺傳以 及細胞分化的實驗?zāi)Ｐ?,并取得了一些重要結(jié)果。 后因 EC 細胞核型異常 ,分化細胞類型有限等缺點 而不再被使用。20 世紀 80 年代初 ,英國 Evans 和 Kaufman 以及美國 Martin 2 家實驗室獨立地從小鼠囊胚成功地建 立了能在體外不斷增殖 ,并維持不分化狀態(tài)的多潛能胚胎干 (ES)細胞系 ,開創(chuàng)了 ES 細胞生物學(xué)研究 的新時代。但此后 ES細胞在其他動

8、物上的分離和建系卻頗受挫折,直到 20世紀 80 年代后期才有所突破 ,見表 19.1。 20 世紀 90 年代初 ,美國 Matsui 等從小鼠 9 天胚胎生殖嵴建立了多潛能的胚胎 生殖細胞系 ,同一時期 ,少數(shù)其他動物也相繼建立了ES 或 EG 細胞系。 1998 年美國威斯康星大學(xué)Thomson 等人利用 36 枚新鮮或凍存的人工體外受精胚胎 ,獲得人 ICM 細胞 ,經(jīng)體外培養(yǎng)后 ,首次成 功地建立了 5 株人類 ES 細胞系 ,同年 , John Hopkins 醫(yī)學(xué)院 Shamblott 等人從 5 -9 周人流胚胎的生 殖嵴和腸系膜首次培養(yǎng)出人 EG 細胞系。第二節(jié) 胚胎干細胞胚

9、胎干細胞又稱 ES 細胞主要是指從早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM 細胞分離培養(yǎng)和建系的細胞。而從胚胎生殖嵴中 PGC分離培養(yǎng)建成的稱胚胎生殖細胞簡稱 EG細胞。這 2類干細胞統(tǒng)稱為胚胎 性干細胞 ,其最基本的重要特性是具有穩(wěn)定地在體外自我更新并保持不分化和發(fā)育的多能性,即可以在體外分化為屬于 3 個胚層的各種細胞。、ES和 EG細胞培養(yǎng)、建系技術(shù)體外培養(yǎng)建系 ES 和 EG 細胞的技術(shù)以小鼠的最為成熟 ,成功率最高 ,其基本原則是有賴于 獲得全能 性胚胎細胞或細胞團并建立體外適合其增殖和抑制分化的培養(yǎng)系統(tǒng) 。由于早期胚胎細胞離體后極 易發(fā)生分化 ,首先要解決阻止其分化、 確保維持其全能性或多能性

10、這一關(guān)鍵問題。 目前常用的細胞 分化抑制物主要有 3 種:飼養(yǎng)層細胞 ( feeder layer cells) 、特殊細胞的條件培液 (conditioned medium) , 如 BRL (Buffalo rat liver) 細胞條件培液 , 分化抑制因子 (differentiation inhibitory factor, DIF) , 如白血 病抑制因子 (leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外 ,也有添加通過 gp130 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細胞因子 , 例如 , 白介素 6 (lL 一 6)、 Oncostatin M 和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 (cil

11、iary neurotrophic factor, CNTF) 等同 樣可達到維持小鼠 ES細胞的不分化狀態(tài)。 因此,體外培養(yǎng) ES和 EG細胞可劃分為兩大類 :飼養(yǎng)層 培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。(一) 飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法不論 ES 細胞或 EG 細胞 ,原代或初期培養(yǎng)階段一般都需依賴于能分泌使它們在體外存活和增殖所 必需生長因子的飼養(yǎng)層細胞。不同類型的飼養(yǎng)層細胞分泌的生長因子略有不同。 但都要求在 ES或 EG細胞培養(yǎng)過程中的飼養(yǎng)層 細胞保持不分裂增殖 ,而仍然保持細胞的代謝活性。常用的飼養(yǎng)層細胞有下列兩種:一種是取自各種品系小鼠交配后 12 dpc (days post coitum ) 的胚

12、胎成纖維細胞 (embryonic fibroblast, MEF) 。經(jīng)絲 裂霉素 C (mitomycin C) 處理以終止細胞分裂后 ,用作 ES細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。 另一種是來自 SIM 小 鼠 (S)胚胎的對硫代鳥嘌嶺 (thioguanine, T)和烏本苷 (ouabain, O )有抗性的成纖維 STO細胞系 ,主要 分泌干細胞生長因子 (stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子 (LIF) 。此外,SL - M220 細胞是小鼠胚 胎造血的基質(zhì)細胞 SI/SI4 經(jīng)基因改造產(chǎn)生專一性跨膜型 SCF 的細胞系 ,以它作為飼養(yǎng)層更有利于 促進 EG細胞生長。用作

13、 ES細胞或 EG細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層的 MEF 或 STO細胞均需用 10 mg/L 絲 裂霉素 C在 370C滅活,用前經(jīng) PBS 徹底洗滌。(二) 無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法 飼養(yǎng)層細胞的制備在一定程度上使 ES和 EG 細胞培養(yǎng)過程顯得較為繁雜。 近來以添加某些特定細 胞的條件培養(yǎng)液和 LIF 生長因子至含胎牛血清 (FCS)的正常培養(yǎng)液 ,借此替代飼養(yǎng)層細胞。有 3 種 條件培養(yǎng)液可用于小鼠 ES細胞培養(yǎng) :直接在 ES 細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入重組生長因子和 LIF 等。 Buffalo 大鼠肝細胞條件培養(yǎng)液 (BRL-CM) 。 2 -3 周齡幼年大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液 (RH - CM) 。一般以

14、 2 -3份上述細胞條件培養(yǎng)液加 1 - 2 份新鮮的 ES細胞培養(yǎng)液 ,再添加 10% - 20%胎牛 血清 ,共同組合成無飼養(yǎng)層的 ES 細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。 但往往在胚胎干細胞原代和建系初期缺乏飼養(yǎng)層 時,用這種條件培養(yǎng)液培養(yǎng) ES 和 EG 細胞成功率不高 ,因此 ,正確使用飼養(yǎng)層細胞和條件培養(yǎng)液在 ES/EG 細胞建系初期仍是成功的一個關(guān)鍵因素。(三) ES和 EC 細胞的體外培養(yǎng)1. ES 細胞不同動物 ,甚至同種不同品系動物的胚胎發(fā)育速度和方式存在著較大差異,例如 ,豬 ICM 細胞生長與小鼠的不一樣 ,其生長速率很慢 ,且有一個休眠 (quiescent)時期。因此 ,ES 細胞培養(yǎng)

