膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)概要PPT課件

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是一門操作技能很強(qiáng)的課程。實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的主要目標(biāo)是使學(xué)生了解醫(yī)學(xué)微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，樹立牢固的無菌觀念。更重要的是培養(yǎng)學(xué)生自學(xué)能力、科學(xué)思維能力、動(dòng)手能力和表達(dá)能力。 第1頁/共48頁微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿白大衣、戴帽子。 書本、文具放在抽屜里。 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)吃東西、喝飲料，不準(zhǔn)把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭臉等部位。 凡是廢棄的細(xì)菌培養(yǎng)物、帶菌材料，應(yīng)放在指定地點(diǎn)等待滅菌處理，不得隨便亂放或用水沖洗。 一旦發(fā)生意外，造成污染，應(yīng)立即報(bào)告老師進(jìn)行處理。 離開實(shí)驗(yàn)室前，必須洗手。懷疑污染應(yīng)及時(shí)用11新潔而滅泡手

2、。 每次實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)臺(tái)用消毒液擦拭，地板先用濕的拖把拖地以后再掃地，實(shí)驗(yàn)室用紫外線燈照射1 1小時(shí)。第2頁/共48頁實(shí)驗(yàn)分組 倆倆相對(duì)4人為一組,組號(hào)編在電源插座上。 每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號(hào)為甲、乙、丙、丁。 甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 講 臺(tái)第3頁/共48頁實(shí)驗(yàn)室器材 整齊有序第4頁/共48頁常用器材擺放順序：電源插座試管架酒精燈污物盤。試管架上器材：按接種針、接種環(huán)、油性筆和打火機(jī)的順序，分別放置在試管架中間兩行，靠近電源插座一側(cè)。器材使

3、用以后，必須放回原處，依次擺整齊。第5頁/共48頁普通冰箱(3(3顆星* * * *) )冷藏室( (上柜）：溫度4 488，保存培養(yǎng)基、細(xì)菌培養(yǎng)物、常用菌種和抗菌素紙片等。冷凍室（下柜）：溫度1818，保存診斷血清、血漿，長(zhǎng)期保藏的菌種和抗菌素紙片。 衛(wèi)生工具：掃帚，拖把，撮箕，垃圾筐，放置在冰箱和水池之間。第6頁/共48頁隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：35353737，一般細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為18182424小時(shí)。 第7頁/共48頁奧林巴斯 CX21CX21型 生物顯微鏡（實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)，每人一臺(tái)）注意：只能橫放，不得豎放。第8頁/共48頁 1500W 1500W電爐安全警告培養(yǎng)基沸騰溢出流入電爐：觸電危及生

4、命！短路斷電，。第9頁/共48頁蒸餾水：配制培養(yǎng)基。11新潔而滅：懷疑病原菌污染，泡手35分鐘。消毒液：擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面。玻片缸：浸泡用過的載玻片。第10頁/共48頁醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)一 膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)（P2） 培養(yǎng)基的制備P2 消毒與滅菌P5 細(xì)菌的人工培養(yǎng) 無菌技術(shù)（錄像） 擺斜面，傾注平板。第11頁/共48頁常見病原性球菌的檢查程序P47P47： 直接涂片、革蘭染色、鏡檢膿汁、痰、咽部分泌物 觀察菌落性狀、溶血性、色素 血瓊脂平板培養(yǎng) 涂片染色鏡檢 挑取可疑菌落 生化反應(yīng) 純培養(yǎng) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 藥敏實(shí)驗(yàn)血液、穿刺液 肉湯增菌培養(yǎng) 培養(yǎng)液涂片染色境檢 常見腸道致病菌的檢查程

