大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)化protocol

1、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)化protocol一、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離和傳代步驟手術(shù)前準(zhǔn)備1. 水浴鍋溫度調(diào)至 37° C。 2. 組織解離液置 95%O2 5%CO2 培養(yǎng)箱中 10min。3. 用 95%乙醇消毒解剖區(qū)。4. 用消毒溶液消毒解剖器械（戊二醛，后用無菌 dH2O 沖洗，浸泡在 95%乙醇中）。 5. 在 3 個(gè) 60 × 15 mm 皿中各加 3ml 的組織解離液。 提示：除無菌顯微解剖器材外，還要三套消毒器械，分別用于剝離皮膚、顱骨和腦，減少用手污染的機(jī)會(huì)。消毒過的解剖器械可以浸泡在無菌組織剝離液中，以避免乙醇接觸組織。分離腦組織6. 新生SD大鼠(出生

2、48h內(nèi))直接斷頭。 7. 剃去頭頂?shù)拿l(fā)。 8. 用浸泡過聚維酮碘消毒的紗布擦洗頭部并且去除松散的毛發(fā)。 9. 用泡過 95乙醇消毒紗布擦洗頭部。 10. 用手術(shù)刀片延中線全長切開頭皮。 11. 掀開皮膚顯現(xiàn)出頭蓋骨。 12. 從雙耳后切開頭皮暴露頭蓋骨側(cè)面。 13. 用小剪刀在兩邊切開頭蓋骨（打開頭蓋骨上部，避免損傷腦組織）。 14. 用鑷子掀開頭蓋骨。 注意：不能用表面有乙醇的解剖工具接觸腦組織。乙醇能使組織固定。 15. 用彎鑷在腦底部滑動(dòng)以切斷連接腦底部的脊髓、血管和顱神經(jīng)。 提示：用彎鑷時(shí)輕微向下用力抵住腦下面的顱底。來回滑動(dòng)松動(dòng)腦組織。 16. 取腦組織，D-Hanks液充分漂洗

3、后.17. 用同一個(gè)彎鑷將腦移到盛有解離液的 60mm 皿中。 18. 剝離大腦表面的腦膜，沖洗干凈，把腦放入第二個(gè)盛有解離液的 60mm 皿中。 提示：在解剖顯微鏡下很容易剝離腦膜。 19. 解剖鏡下，沿中線切開大腦，精細(xì)鑷分離海馬。 20. 將分離組織放置于第三個(gè)盛有解離液的 60mm 皿中。 21. 用 10 號(hào)彎頭手術(shù)刀將組織切成小塊（約 1 mm3） 分散腦組織22. 將盛有小塊組織的培養(yǎng)皿移到超凈臺(tái)， 然后用移液管將組織塊移到 5ml 的圓底聚丙烯管中。23. 250g 離心 1min。24. 棄上清，加入酶混合液（1ml） 。25. 將試管水浴至少 40min，每隔 20 分鐘用

4、移液管適當(dāng)吹打。26. 250g 離心 5min，棄上清。 27. 加入 4ml 蛋白酶抑制劑。28. 用移液管吹打 10 次以分散沉淀，注意盡量別產(chǎn)生氣泡。29. 水浴 10min。 30. 500g 離心 5min，棄上清。 31. 用 0.5ml SFM 重懸細(xì)胞，充分吹打以產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。 提示：建議用火焰鈍化的小搶頭制備單細(xì)胞懸液。接種細(xì)胞32. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并調(diào)整活細(xì)胞濃度。臺(tái)盼蘭染色排除死細(xì)胞。 提示：接種 10-15 cells/ul有利于建立單個(gè)神經(jīng)球的培養(yǎng)。如果不做克隆分析且想獲得更多神經(jīng)球，可提高接種密度（如 50-100 cells/ul）。高密度接種可加快神經(jīng)球

5、的形成，并縮短首次傳代時(shí)間間隔。 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼蘭測定細(xì)胞活性在 24 孔板每孔中加入 0.5ml 含細(xì)胞 SFM。 33. 在 24 孔板每孔中加入 0.5ml 含細(xì)胞 SFM。 34. 37° 95% air 5% CO2 培養(yǎng)。神經(jīng)球的傳代提示： 在合并培養(yǎng)物前應(yīng)檢查每個(gè)孔是否污染， 特別是在第一次傳代時(shí)。 嚴(yán)重污染使 PH 值降低， 培養(yǎng)液顏色明顯改變（變黃）。輕微污染也較常見，無法通過觀察培養(yǎng)液顏色判斷，需在相差顯微鏡下觀察。如果你忽略了一個(gè)污染孔，下一代的所有孔都會(huì)被污染！ 1. 將所有神經(jīng)球和培養(yǎng)液移到 15ml 錐形管。 2. 200g 離心 5min。 3.