15、建系需根據(jù)各個 物種而選擇不同發(fā)育階段的早期胚胎。 例如,一般小鼠多選用 3 -4 d 的囊胚或 2 - 3 d的桑椹胚 ,豬取 8 - 10 d 的囊胚 , 綿羊取 8 -9 d 的囊胚 ,人和牛取 7 -8 d 的囊胚。同時 ,經(jīng)體外受精的胚胎或由核移植 獲得的重構(gòu)胚胎在體外培養(yǎng)至所需適當?shù)陌l(fā)育階段也是選取 ES 細胞培養(yǎng)的有效材料來源?；九囵B(yǎng)液為含 15% - 20% FCS 、0.1 mmol/L -疏基乙醇和 50IV/mL 青霉素、 50g/mL 鏈霉素的 DMEM 液 .將桑椹胚或囊胚接種于預(yù)先鋪有作為飼養(yǎng)層而無有絲分裂活性的單層MEF 細胞的 35mm 培養(yǎng)皿中。培養(yǎng) 2 -

16、3 天后按下列兩種方法之一分離出 ICM 細胞進一步培養(yǎng) : 方法一： 免疫手術(shù)法 (immunosurgery) 。由于 4 - 4.5 dpc 的小鼠囊胚主要由己分化的滋養(yǎng)外胚層 (trophectoderm) 和未分化的 ICM 細胞組成 ,前者細胞表面一般已表達主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility complex, MHC) , 能識別其相應(yīng)抗體和形成免疫復(fù)合物 , 在補體存在時可導(dǎo)致細胞 發(fā)生免疫溶解。 囊胚去除透明帶 ,直接暴露于稀釋的兔抗 JCR小鼠脾細胞抗血清 (抗 H - 2b) 。再移 到新鮮豚鼠血清中 , 囊胚的滋養(yǎng)外胚層細胞呈泡狀 ,發(fā)生

17、免疫溶解 ;而 ICM 細胞不具 H -2b 抗原 ,不 發(fā)生免疫溶解 ,故細胞完整元損。 ICM 細胞經(jīng) Hank's 液洗滌后 ,移至 96 孔鋪有 MEF 或 STO 飼養(yǎng)層 細胞和 DMEM 基本培液的板內(nèi)進一步培養(yǎng)。方法二 :常規(guī)培養(yǎng) 。桑椹胚或囊胚在鋪有 MEF 飼養(yǎng)層的 DMEM 基本培養(yǎng)液中 ,未去透明帶的桑椹 胚或囊胚培養(yǎng) 3 -4 d,ICM 細胞團從貼壁的囊胚內(nèi)長出來。 吸出 ICM 細胞團 ,用 0.25% (m/V) 膜蛋白 酶(trypsin)和 0.2 mmol/L EDTA 混合消化液在 370C消化 5 min.部分解離的細胞團移至鋪有 MEF 飼 養(yǎng)

18、層的 24 孔培養(yǎng)板 , ICM 細胞首先出現(xiàn)貼壁生長 ,繼續(xù)培養(yǎng) 4 d,可在一些孔內(nèi)見到巢狀集落生長的 ES細胞團。用胰蛋白酶消化巢狀 ES細胞團 ,并繼續(xù)培養(yǎng) ,一般 4 -5 d間隔用胰蛋白酶消化 ,克隆和 純化 ES細胞,視 ES細胞密度逐漸轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。ES 細胞在培養(yǎng)過程中 ,有時在巢狀干細胞團周邊出現(xiàn)少量分化細胞,這時除了需繼續(xù)維持飼養(yǎng)層細胞外 ,在培液中再添加適量的 LIF 生長因子 ,可克服細胞進一步分化的現(xiàn)象。 但有的物種例如豬 ICM 細胞對 LIF 并不敏感 ,難以抑制其在體外分化 ,巢狀集落形成率很低 , LIF 不適用。 ES細胞常用培養(yǎng) 基的添

19、加物除胎牛和小牛血清外 ,主要有多種生長因子 ,例如表皮生長因子 (ECF) , 可促進細胞 DNA 合成和 mRNA 轉(zhuǎn)錄,使細胞周期的 S期提前 ,周期縮短 ;胰島素樣生長因子 ( ICF)對ICM 細胞有促進 增殖作用 ; 干細胞生長因子 ( SCF)對干細胞有調(diào)控和促分裂作用 ,同時可抑制細胞凋亡。此外 ,在培 液中還需添加還原劑 -巰基乙醇 ,可使血清中的含硫化合物還原成谷胱甘肽,以消除 ES 細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒性過氧化物 ,同時 , -巰基乙醇有誘導(dǎo)細胞增殖和促進胚胎細胞貼壁作用。近來注 意到血清可抑制一些種類 ES 細胞形成克隆。因此 ,根據(jù)不同物種 ICM 細胞在體外生長狀

20、況 ,需要 對基本培養(yǎng)液中的各種添加物作適當調(diào)整。2. EG 細胞哺乳動物 PGC 細胞最早發(fā)生于近尿囊基部的卵黃內(nèi)胚層內(nèi) ,隨著胚胎發(fā)育和縱向轉(zhuǎn)折 ,卵黃囊的一 部分成為胚胎的后腸 ,PGC細胞也隨此經(jīng)背側(cè)系膜向生殖嵴移動。 因此, PGC 取材主要根據(jù)其在不 同物種的早期胚胎中所處遷移位置而定。小鼠 EG 細胞建系基本過程如下：收集 8. 5 - 10. 5 dpc 小鼠胚胎 ,在解剖鏡下用鑷子剖取包含原始 生殖細胞 (PGC)的生殖嵴組織，以 0.02% EDTA 液孵育含 PGC細胞的生殖嵴組織 , 37 0C , 15 min。 吸管輕吹打散 ,接種于鋪有 MEF 或 STO 飼養(yǎng)層

