流式細(xì)胞分析分選原理

1、流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀工作原理 流式細(xì)胞術(shù)的原理流式細(xì)胞術(shù)的原理 流式細(xì)胞術(shù)（fcm）是一種能對(duì)單個(gè)細(xì)胞、分子和生物顆粒（微生物）進(jìn)行多參數(shù)快速檢測(cè)的新型分析和分選技術(shù)。近幾年隨著多種單克隆抗體的成功制備和多種熒光素的應(yīng)用。fcm逐步運(yùn)用于對(duì)疾病診斷和治療監(jiān)測(cè)的臨床檢驗(yàn)常規(guī)工作。流式細(xì)胞儀與顯微鏡流式細(xì)胞儀與顯微鏡光源激光自然光、燈光、氙(汞)燈對(duì)象細(xì)胞、生物粒子細(xì)胞、生物粒子承載工具載(蓋)玻片鞘液及流動(dòng)室檢測(cè)信號(hào) 光學(xué)信號(hào)形態(tài)及染色放大方式pmt，放大電路目鏡x物鏡統(tǒng)計(jì)人工，200計(jì)算機(jī)，5000結(jié)果簡(jiǎn)單，單參數(shù)多參數(shù)，綜合分析 基本原理流路流動(dòng)室 鞘液sheath 樣本流sampl

2、e 單細(xì)胞懸液5*1051*106個(gè)/ml光路光源檢測(cè)信號(hào)光電倍增管pmt hv電路放大電路hv及gain 增益a/d轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì)：計(jì)算機(jī)流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀光路光路流路流路電子電子軟件軟件流路流路光路光路電路電路/電子電子軟件軟件 流 路 單細(xì)胞懸液 大多數(shù)儀器是在50-300 m 大小的孔徑中,將細(xì)胞懸液注射進(jìn)入鞘液中 這一過(guò)程,成為流體動(dòng)力學(xué)聚焦flow cellinjector tipfluorescencesignalsfocused laserbeamsheath fluid流路流路光路光路電路電路/電子電子軟件軟件光光 路路光源光源檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào) 散射光信號(hào)散射光信號(hào)fs: 前向角

3、散射光前向角散射光ss: 側(cè)向角散射光側(cè)向角散射光(90度散射光度散射光) 熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光染料熒光染料光學(xué)濾片光學(xué)濾片 顏色補(bǔ)償顏色補(bǔ)償 光光 路路 光源與通過(guò)的細(xì)胞聚焦在同一點(diǎn)上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm uv, 514nm green,水冷innova300系列innova70系列固態(tài)檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)信號(hào) 散射光信號(hào)散射光信號(hào)前向散射光前向散射光( (fs)fs) fs-forward (angel light) scatter在激光束正前方的檢測(cè)器, 為前向散射光檢測(cè)器 fs的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homoge

4、neity 有關(guān) fs用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性如:大小 前向散射光前向散射光 散射光信號(hào) 側(cè)向散射光 ss-side (angel light) scatter 與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器, 也稱為90度散射光檢測(cè)器 ss的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān) ss用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)如:胞漿內(nèi)顆粒多少, 核質(zhì)比 側(cè)向散射光側(cè)向散射光90 degree scatter0 200 400 600 8001000forward scatter0 200 400 600 8001000 815203040501002001000lymp

5、hocytesmonocytesneutrophilsside scatter projectionforward scatter projectionlight scatter gatingscale 光路-熒光信號(hào) 每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng), 并激發(fā)后會(huì)有發(fā)射波長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射波長(zhǎng). 利用各種不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來(lái)收集(檢測(cè))這些光學(xué)信號(hào)熒光染料的特性熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)(exciting)發(fā)射波長(zhǎng)(emission)fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique

6、fluorescence channel.the specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors.absorption spectrum:range over which a fluorescence compound may be excitedemission spectrum:range of emitted wavelengths for a particular compound5 color single laser (488nm)

7、fitc/pe/ecd/pc5/pc74 color single laser (488nm)fitc/pe/ecd/pc5常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)(nm) 用途 顏色fitc 488 525 免疫熒光 綠色pe(rd1) 488 575 免疫熒光 橙色 ecd 488 620 免疫熒光 橙紅pecy5 488 675 免疫熒光 紅pi 488 620 dna染色 橙紅pecy7 488 755 免疫熒光 深紅percp 488 670apc 633 670 光路 - 濾片特性 當(dāng)以 45o 角放置濾片時(shí),該濾片可以通過(guò)一定波長(zhǎng)的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長(zhǎng)以