5、序P48P48：糞便 SSSS瓊脂、伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng) 挑取可疑菌落 血清學(xué)鑒定 血、骨髓 增菌培養(yǎng) 雙糖鐵培養(yǎng)基 染色鏡檢 生化反應(yīng) 第12頁/共48頁從培養(yǎng)基的制備，細(xì)菌的分離、純化、形態(tài)學(xué)檢查，到細(xì)菌的生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，全都由同學(xué)們親自動(dòng)手操作和完成。綜合性實(shí)驗(yàn)是一個(gè)連續(xù)的過程，一個(gè)步驟，一個(gè)環(huán)節(jié)的失誤，將直接影響到最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按要求操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要及時(shí)觀察，及時(shí)記錄，以便撰寫實(shí)驗(yàn)論文。第13頁/共48頁培養(yǎng)基的制備組號(hào)組號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)基稱量稱量(g)(g)水量水量(ml)(ml)煮沸煮沸( (次次) )分裝分裝(ml)(ml)備注（備注（4040人份）人份）1

6、1營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂11.411.43003004 4瓶，瓶，500ml500ml瓶，平板瓶，平板2 24 4營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂2.92.975753 35 51515支，中試管，斜面支，中試管，斜面5 57 7營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯1.11.150501 13 31515支，小試管，液體支，小試管，液體8 81010半固體半固體1.51.550503 33 31515支，小試管，高層支，小試管，高層公共培基，勿作標(biāo)記！第14頁/共48頁 1500W 1500W電爐安全警告培養(yǎng)基沸騰溢出流入電爐：觸電危及生命！短路斷電。第15頁/共48頁分裝包裝第16頁/共48頁量筒錐形瓶砝碼干粉培養(yǎng)基試管筐天平邊臺(tái)柜

7、子內(nèi)器材錐形瓶用后洗凈、包扎。器材用后放回原處，依次擺整齊。第17頁/共48頁邊臺(tái)抽屜內(nèi)器材：試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋, ,尺子。藥勺、吸管用后洗凈、甩干，放回原處。第18頁/共48頁 稱量紙置于左盤，游碼移至標(biāo)尺左端“0”0”點(diǎn)位置上，指針應(yīng)對(duì)準(zhǔn)中線，取得平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)整螺母旋動(dòng)調(diào)節(jié)平衡。 秤物時(shí)“左物右碼”，物品在左盤上，砝碼在右盤，盡可能放在秤盤中心。天平保持干燥、清潔。第19頁/共48頁培養(yǎng)基制備 培養(yǎng)基制備程序： 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好 放入講臺(tái)邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐

8、內(nèi)送到高壓滅菌室（洗刷室）。 請(qǐng)?jiān)?30分鐘內(nèi)完成。第20頁/共48頁培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是用人工的方法，將多種營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)各種微生物生長(zhǎng)繁殖的需要而合成的一種營養(yǎng)制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和水，pH7.47.6。 培養(yǎng)基制備的一般程序： 調(diào)配溶化 矯正pH 分裝滅菌檢定保存。 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定 保存。 培養(yǎng)基的制備原則： (1)適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分,(2)合適的酸堿度,(3)配制后必須滅菌。第21頁/共48頁 培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類） 液體培養(yǎng)基:不含凝固劑（瓊脂），用于增菌，純培養(yǎng),保種。 固體培養(yǎng)基:含12瓊脂，用于分離培養(yǎng),純培養(yǎng),保種。 半固體培基:含

9、0.30.5瓊脂，用于動(dòng)力檢測(cè),保種。 第22頁/共48頁 培養(yǎng)基的種類（按用途分類）P3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基:含一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的基本營養(yǎng)成分，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，如普通平板。 營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和須要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)，如血平板。 增菌培養(yǎng)基：促進(jìn)目的菌的生長(zhǎng)，適用于含菌量較少的標(biāo)本，如葡萄糖肉湯。 選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入抑制劑抑制雜菌生長(zhǎng)，有助于目的菌的生長(zhǎng)，如EMB、SS平板。 鑒別培養(yǎng)基：利用細(xì)菌分解能力及代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用來試驗(yàn)細(xì)菌的生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物，如糖發(fā)酵管。 厭氧