21、細胞的 4 孔培養(yǎng)板內(nèi)。 接種細胞首先出現(xiàn)貼壁生長 , 每天或隔天更換培養(yǎng)液。生殖嵴組織培養(yǎng)物在飼養(yǎng)層細胞上分裂增殖 ,4 - 6 d 后在顯微鏡下將包含 原始生殖細胞的細胞團用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至新的飼養(yǎng)層細胞上,繼續(xù)培養(yǎng)增殖。 重復(fù)用胰蛋白酶消化并移至新的飼養(yǎng)層細胞 ,經(jīng)過同上 2 -3次過程 ,一般可產(chǎn)生巢狀 (nests)生長的干細胞集落。 最 后將它轉(zhuǎn)移到鋪有飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)進一步擴增。 EG 細胞的飼養(yǎng)層常用 STO 細胞 ,培養(yǎng)液 基本同 ES細胞 ,但除 LIF 外還要添加干細胞因子 (SCF)和堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)。 二、ES和 EG 細胞系基本特性(一)

22、 體外能無限增殖建系后的 ES 細胞在體外培養(yǎng)不僅能存活 ,還能無限增殖 ,這是干細胞自我更新基本特性在體外培養(yǎng) 中的延續(xù)。假使在培養(yǎng)條件合適時 ,ES 細胞可以在體外無限增殖。但實際上 ,傳代次數(shù)愈多 ,ES 細 胞會像常規(guī)細胞一樣 ,出現(xiàn)核型不正常的情況 ,并失去了 ES 細胞原有的一些重要特性。 129 品系小 鼠的 ICM 細胞是非常容易建立的 ES 細胞系 ,而其他品系的小鼠就不那么容易了 ,說明遺傳因素是 制約 ES細胞建系成功與否的一個條件。 ES 細胞和 EG細胞來自不同的發(fā)育階段 ,在遺傳上是有區(qū) 別的,如 EG細胞的胰島素樣生長因子受體基因甲基化印記修飾等,這在人和其他大動

23、物可能一樣。豬 EG 細胞我們已建系成功 ,但豬 ES 細胞只能在體外短期存活 ,還未能建系。 關(guān)鍵可能還是培養(yǎng)系 統(tǒng)不合適。表明同一品系的 ES和 EG細胞的培養(yǎng)建系條件也并不相同。(二) 體外產(chǎn)生分化細胞ES 細胞的這個重要特性同樣是干細胞產(chǎn)生分化后代這個基本特性在體外培養(yǎng)中的延續(xù)。由于早期胚胎細胞離體后極易發(fā)生分化 ,因此,ES 和 EG 細胞體外培養(yǎng)的首要條件是建立適合其增殖、抑制 其分化、確保維持其多能性的培養(yǎng)體系。 ICM 細胞一般接種于鋪有滅活的小鼠 MEF 細胞作為飼 養(yǎng)層的瓊脂平板上 ,加有含抑制分化的 LIF 的培養(yǎng)液 ,或再添加適當?shù)姆只T導(dǎo)物質(zhì) (如維甲酸等 ) , 或

24、通過懸滴培養(yǎng)成擬胚體 (embryoid bodies, EB) 等特定的條件下 ,都極易分化產(chǎn)生包括 3 個胚層的 各種類型的分化細胞 ,常見的是幾種類型細胞混雜在一起 ,單一類型的細胞要靠定向誘導(dǎo)分化。EG細胞的分化細胞也屬于 3 個胚層的 ,但工作和分化細胞種類的報道都比較少見。從 1981-2003 這 20 余年中 ,這 2 類胚胎干細胞所分化的細胞都是體細胞, 未見有分化為生殖細胞的報道。這樣人們就自然形成了胚胎干細胞是" 多能性 " (pluripotency) 的概念。 2003-20XX 年國外發(fā)表了幾篇文章 ,證明體外培養(yǎng)的 ES 細胞能產(chǎn)生雌、雄兩性的

25、生殖細胞 ,過去要證明體外培養(yǎng)的 ES 和 EG 細胞是否具有發(fā)育全能性 ,要靠把帶有各種標記的干細胞注射至囊胚,再通過種系傳遞實驗先尋找干細胞嵌合到卵巢或辜丸的動物,再通過育種尋找干細胞參與卵子或精子的動物,并作純系繁育 ,對大動物來說 ,這種嵌合體實驗要花大量人力、 物力和二三年時間才能完成。 現(xiàn)在能在體外用 實驗證明培養(yǎng)的 ES 細胞具有發(fā)育為精子和卵子的能力 ,實現(xiàn)了體外培養(yǎng)的 ES 細胞也能表達 "全能 性 " (totipotency) 概念 ,這不能不說是 ES 細胞體外定向誘導(dǎo)分化的一個重大突破。目前個別實驗室 已先后得到相同的結(jié)論 ,今后若能有更多類似工作

26、的重復(fù)和考驗,必將使干細胞研究推向新階段。(三) 體內(nèi)產(chǎn)生畸胎瘤ES和EG細胞若接種于免疫缺損小鼠 (裸鼠或 SCID小鼠 )腋窩下 ,或接種于同種同基因小鼠的皮下、 眼窩和器官包膜下 ,均可形成由內(nèi)胚層、 中胚層和外胚層多種類型細胞構(gòu)成的畸胎瘤。 后者通過組 織學(xué)檢查 , 可以用作分析和鑒定 ES 或 EG 細胞的發(fā)育多潛能性 ,判斷所產(chǎn)生分化細胞種類的多寡。（四）巢狀生長有多能胚胎干細胞分子標記ES和 EG 細胞在體外彼此呈現(xiàn)單層或多層緊密堆積,而形成島狀或巢狀集落群體的生長形態(tài)。 將這種島狀或巢狀群體細胞的克隆挑出 ,用胰蛋白酶輕度消化后接種于新的飼養(yǎng)層或特定的條件培養(yǎng) 液中,繼續(xù)培養(yǎng)

27、3 -4 天后,分散的 ES細胞或 EG 細胞又重新長出彼此緊密接觸的島狀或巢狀群體細 胞克隆。根據(jù)經(jīng)驗 ,用 dispase酶代替胰蛋白酶消化可使 EG 細胞少受損傷 ,集落形成率較高。因此 , 呈巢狀集落生長是 ES和 EG 細胞最具特征性的生長方式。 但是,不同動物 ES和 EG 細胞巢狀集落 是有所不同的。 例如,豬 EG細胞也有自身的形態(tài)學(xué)特性 ,豬 EG 細胞集落常是圓的 ,比小鼠 ES和 EG 細胞集落較扁平和較不透明。在掃描電鏡中,豬 EG 細胞彼此比小鼠的更具有粘附性 ,難以解離 ,再培養(yǎng)的種植率也比大多數(shù)小鼠 ES和 EG細胞的低得多。 小鼠、豬和包括人類在內(nèi)的靈長類動物的