8、下的光 這種方式的濾片稱為二向色性濾片( dichroic filter) 標(biāo)準(zhǔn)帶通濾片標(biāo)準(zhǔn)帶通濾片 band pass 光源光源通過(guò)的光譜通過(guò)的光譜630/30 nm bp615-645 nm light sourcelightpassedlightcertain colorsabsorbedabsorbancefilter488 dl488 bk550 dl525 bp600 dl575 bp640 dl620 bp675 bpunique 4-color single laser designair-cooled argon ion laserbeam shaping lenseshig

9、h sensitivityquartz flow cellforward scatterdetectorside scatterdetector525bp fl1 (fitc)575bp fl2 (rd1)620bp fl3 (ecd)675bp fl4 (pc5)488dl488bk550dl600dl645dlpc7air-cooled argon ion laserbeam shaping lenseshigh sensitivityquartz flow cellforward scatterdetectorside scatterdetector525bp fl1 (fitc)575

10、bp fl2 (rd1) 675bp(pc5)750bp fl4 (pc7)488dl488bk550dl600dl 700dlwith thanks to dr. frank schniedersgentherapie gruppe abteilung molekulare zellbiologie institut fr medizinische biochemie und molekularbiologieuniversittsklinikum hamburg-eppendorfegfp, eyfp and 7-aadwith epics xltm and expo32tm adc-so

11、ftwarehek293human embryonalkidney cells 293filter setbp 510laf21bp 550laf30dichroic mirror 525drlpcell viability with 7-aadhek293-cells with eyfp transfectionhek293-cells with egfp transfectionmixture of egfp- and eyfp-transfected hek293-cellsegfp . enhanced green fluorescent protein (ex 488; em 507

12、 nm)eyfp . enhanced yellow fluorescent protein (ex 513; em 527 nm)7-aad .7-aminoactinomycin (viability stain ; ex 546; em 647 nm) emission intensitywavelengthflbfla顏色補(bǔ)償減法顏色補(bǔ)償 減法補(bǔ)償 去除疊加信號(hào),在使用雙色以上時(shí)會(huì)產(chǎn)生減得過(guò)多的錯(cuò)誤 bd facscalibur 補(bǔ)償試劑fitcpefitcpefitcpe全矩陣顏色補(bǔ)償全矩陣 在每個(gè)pmt上對(duì)于每一個(gè)熒光計(jì)算 “疊加熒光素” 的比率 通過(guò)矩陣去除或加上信號(hào) epics

13、 xl cytomics fc500 gallios/naviosfl1fl2fl3fl4pmt155.00.50.30.3pmt21.747.01.20.3pmt30.67.445.00.3pmt40.21.43.428.0normalized relative intensityfl1fl2fl3fl4pmt1100.01.10.71.1pmt23.1100.02.71.1pmt31.115.7100.01.1pmt40.43.07.6100.0percentagemean intensitysingle parameter mniiot cd45cd45-ecd pmt 1 pmt 2

14、pmt 3 pmt 4 fl1 100 -1.28 -1.08 -0.74 fl2 -3.5 100 -7.41 -0.44 fl3 1.01 -41.25 100 0.18 fl4 -0.04 6.67 -24.40 100 流路流路光路光路電路電路/電子電子軟件軟件電路及電子系統(tǒng)-光電倍增管 photomultiplier tube (pmt) 將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號(hào) 不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道不同的脈沖信號(hào)被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(channel)的過(guò)程的過(guò)程 log fitc 1000 100 10 1 110.1count 30 700 150immunophenotyp

15、ingimmunophenotyping單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖流路流路光路光路電路電路/電子電子軟件軟件軟件基于windows 平臺(tái)軟件界面簡(jiǎn)單，易學(xué)易用目前流式獲取和分析最友好的軟件包，涵蓋所有數(shù)據(jù)和圖形處理功能易于與醫(yī)院內(nèi)lis系統(tǒng)相連直觀拖拽方式調(diào)節(jié)電壓、補(bǔ)償，支持時(shí)時(shí)/自動(dòng)/脫機(jī)補(bǔ)償支持多文件分析報(bào)告，內(nèi)置flowpage功能，方便中文臨床報(bào)告的生成和輸出prism濃縮柱形圖功能便于結(jié)果統(tǒng)計(jì)，兼容office，支持pdf內(nèi)置質(zhì)控功能quickset直觀的電壓調(diào)節(jié)quickcomp直觀的補(bǔ)償調(diào)節(jié)補(bǔ)償前補(bǔ)償前補(bǔ)償后補(bǔ)償后prism濃縮柱形圖 一張圖上顯示多達(dá)1024個(gè)表型組合結(jié)果（十色分析，210分析組合） 將實(shí)驗(yàn)所分析的所有細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)果簡(jiǎn)單地濃縮在一張直方圖上 能