10、培養(yǎng)基：氧化還原電勢(shì)低，表面用凡士林、石蠟封住，與空氣隔絕，成為無氧環(huán)境，如庖肉培養(yǎng)基。第23頁/共48頁培養(yǎng)基的滅菌 在冷空氣完全排盡的情況下，蒸汽壓103.43 kPa ,溫度可達(dá)到121.3 ,維持15-30分鐘，可以殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：121高壓蒸汽滅菌1530分鐘。 含糖培養(yǎng)基：115滅菌15分鐘。 雞蛋、牛奶培養(yǎng)基:75100間歇滅菌3次(1天1次)。 不耐高溫的液體成分：濾菌器濾過除菌（EK型蔡氏濾器、 G5或G6玻璃濾器、0.45um或0.22um微孔濾膜）第24頁/共48頁 培養(yǎng)基滅菌以后，冷卻50506060（溫度越高，冷凝水越多，越易污染 ），

11、以無菌操作，傾注平皿10ml10ml（直徑7 7厘米平皿），瓊脂凝固后形成瓊脂平板。 平板主要用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。平板儲(chǔ)存待用或做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，為什么要倒置？防止平板水分蒸發(fā)丟失。防止冷凝水滴于平板表面，影響單菌落形成。 第25頁/共48頁 培養(yǎng)基滅菌以后，趁熱斜放，培基不超過試管長(zhǎng)度的2/32/3，瓊脂凝固以后形成一個(gè)傾斜的表面。 斜面主要用于純菌移種和菌種保存。 斜面底部的冷凝水有利于純菌移種、菌苔形成和菌種保藏。第26頁/共48頁怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格?無菌試驗(yàn)：將待檢培養(yǎng)基置于35培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，無任何細(xì)菌生長(zhǎng)為合格。效果試驗(yàn)：將已知的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株，接種于待檢培養(yǎng)基中，檢查

12、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果相符合。第27頁/共48頁臥式圓形壓力蒸汽滅菌器YXQ.WY21D第28頁/共48頁第29頁/共48頁 滅菌器主要由滅菌室、管道系統(tǒng)、電器系統(tǒng)和蒸汽發(fā)生器構(gòu)成。 蒸汽發(fā)生器電壓380伏，功率12千瓦。滅菌室結(jié)構(gòu)采用雙層單門不銹鋼制造，兩層之間為夾層。 鍋爐的蒸汽通過管道直接進(jìn)入夾層，儲(chǔ)存高溫飽和蒸汽，預(yù)熱滅菌室。經(jīng)電磁閥控制進(jìn)入滅菌室。 滅菌室的冷空氣通過冷凝閥以冷凝水的形式排出。第30頁/共48頁滅菌器的設(shè)置 安全閥：當(dāng)蒸汽壓力超過最高允許使用壓力時(shí)能自動(dòng)跳起，釋放超壓蒸汽，確保安全使用。 壓力表：滅菌室和蒸汽套層各裝有壓力表一只，能指示各層內(nèi)的蒸

13、汽工作壓力。 溫度表：能隨時(shí)顯示滅菌室內(nèi)最低滅菌溫度，有利操作。 冷凝水泄出器：能將滅菌室內(nèi)的冷空氣和冷凝水在滅菌過程中予以排出，確保滅菌效果。 安全聯(lián)鎖裝置：滅菌室壓力降到零，蜂鳴器聲響，提示可以安全開門。第31頁/共48頁高壓蒸汽滅菌器的操作程序 冷空氣的排除：滅菌室壓力升至0.07MPa時(shí)，關(guān)進(jìn)汽閥，開排汽閥，使壓力降到零 ，排汽一次。然后關(guān)排汽閥，開進(jìn)汽閥，重復(fù)以上操作。如此反復(fù)三次，方可排凈冷空氣。冷空氣的排除是滅菌成功和失敗的關(guān)鍵。 物品的滅菌：一般維持1530分鐘。 排除蒸汽。 滅菌物品的干燥（根據(jù)需要）。第32頁/共48頁熱蒸汽比冷空氣大概輕一倍，浮在上層，把冷空氣擠壓到底部，