28、ES 和 EG 細胞都具有特征性的多能胚胎干細胞的分子標記 , 主要的分子標記列于表 19.2.除牛的 ES 細胞不表達堿性磷酸酶 （AKP） 活性外 ,其他動物和人的 ES 或 EG 細胞都表達 AKP 的活 性。分化的 ES 或 EG 細胞都不表達 AKP 。因此 ,AKP 活性可作為 ES或 EG 細胞是否分化的重要 標記之一。胚胎發(fā)育階段特異性抗原 （stage specific embryonic antigen, SSEA ）是早期胚胎細胞表面 的一類糖蛋白 ,不同種類的 SSE A 因糖基化不同而區(qū)分為 SSE A -1、SSEA -3 和 SSE A -4不同的表 位分子。未分

29、化的早期胚胎細胞 SSEA 呈陽性 ,而分化的細胞為陰性。人和靈長類ES 細胞表達SSEA -3 和 SSEA -4,而 SSE A-1 僅在人 EG 細胞及剛開始分化的 ES細胞中表達。小鼠的 ES和 EG 細胞只表達 SSE A-1.腫瘤相關(guān)抗原 （tumor related antigen, TRA ）是一種對唾液酸酶敏感的細胞表面糖蛋白,生殖細胞腫瘤標記 （germ cell tumor marker, GCTM ）是另一類抗原決定簇不同于 TRA 的細胞表面糖蛋白。人及猴 的 ES 細胞 與 TRA -1 -60 、 TRA -1 - 80 和 GCTM -2 抗體均可起反應(yīng)。人與猴

30、是近親 ,因此 ,人與猴 的 ES細胞都表達 TRA 分子,而嚙齒動物小鼠卻缺 （見表 19.2） ,推測 TRA 可能是靈長類多能胚胎干 細胞特異性的分子標記。Oct -4 是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子 ,在小鼠胚胎發(fā)育早期、生殖細胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能胚胎干 細胞中特異地表達 ,被認為是全能和多能性的一種標志基因。小鼠、 豬和包括人類在內(nèi)的靈長類動物的 ES和 EG 細胞都表達 Oct - 4（表 19.2） 。（五）染色體數(shù)目和核型正常 無論是小鼠或人的 ES 和 EG 細胞 ,經(jīng)體外傳代培養(yǎng)后 ,具有正常的染色體數(shù)目和二倍體核型 ,即使凍 存復(fù)蘇后應(yīng)仍然保持這種特性。這里,凍存與復(fù)蘇的條件

31、是非常重要的 ,對不同的 ES 和 EG 細胞都應(yīng)專門做實驗尋找最合適的凍存和復(fù)蘇的條件。 新建立的 ES 細胞系常有不正常的核型 ,因此,需對 新建系的 ES 細胞進行染色體數(shù)目和核型進行分析確認,特別是為遺傳操作所用的 ES 細胞,染色體數(shù)目和核型必須正常。同時 ,與普通培養(yǎng)細胞一樣 ,ES 和 EG 細胞經(jīng)體外長期培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇和 傳代,染色體和核型也會發(fā)生變化。 因此,長期培養(yǎng)的 ES和 EG 細胞也應(yīng)做染色體數(shù)目和核型檢查。（六）遺傳可操作性ES細胞遺傳操作的可行性是由于 ES 細胞在體外可以不斷地自我增殖 ,又是具有發(fā)育的全能或多能 性 , 并能通過構(gòu)建嵌合體而產(chǎn)生有功能的生殖細

32、胞。這為通過基因工程途徑改造物種提供了獨特 的、無與倫比的受體細胞 ,小鼠的 ES 細胞的實踐也證明了這一點。一般體細胞由于增殖能力差 , 基因修飾或改造的效率比 ES細胞的低得多。 ES細胞遺傳操作主要有 2 類方法：一是通過同源重 組技術(shù)去剔除 ES細胞基因組的一個目的基因 ,所謂基因剔除 （knock out）途徑 ,其二是轉(zhuǎn)染一個外源 基因定點整合到 ES細胞基因組的正確位置 ,即所謂基因定點敲入 （knock in） 技術(shù)。常規(guī)基因隨機整 合技術(shù)缺點很多 ,不僅易導(dǎo)致內(nèi)源有利基因結(jié)構(gòu)失活和破壞,或者激活有害基因 （如癌基因等 ）。而且導(dǎo)入的外源基因的表達水平也難以預(yù)測,導(dǎo)致可能產(chǎn)生異

33、常表型的轉(zhuǎn)基因動物。總之ES 細胞的遺傳可操作性已成為胚胎干細胞生物學(xué)的另一重要的特性。（七）形成嵌合體實現(xiàn)種系傳遞參與嵌合體實現(xiàn)種系傳遞是 ES 細胞生物學(xué)的又一重要概念。這在前面已有提及,只有通過形成嵌合體實現(xiàn)種系傳遞即要分析干細胞是否能參與形成生殖腺中卵子和精子才能鑒定體外培養(yǎng)建系的 ES 和 EG 細胞是否具有全能性。自從 20 世紀 80 年代初小鼠胚胎干細胞建系以來 ,這技術(shù)是一直 被沿用的 ,但小鼠 ES細胞的生殖細胞嵌合率要高于小鼠EG 細胞很多 ,其他動物的這類嵌合率與小鼠 ES 細胞相比較的材料也沒有。對大多數(shù)動物而言從胚胎的 ICM 細胞和胚胎生殖嵴原始生殖細胞得到的體外

34、培養(yǎng)建系的 ES 和 EG 細胞都應(yīng)具有上列 7點基本特性 ,這也是 ES 和 EG 細胞建系的鑒定指標。人 ES和 EG 細胞除 了第七點因倫理道德原因不能實施外基本上也具有上述基本性質(zhì)。三、ES和 EG 細胞定向誘導(dǎo)分化(一) 基本原理 細胞誘導(dǎo)分化是一個細胞與其微環(huán)境相互間復(fù)雜而又精密協(xié)調(diào)的分子細胞學(xué)過程 。早在 20 世紀 六七十年代前 ,實驗胚胎學(xué)家就發(fā)現(xiàn)蛙類早期原腸胚 (gastrula)的背唇 (dorsal lip) 的背方區(qū)域能夠誘 導(dǎo)外胚層分化為神經(jīng)管 ,而靠近腹側(cè)面則誘導(dǎo)出尾部結(jié)構(gòu)。 接著又發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育中組織發(fā)生和身體 構(gòu)造形成是一連串的誘導(dǎo)連鎖過程 ,例如神經(jīng)組織聽囊形

