elisa酶聯(lián)免疫吸附試驗報告

1、elisa酶聯(lián)免疫吸附實驗報告一.實驗?zāi)康拿嘎?lián)免疫吸附測定( enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱 ELISA )是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),ELISA過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原），再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原），生成抗原（抗體）待測抗體（抗原）-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體（抗原）的量。待測抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成正比。二.實驗原理用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶,

2、6-D-半乳糖昔酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酊酶，乙酰膽堿酯酶，6一磷酸葡萄糖脫氧酶等。 常用于ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等,其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準(zhǔn)確地定量。辣根過氧化物酶(HRP)是一種糖蛋白，每個分子含有一個氯化血紅素( protonhemin)區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。 氯化血紅素輔基的最大吸收峰是403nm, HRP酶蛋白的最大吸收峰是 275nm ,所以酶的濃度和純度計算式是(已知HRP的A (1cm 403nm 1%) = 25,式中1%指HRP百分濃度為10

3、0ml含酶蛋白1g,即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml計算是HRP的A (1cm 403nm mg/ml=2.5 ) HRP純度(RZ) =A403nm/A275nm 純度 RZ (R einheit Zahl)值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度 HRP的RZ值在3.0左右，最高可達(dá) 3.4。用于ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上ELISA的基本原理有三條:(1) 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學(xué)活性;(2) 抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性;(3)

4、 酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結(jié)果。ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本，因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原

5、，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個方面：1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2、研究抗酶抗體的合成。3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4、定量檢測體液中抗原或抗體成份?；痉椒ㄒ挥糜跈z測未知抗原的雙抗體夾心法1. 包被：用0.05M PH9.袖碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110卬"ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 0.1ml , 4C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品 0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中， 置37C孵育1小時。然后洗滌。（同時做

6、空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 （經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml °37C孵育0.51小時，洗滌4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml, 37C1030分鐘5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml o6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺， 以“+'< -”號表示。也可測O?D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O?D值，若大于規(guī)定

7、的陰性對照 OD值的2.1倍，即為陽性基本方法二用于檢測未知抗體的間接法:用包被緩沖液將已知抗原稀釋至110卬"ml,每孔加0.1ml, 4C過夜。次日洗滌3次加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37C孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml, 37C孵育30-60分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌其余步驟同雙抗體夾心法”的4、5、6（二）酶與底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原，半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是 ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示

8、出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物免疫技術(shù)常用的酶及其底物酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺橘紅色492*四甲替聯(lián)苯胺黃色460*氨基水楊酸棕色449鄰聯(lián)苯甲胺蘭色4252,2'-連胺基-2 （3-乙基-并壤哇唏磺酸-6）鉉鹽藍(lán)綠色642堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽（PNP） 黃色400蔡酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽紅色500葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖黃色405,420葡萄糖+甲硫酚嗪+壤哇蘭深藍(lán)色$D一半乳糖昔酶甲基傘酮基半乳糖昔（4MuG ）熒光360,450硝基酚半乳糖昔（ONPG） 黃色420*終止劑為2mol/L H2SO4*終止劑為2 mol/

9、L檸檬酸，不同的底物有不同的終止劑。供氫體;可催化下列反應(yīng)：HRP+H2O2 復(fù)合物 復(fù)合物+AHA 過氧化物酶+H2O+A AH2 為無色底物A為有色產(chǎn)物。（三）ELISA常用的四種方法1. 直接法測定抗原將抗原吸附在載體表面;加酶標(biāo)抗體，形成抗原 一抗體復(fù)合物;加底物。底物的降解量=抗原量2. 間接法測定抗體將抗原吸附于固相載體表面;加抗體，形成抗原-抗體復(fù)合物;加酶標(biāo)抗體;加底物。測定底物的降解量=抗體量。3, 雙抗體夾心法測定抗原將抗原免疫第一種動物獲得的抗體吸附于固相表面加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物加抗原免疫第二種動物獲得的抗體，形成抗體抗原抗體復(fù)合物加酶標(biāo)抗抗體（第二種動物抗體的抗

10、體）加底物。底物的降解量=抗原量4, 競爭法測定抗原將抗體吸附在固相載體表面(1)加入酶標(biāo)抗原;(2) , (3)加入酶標(biāo)抗原和待測抗原;加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差=未知抗原量三.儀器和材料1.聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板(平板，40, 96孔)2.酶聯(lián)免疫檢測儀3.辣根過氧化物酶羊抗兔IgG,工作稀釋度1:10004.包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液，4C ,保存，Na2CO3 0.15克,NaHCO3 0.293克,蒸熠水稀釋至100 ml5. 稀釋液：0.01mol/LpH7.4 PBS- Tween- - 20, 4 °C,保存,NaCl 8g, KH2P

11、O4 0.2g, Na2HPO4.12H2O2.9g, Tween 20, 0.5ml.蒸熠水加至 1000ml。6. 洗滌液：同稀釋液7.封閉液：0.5%雞卵清蛋白，pH7.4 PBS8.鄰苯二胺溶液(底物) ：臨用前配制 0.1M 檸檬酸(2.1g/100ml) , 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O(7.163g/100ml)6.4ml,蒸熠水12.5ml,鄰苯二胺10mg,溶解后，臨用前加30%H2O2 40微升9.終止液：2mol/LH2SO4四.操作步驟1.包被抗原：用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋，一般為110微克/孔，每孔加200微升，37C溫育1小時后,4C冰箱放置1618小時。2.洗滌：倒盡板孔中液體，加滿洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡3.加封閉液200微升，37C放