14、經(jīng)排氣管道排出。高壓蒸汽滅菌器冷氣出口蒸汽入口熱氣流冷氣流第33頁/共48頁常用蒸汽壓力與相應(yīng)溫度 壓力(磅/吋） 壓力（Kpa） 相對(duì)溫度() 8 55.16 112.6 10 68.95 115.2 20 137.90 126.21標(biāo)準(zhǔn)大氣壓=76厘米汞柱高=1.013105帕斯卡=14.696磅/英寸2。采用2000個(gè)大氣壓也不能殺死細(xì)菌，真正起殺菌作用是高溫。第34頁/共48頁滅菌所需時(shí)間、壓力與溫度指標(biāo) 滅菌物品類 滅菌時(shí)間(分) 蒸汽壓力Mpa 相對(duì)溫度 含糖培養(yǎng)基： 15 0.07 115 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 1530 0.11 121 橡 膠 類 15 0.11 121 敷 料 類

15、3045 0.110.14 121126 器 皿 類 15 0.110.14 121126 器 械 類 10 0.110.14 121126 瓶裝溶液類 2040 0.110.14 121126第35頁/共48頁細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的方式和速度 細(xì)菌繁殖方式：以二分裂方式進(jìn)行無性繁殖。 繁殖速度：多數(shù)2030分鐘繁殖1代，結(jié)核桿菌1820小時(shí)繁殖一代。 細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖曲線第36頁/共48頁細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)）（小時(shí)）5 10 15 20 25 30 6.06.57.07.58.08.59.0活菌數(shù)活菌數(shù)總菌數(shù)總菌數(shù)遲緩期遲緩期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期穩(wěn)定期穩(wěn)定期

16、衰退期衰退期第37頁/共48頁細(xì)菌生長(zhǎng)曲線意義 遲緩期：一般14h，細(xì)菌代謝活躍，但不繁殖。 對(duì)數(shù)期：維持4 8h，細(xì)菌快速繁殖，數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)增加，細(xì)菌形態(tài)、染色性、生理活性最典型、對(duì)抗生素最敏感。細(xì)菌鑒定選用此期為佳。 穩(wěn)定期： 通常維持10h，活菌數(shù)和死菌數(shù)幾乎相等，代謝產(chǎn)物形成較多。 衰亡期：培養(yǎng)18 24 h以后，代謝逐漸停滯,死菌數(shù)超過活菌數(shù)。第38頁/共48頁常用玻璃器材的處理程序（示教） 新購置的玻璃器材：12鹽酸浸泡過夜中和游離堿 流水沖洗15次晾干包裝滅菌 。 無污染器皿:洗滌劑洗刷。 病原菌污染的器材（消毒、滅菌后再處理）： 試管、吸管和平皿：高壓蒸汽滅菌趁熱倒出污物洗滌

17、劑浸泡瓶子、試管、吸管用毛刷，平皿用紗布洗刷干凈。 吸管：3來蘇兒浸泡過夜。 載玻片：3來蘇兒浸泡過夜 肥皂水煮沸10min 。第39頁/共48頁玻璃器材洗干凈的標(biāo)準(zhǔn) 1.洗滌時(shí)觀察:洗后的玻璃器材附著在內(nèi)壁上的水不是個(gè)別水珠,而是一層極薄的水膜。 2.干燥后觀察:對(duì)著光亮處觀看玻璃器材,非常透明, 內(nèi)外壁上不出現(xiàn)大片發(fā)白或白點(diǎn),也無微小污點(diǎn)和粉末。 第40頁/共48頁思考題人工培養(yǎng)細(xì)菌需要提供的條件是什么? 培養(yǎng)基制備的原則是什么?怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格? 培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途?高壓蒸汽滅菌法、紫外線、碘酒的殺菌機(jī)理各是什么?第41頁/共48頁醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)一 膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)（一） 培養(yǎng)基的制備P2 消毒與滅菌P5 細(xì)菌的人工培養(yǎng) 無菌技術(shù)（錄像） 擺斜面，傾注平板。第42頁/共48頁量筒錐形瓶砝碼干粉培養(yǎng)基試管筐天平邊臺(tái)柜子內(nèi)器材錐形瓶用后洗凈、包扎。器材用后放回原處，依次擺整齊。第43頁/共48頁邊臺(tái)抽屜內(nèi)器材：試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋, ,厘米尺。藥勺、吸管用后洗凈、甩干，放回原處。第44頁/共48頁常