35、成后 ,則誘導(dǎo)鄰近的間質(zhì)細胞形成軟骨囊 ; 水晶體則剌激覆蓋的外胚層誘導(dǎo)出角膜。在體胚胎的細胞分化過程中 , 誘導(dǎo)作用的結(jié)果不只是決定于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和專一性,同時也決定于被誘導(dǎo)細胞的反應(yīng)能力 ( competence) ,后者受遺傳、發(fā)育潛能等內(nèi)在因素的限制。誘導(dǎo)物質(zhì) 的專一性和被誘導(dǎo)細胞的反應(yīng)能力必須在時空上相互巧妙配合,才能保證被誘導(dǎo)細胞按預(yù)定的細胞類型方向分化。 ES 細胞是體外研究誘導(dǎo)分化的較理想的模型。 其在體外被誘導(dǎo)分化的途徑可能 不一定與在體胚胎細胞的完全相同 ,但在實驗操作時 ,也應(yīng)同時考慮誘導(dǎo)物的性質(zhì)和 ES 細胞本身所 具的反應(yīng)能力這兩個基本問題。在胚胎細胞被誘導(dǎo)分化

36、實驗中 ,所用誘導(dǎo)物質(zhì)種類繁多 ,誘導(dǎo)模式也不盡相同 ,難以歸類論述。但按 作用機制大致可分為兩類。一類是使被誘導(dǎo)細胞可逆性地輕度損傷:例如無機物、有機酸、醇、亞甲基鹽、 硫氫化物、 氨水甚至蒸餾水或缺鈣的鹽水 ,都能使兩棲類胚胎細胞滲透壓改變致成輕度損 傷,導(dǎo)致神經(jīng)細胞分化。 另一類誘導(dǎo)物 ,如類固醇激素、 維甲酸衍生物 (RA 等) ,多肽生長因子 (bFGF、 TGF、Activin) 等 ,則是通過其與被誘導(dǎo)細胞表面各自的受體結(jié)合而介導(dǎo)的細胞誘導(dǎo)分化。同一種誘導(dǎo)物可以誘導(dǎo)出不同類型細胞或變化多端的構(gòu)造,問題較復(fù)雜 ,不僅涉及誘導(dǎo)劑的濃度差別、 誘導(dǎo)作用模式和微環(huán)境的未知因素等 , 而且

37、也可能與被誘導(dǎo)細胞本身的發(fā)育潛能和對誘導(dǎo)劑的反應(yīng)性 等差別有關(guān)。ES和 EG 細胞定向誘導(dǎo)分化是當前 ES細胞生物學(xué)研究中的熱點之一。(二) 定向誘導(dǎo)分化的類型 體外定向誘導(dǎo)分化可分為 譜系分化 (lineage differentiation) 和 定向分化 (committed differentiation) 兩 種類型 ,第一種譜系分化包括 ES 細胞經(jīng)譜系祖細胞 (lineage progenitors) 、譜系定型細胞 (lineage committed cell) 到終末分化細胞的整個細胞分化的全過程。在這過程中, 會出現(xiàn)一些不穩(wěn)定的、過渡型的前體細胞。 研究和分析這種過渡型的

38、前體細胞 ,對認識組織譜系細胞的分子和細胞水平分化 機制和全過程是有幫助的。但因為細胞呈一過性或連續(xù)性,定性和判斷的標準尚有待探索。同時,由于 ES 細胞也是一種具有不受約束的和無序的自我發(fā)育特性 , ES 細胞在體外被誘導(dǎo)時常同時出 現(xiàn)不同胚層類型的多種分化細胞 ,這也增加了識別譜系祖細胞和譜系定型細胞的困難性。譜系誘導(dǎo)分化的途徑可用于細胞分化的基礎(chǔ)研究，但有關(guān)報道并不多。第二種定向分化則要設(shè)法控制 ES 細胞導(dǎo)向產(chǎn)生單一類型的終末分化細胞 ,這是當今臨床細胞移植或細胞治療迫切需要的,也是至今報道較多的 ,但仍未完全解決的、探索中的難題。根據(jù)國外報道和我們的經(jīng)驗,對 ES 細胞轉(zhuǎn)染細胞專一的

39、轉(zhuǎn)錄因子、 標志基因或有關(guān)細胞分化因子等遺傳操作,并結(jié)合報道基因和添加特定細胞因子誘導(dǎo)條件選擇等手段 ,可能是探索 ES 細胞定向誘導(dǎo)分化的一條有效途徑。(三) ES細胞體外誘導(dǎo)分化的基本途徑1.單層 ES 細胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 單層 ES細胞在撤除 LIF 并添加適當濃度的細胞分化誘導(dǎo)劑 ,如維甲酸 (retinoic acid, RA) , 二甲亞砜 ( DMSO) 和環(huán)六亞甲基雙乙酰膠 (HMBA) 等并添加適當?shù)纳L因子條件下 ,每隔 2 天 ,更換含誘導(dǎo)劑 的新鮮培養(yǎng)液。細胞分化類型隨誘導(dǎo)劑和生長因子性質(zhì)及其濃度 ,細胞濃度 ,培養(yǎng)條件等因素 ,特別 是 ES 細胞本身的分化潛能和特性

40、而異。通常單層培養(yǎng)的 ES 細胞較難分化為單一類型的細胞 , 常 出現(xiàn)以某種類型分化細胞為優(yōu)勢的情況下,雜有一些其他類型的分化細胞。 因此 ,單層 ES 細胞培養(yǎng)途徑的定向誘導(dǎo)分化已不多見。2. ES 細胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化 通過形成擬胚體方式是目前 ES 細胞定向誘導(dǎo)分化的最基本的常用途徑。 有兩類方法可使 ES 細胞 形成擬胚體。(1)軟瓊脂培養(yǎng)ES 細胞經(jīng)胰蛋白酶消化 ,吹打成單個細胞 ,接種于預(yù)先以軟瓊脂鋪底的培養(yǎng)皿內(nèi) ,ES 細胞呈懸浮生 長,增殖 ,彼此粘附聚集而形成擬胚體。(2)懸滴培養(yǎng)ES細胞經(jīng)胰蛋白酶消化 ,制備成單個細胞懸浮液 ,滴種在直徑為 10 cm 培養(yǎng)皿的蓋子上

41、,制成許多懸 浮細胞小滴 ,培養(yǎng)皿內(nèi)加入適量 PHS,然后小心蓋上帶有許多小滴的蓋子 ,使蓋子上的許多小滴倒置 成懸滴。培養(yǎng)皿邊緣用 parafilm 封起來 ,避免小滴枯干 ,置 370C ,5% CO 2培養(yǎng)箱。培養(yǎng) 3天后,懸滴 中的 ES細胞聚集形成擬胚體。將擬胚體移至含細胞分化誘導(dǎo)劑(如 RA)的培養(yǎng)皿或微孔板進一步培養(yǎng)。然后移放人鋪有0.1% 白明膠的培養(yǎng)皿或微孔板內(nèi) ,在含有或不含細胞分化誘導(dǎo)劑 ,并缺乏LIF 的培養(yǎng)液中進一步培養(yǎng) ,可被誘導(dǎo)分化為不同類型的細胞 ,除了直接分化為終末分化細胞外 ,也 可能在適當?shù)臈l件下 ,先分化為過渡型的前體細胞或組織譜系干細胞。懸滴培養(yǎng)法形成

42、的擬胚體的形狀和大小較軟瓊脂層上的更為完整均一,重復(fù)性也很好。(四) ES細胞體外誘導(dǎo)分化的幾種細胞 人類 ES/EG 細胞建系成功 ,各國科學(xué)家正借鑒小鼠 ES 細胞體外誘導(dǎo)分化的成功經(jīng)驗 ,致力于將人 ES 細胞改造成以臨床基因、 細胞治療和組織工程種子細胞為目的的各種定向誘導(dǎo)分化細胞研究。 有關(guān)體外誘導(dǎo)分化的報告仍以小鼠 ES 細胞為模型的居多 ,而且大多還是偏重于混合型分化細胞的 描述性資料。 目前至少有 20余種從 ES 細胞誘導(dǎo)分化而來的體細胞在多家實驗室獲得成功,特別是近年幾篇有關(guān) ES 細胞在體外可分化為生殖細胞的報道,從實驗上證明了 ES 細胞的全能性的性質(zhì)(表 19.3)

43、。ES 細胞研究中 ,造血細胞 (hematopoitic cell) 是報道最多的一種分化細胞類型。小鼠 ES 細胞擬胚體 在體外可分化為類似于早期胚胎卵黃囊血島樣的結(jié)構(gòu),分化產(chǎn)生紅細胞、 髓細胞和淋巴細胞等各種造血系統(tǒng)的細胞。 一般常采用分階段誘導(dǎo)小鼠 ES細胞分化為造血干細胞和 B 淋巴細胞 :首先使 ES 細胞發(fā)育成擬胚體 ,然后,用胰蛋白酶消化成單個細胞 ,經(jīng)干細胞因子 (SCF)、血小板生成素 ( TPO)和 胚胎細胞的條件培養(yǎng)液處理 ,使其定向分化為造血干細胞 ;再用原代骨髓基質(zhì)細胞作飼養(yǎng)層和SCF及 IL-6 細胞因子處理 ,可進一步使 ES 細胞來源的造血干細胞分化為 B 淋

44、巴細胞系。根據(jù)小鼠 ES 細胞體外分化為造血細胞的研究 ,發(fā)現(xiàn) ES 細胞體外分化為造血細胞體系一系列發(fā)育順序類似于在 體胚胎的發(fā)育過程。在體胚胎研究表明, 7.5 d 的小鼠胚胎最初在卵黃囊 (yolk sac)內(nèi)出現(xiàn)大而有核的前成紅細胞。當胚胎長至 10 -12 d 肝形成時 , 則卵黃囊前成紅細胞逐漸消失。這表明胚胎造血 器官是從卵黃囊轉(zhuǎn)移到胚胎肝臟的。 而在 ES細胞體外分化實驗中 ,生長 4d 的擬胚體首先出現(xiàn)前成 紅細胞 ,擬胚體生長至第 10 -12 d 時前成紅細胞逐漸消失。成熟紅細胞和成髓細胞都是在前成紅細 胞出現(xiàn)后不久才產(chǎn)生。利用骨髓基質(zhì)細胞或其條件培養(yǎng)液,可以誘導(dǎo)小鼠 E

45、S 細胞在體外分化為造血干細胞。這一重要進展為分析研究 ES 細胞分化為造血干細胞的早期決定以及分化機制和過程 提供了實驗?zāi)Ｐ?。小鼠在體胚胎的卵黃囊血島內(nèi) ,前成紅細胞的產(chǎn)生總是伴隨著內(nèi)皮細胞的出現(xiàn),因而普遍認為內(nèi)皮細胞和前成紅細胞來源于共同的祖細胞。同樣 ,ES 細胞體外分化時 ,擬胚體的血島樣結(jié)構(gòu)中前成紅 細胞集落周圍也有內(nèi)皮細胞出現(xiàn)。 ES 細胞衍生的擬胚體分化的管狀結(jié)構(gòu)是由內(nèi)皮細胞排列組成的 管道內(nèi)還含有一些造血細胞 ,類似于胚胎發(fā)育中的早期血管發(fā)生。 近年 ,筆者實驗室利用具過度表達 轉(zhuǎn)化生長因子 1 (transforming growth factor 1 , TGF 1)的小鼠

46、 ES 細胞 ,在含維甲酸 (RA) 培養(yǎng)液中 經(jīng)懸滴培養(yǎng)先形成擬胚體 , 再繼續(xù)貼壁培養(yǎng) ,發(fā)現(xiàn)擬胚體周圍呈輻射狀長出許多血管樣結(jié)構(gòu)。表明 ES細胞中過度表達的 TGF 1在血管形成中起著重要作用。利用外源重組TGF1 添加至培養(yǎng)液 ,同樣也能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞組成的血管樣結(jié)構(gòu)。血管發(fā)生是一個極為復(fù)雜而有序的細胞生物學(xué)過程。TGF 1 是血管發(fā)生中的重要調(diào)節(jié)因子 ,但在體外也可抑制內(nèi)皮細胞增殖 ;另一方面 ,細胞外基質(zhì)成 分的結(jié)構(gòu)三維性 (立體 )對內(nèi)皮細胞粘附、伸展、移動、增殖和生物合成都有明顯效應(yīng)。將ES 細胞單層培養(yǎng)在含重組 TGF1的 I型膠原蛋白為基質(zhì)的三維系統(tǒng)內(nèi) ,或直接將過度表達 T

47、GF1的 ES 細胞單層培養(yǎng)在 I 型膠原蛋白為基質(zhì)的三維系統(tǒng)內(nèi)都能獲得內(nèi)皮細胞組成的血管樣結(jié)構(gòu),而缺乏重組 TGF 1 處理或無過度表達 TGF 1 的正常 ES 細胞在 I 型膠原蛋白為基質(zhì)的三維系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng) , 都不能形成血管樣結(jié)構(gòu)。 因此,TGF1可能是通過細胞外基質(zhì)行使其形成血管的功能;此外 ,用重組TGF1 處理的 ES 細胞中 ,能檢測到堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)基因表達 ,所以 ,TGF 1 可能 調(diào)節(jié) ES 細胞和 /或其分化細胞的 bFGF 基因表達。從而提示 bFGF 可作為血管內(nèi)皮細胞的生長因 子之一 ,促進內(nèi)皮細胞分化和形成血管。單層培養(yǎng)的小鼠 ES細胞的誘導(dǎo)

48、分化實驗中 ,在10mol/L 維甲酸 (RA)與1 mmol/L 雙丁酰基環(huán)腺昔 磷酸 (dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, dBcAMP ) 共同作用下 ,90% -95% 的分化細胞為神經(jīng) 膠質(zhì)細胞。小鼠 ES 細胞也可在體外被誘導(dǎo)分化為少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞 (oligodendrocytes ) 和運動神經(jīng) 元。 ES細胞擬胚體在特定條件貼壁培養(yǎng)時也能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。用懸浮培養(yǎng)4 d 的擬胚體在含 RA 的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng) 4 d,再使擬胚體貼壁培養(yǎng)則可高效重復(fù)地分化出神經(jīng)細胞, 不僅表達專一性的神經(jīng)微絲 M 和 微管蛋白 ,還有鈉、鉀、

49、鈣等離子信號通道的特征。分化的神經(jīng)細胞還表 達神經(jīng)遞質(zhì) GABA 、 glycine 和受體 NMDA 等不同物質(zhì)。甚至在體外誘導(dǎo)分化早期的擬胚體中檢 測到神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的共同前體細胞的專一性標志巢蛋白 (nestin) 。用 RA 誘導(dǎo) ES 細胞分 化為表達 -氨基丁酸的神經(jīng)細胞植入 Huntington's 病 (一種遺傳性舞蹈病 )大鼠模型體內(nèi) ,具有神經(jīng) 細胞功能的移植物使患鼠癥狀有所改善,并存活了 6 周。因此 ,ES 細胞體外誘導(dǎo)分化細胞有可能成為臨床細胞治療的移植物來源的新途徑之一。 這些工作都表明通過用某一簡單的化合物,有可能激活 ES 細胞基因組中一套僅用于神

50、經(jīng)細胞分化的基因, 而抑制了沿著其他細胞類型分化途徑中應(yīng)表達的基因。 近年來 , ES細胞在體外定向分化為多巴膠能神經(jīng)元已取得了重大突破,這對神經(jīng)發(fā)生的基礎(chǔ)研究和臨床神經(jīng)細胞移植具有極重要的意義。懸浮或懸滴培養(yǎng)的小鼠 ES 細胞的擬胚體在 RA 誘導(dǎo)條件下貼壁生長數(shù)天 ,常出現(xiàn)某些分化細胞集 落具節(jié)律性自發(fā)收縮現(xiàn)象 ,顯然是肌細胞。 電鏡觀察證實 ,收縮的細胞內(nèi)存在著肌原纖維、 肌小節(jié)和 閏盤等典型心肌細胞特有結(jié)構(gòu)。 發(fā)現(xiàn)心肌細胞分化過程中 ,分化細胞團剛開始收縮時 型肌球蛋白 重鏈 (MHC) 表達占優(yōu)勢 ,繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)天 ,則型 MHC 逐漸占優(yōu)勢 ,最終在分化的心肌細胞中 ,27 %表 達

51、型 MHC ,33 % 同時表達 和型MHC ,40 % 表達型 MHC 。這種 MHC 亞型的轉(zhuǎn)變與在體 胚胎心肌發(fā)育過程極相似。除心肌細胞外,決定骨骼肌發(fā)育的基因 myf-5 、 myogen in , myoD 等在ES 細胞擬胚體的分化細胞中都能夠表達 ,而且表達時序與在體胚胎發(fā)育中相同。 ES細胞擬胚體貼 壁培養(yǎng) 1- 2 周后一般都能出現(xiàn)肌細胞 ,繼續(xù)培養(yǎng)則融合成肌管 ,顯示出骨略肌發(fā)育的典型特征。分 化的肌細胞常表達成熟肌細胞專一的Ca2+信號通道和煙堿受體 (nicotinic receptor) 。二甲亞砜誘導(dǎo)ES 細胞擬胚體可形成心肌、平滑肌和骨倍肌等多種類型肌細胞,用肌肉

52、專一性的調(diào)節(jié)因子 myoD基因轉(zhuǎn)染 ES 細胞并結(jié)合 DMSO 誘導(dǎo)處理 ,額外表達 myoD 基因的 ES 細胞 ,則主要分化為骨骼肌 , 沒有心肌和平滑肌類型細胞出現(xiàn) ,且骨骼肌常融合形成肌管。 因此,看來通過改造 ES 細胞某種基因 和給予適當培養(yǎng)條件的途徑 ,是誘導(dǎo) ES 細胞向特定單一類型細胞分化的可行方法之一。小鼠 ES細胞或 EG 細胞通過懸滴培養(yǎng)法 ,形成的擬胚體被轉(zhuǎn)移到鋪有瓊脂的培養(yǎng)皿中,懸浮培養(yǎng) 3 d, 每天更換含有誘導(dǎo)劑二甲亞砜 (DMSO) 的培養(yǎng)液。 3 d 后,經(jīng)過誘導(dǎo)劑處理的擬胚體移人表面事先用明膠 (gelatin) 包被的培養(yǎng)皿中進一步貼壁培養(yǎng)。這時給培養(yǎng)液

53、中加入胰島素、三腆甲腺原氨酸 (triiodothyronine) 和胎牛血清 ,10 -15 d 后大部分擬胚體分化為脂肪細胞。 脂肪細胞中的脂滴含有甘 油三酯 (triglycerides) ,很容易用油紅 O (oil red O)染色鑒定 ,顯示特異性紅色。筆者實驗室曾用RA替代二甲亞砜誘導(dǎo)劑 ,其余條件同上 ,約 60%以上的 EG 細胞擬胚體可被誘導(dǎo)分化出脂肪細胞。 ES 細胞誘導(dǎo)分化為軟骨細胞的條件較為苛刻,一般成功率也較低。 小鼠 ES 細胞通過形成擬胚體并結(jié) 合添加轉(zhuǎn)化生長因子家族 (如 TGF1 ,BMP-2 和 BMP-4) 可誘導(dǎo)分化為表達軟骨相關(guān)基因和蛋 白的軟骨細胞

54、。 ROSA -geo 基因轉(zhuǎn)染的小鼠 ES 細胞 ,在缺乏 G418 的情況下聚集成擬胚體。用 10%小牛血清代替胎牛血清 ,培養(yǎng)液中含有分化誘導(dǎo)劑 1 mol/L 地塞米松 (dexamethasone) ,2 - 3 d 更換培養(yǎng)液 ,50 d后,這種擬胚體發(fā)育成軟骨細胞 ,經(jīng) Alcian blue 液染色 ,顯示出明確的軟骨細胞特征 細胞間存在著 11 型膠原。小鼠 ES 細胞經(jīng)過擬胚體階段 ,結(jié)合無血清和多種生長因子、 有絲分裂原處理 ,可被誘導(dǎo)分化為分泌 胰島素的、類似胰島的結(jié)構(gòu)。近來利用人 ES 細胞經(jīng)過懸浮培養(yǎng)獲得胚體 ,再經(jīng)如 bFGF 等生長因 子誘導(dǎo)可分化為以產(chǎn)生胰島素

55、為特征的胰島 樣細胞 ,為臨床糖尿病的細胞治療提供了 細胞來源打下基礎(chǔ)。ES 細胞定向誘導(dǎo)分化為肝細胞已有少數(shù)幾篇報道。國內(nèi)蒯小玲等成功地用RA、肝細胞生長因子(HGF)、-神經(jīng)生長因子 (- NGF)共同添加至細胞培養(yǎng)液 ,被誘導(dǎo)分化細胞從形態(tài)學(xué)、 生化和肝細 胞功能性標記等指標都證明是具有功能性的肝細胞。 但僅使用 RA, 雖能分化為上皮樣細胞 ,可是并 不表達各種肝功能的生化指標 ,例如,白蛋白、 AFP、G-6-P、1-AT、肝核因子 -4 和 SAPK/ERK 激 酶-1 (SEK1)等,表明 HGF 和-NGF 是誘導(dǎo)小鼠 ES細胞分化為功能性肝細胞的重要因子。 在現(xiàn)階 段,通過不

56、同的誘導(dǎo)途徑可將 ES 細胞誘導(dǎo)成肝細胞。 但體外誘導(dǎo) ,體內(nèi)誘導(dǎo)以及體內(nèi)外相結(jié)合的誘 導(dǎo)分化 ,總的來看 , ES 細胞定向 分化為肝細胞的分化率和在體內(nèi)與正常肝的嵌合率都還不高,這是一個急需解決的問題。由于 ES細胞易進行遺傳操作 ,近年日本科學(xué)家 Toyooka將標記基因 GFP或 lacZ定點敲人 (knock in) ES細胞 Mvh 基因(在生殖細胞分化中特異表達的基因 )位點,用以 ES細胞體外分化期間追蹤生殖細 胞的產(chǎn)生。體外 ES細胞形成擬胚體時 ,出現(xiàn) Mvh 陽性的生殖細胞 ,與分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP4 ) 的細胞共培養(yǎng)下 ,可促進這種 Mvh 陽性生殖細胞分化。

57、將這種 Mvh陽性生殖細胞接種人 CD - 1 (ICR) 裸鼠辜丸被膜下 ,可進一步分化成熟為精子。同年早些時候,美國 Hubner 等人也報道了小鼠 ES 細胞在體外可發(fā)育為進入減數(shù)分裂期的卵原細胞(oogonia) ,在體外觀察了卵子發(fā)生 ( oogenesis)過程。第三節(jié) 成體干細胞20 世紀初 , Pappenheim根據(jù)對骨髓中的造血細胞發(fā)生過程的形態(tài)學(xué)觀察 ,提出了骨髓中存在著未分 化干細胞的設(shè)想 ,認為未分化的干細胞通過各個中間階段的前體細胞最終生成成熟的多種類型血 細胞。第一次提出了 成體干細胞 (adult stem cell) 的概念。成體干細胞 是指一群分布在成體組織

58、中尚未分化的、具有自我更新潛能并負有構(gòu)建和補充某種組 織的各種類型細胞的干細胞 ,故又名 組織干細胞 。實際上 ,成體組織中存在干細胞是個體發(fā)育進化史 的產(chǎn)物 , 涉及組織器官的再生能力和創(chuàng)傷修復(fù)等基本特性。例如,骨髓組織的造血干細胞可分裂、分化為血液系統(tǒng) 的各種細胞 ,定期補充細胞成分或失血。小腸和皮膚中的干細胞也分別能分化、 補充和更新小腸和皮膚組織的一些細胞。 傳統(tǒng)的觀點曾認為 ,干細胞一旦分化成熟 ,就不再分裂增殖 了 ;人體除了血液、皮膚、消化管上皮和肝臟的組織干細胞有一定的再生能力外,其他組織器官例如神經(jīng)組織基本上不再具有再生能力。同時也認為在成體中存在的、屬于某組織器官的成體干細胞是專能或限能的 ,例如造血干細胞只能分化為血液系統(tǒng)的各種細胞等。但是,新近的研究表明 ,這些成體干細胞的發(fā)育潛能可跨越組織或胚層的界限。例如 ,從成年小鼠腦組織分離的神經(jīng)干細胞移植入經(jīng) X 射線照射過的小鼠骨髓部位 ,則分化出血液細胞。此后 ,發(fā)現(xiàn)人和小鼠的神經(jīng)干細胞具有 分化為肌細胞和胚胎多種組織細胞的潛能。 看來 ,神經(jīng)干