6、棄上清，加入 2ml TrypLETM。 4. 用移液管混合神經(jīng)球和 TrypLETM。 5. 37° 水浴 20min。 6. 500g 離心 5min。 7. 棄上清，加 0.5ml SFM 重懸細(xì)胞。 8. 用移液管吹打（6070 次） 提示：吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡。過多氣泡會(huì)降低活細(xì)胞數(shù)并增加污染機(jī)會(huì)。 9. 用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)細(xì)胞密度， 排除死細(xì)胞， 按所需密度接種到新 24 孔板。 95% air 5% CO2 37° 培養(yǎng)。 提示： 神經(jīng)球傳代的最佳時(shí)間常根據(jù)試驗(yàn)需要和時(shí)間安排確定。 如果平均每孔至少 25 個(gè)神經(jīng)球， 那么可以傳 2 個(gè)板。如果有 50 個(gè)神經(jīng)球，

7、那么很容易從原 24 孔板傳 3 個(gè)板。鏡臺(tái)測微尺可標(biāo)準(zhǔn)化相差顯微鏡的目鏡焦距。便于快速確定神經(jīng)球的大小。神經(jīng)球的凍存和復(fù)蘇1. 將含有神經(jīng)球的培養(yǎng)液從 24 孔板移入 15ml 圓錐管。2. 200g 離心 5min。3. 棄上清，用 10ml 含 15DMSO 的 SFM（不含 EGF 和 FGF）重懸細(xì)胞。 4. 用移液管輕輕混勻，分裝 1.5ml 每管（聚丙烯冷凍管）。5. 80° 冰箱過夜。6. 次日晨轉(zhuǎn)移至液氮罐保存。 提示：如果不能使用液氮，神經(jīng)球可以在80° 保存幾周。活神經(jīng)球數(shù)量會(huì)隨80° 存放時(shí)間延長而減少。 7. 準(zhǔn)備復(fù)蘇神經(jīng)球，將冷凍管從液

8、氮中取出，在超凈臺(tái)內(nèi)回復(fù)至室溫。 8. 將冷凍管內(nèi)容物轉(zhuǎn)入含有 10ml SFM 的 15ml 圓錐管中。 9. 200g 離心 5min，棄上清。 10. 用 4ml SFM 輕輕混勻。 11. 按每孔 0.5ml 種 8 個(gè)孔（24 孔板）， 37° 95% air 5% CO2 條件下培養(yǎng)。 提示：小神經(jīng)球比大神經(jīng)球（直徑大于 100um）更易復(fù)蘇成活。在組織培養(yǎng)基中，神經(jīng)球復(fù)蘇成活率很低（小于 20）。建議每孔至少種 50100 個(gè)神經(jīng)球。通過提高冷凍神經(jīng)球密度或在冷凍液中加入 20胎牛血清可提高復(fù)蘇成活率。但要牢記胎牛血清可以誘導(dǎo)分化。二、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力檢測將Brd

9、U溶于SFM 培養(yǎng)基，過濾除菌后加入神經(jīng)球形成后分離克隆制作的單細(xì)胞懸液中(BrdU終濃度為5mol/L)，培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球形成后，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。三、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化能力檢測選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并加入有血清培養(yǎng)基(含10胎牛血清的SFM 培養(yǎng)基)，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、免疫細(xì)胞化學(xué)染

10、色。注：1) TuJ1是一種被認(rèn)為參與神經(jīng)元細(xì)胞類型特異性分化的微管蛋白。 2) GFAP是神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物。3) Nestin是巢蛋白，是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性的表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上一種分子標(biāo)記物；可能對神經(jīng)元的分化有作用。Nestin僅在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)上皮表達(dá)，出生后表達(dá)就停止。為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物。4) 神經(jīng)球轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)液的24孔板, 24 h 后大部分貼壁; 可見有單個(gè)細(xì)胞從神經(jīng)球內(nèi)游出,貼壁生長,分散存在,可向四周發(fā)出放射狀條索,與周圍細(xì)胞互相聯(lián)接。2 d后突起不斷增粗和伸長,形態(tài)不規(guī)則; 5 d左右克隆基本分化成形態(tài)不一, 分散成突起多少不

11、等的三種類型細(xì)胞: 細(xì)胞體呈圓形或橢圓型、突起少但很長、折光性強(qiáng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞, TuJ1免疫染色呈陽性反應(yīng),表明神經(jīng)干細(xì)胞已部分分化為神經(jīng)元; 胞體較大、突起較多較粗、細(xì)胞數(shù)量較多的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞,其折光性弱, GFAP免疫染色呈陽性反應(yīng);細(xì)胞胞體最小,數(shù)量也最少,具有多個(gè)細(xì)胞突起,突起較短、較細(xì)、且不斷分枝,考慮為少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。NSCs由BrdU摻入后,分化培養(yǎng)的細(xì)胞中大多數(shù)顯微鏡下可見BrdU免疫染色陽性。表一、所需儀器列表儀器名稱數(shù)量CO21解剖顯微鏡1水浴鍋1顯微分離器材4套手術(shù)刀片1套生物安全柜1臺(tái)式離心機(jī)1相差顯微鏡1表二、所需耗材列表耗材名稱數(shù)量公司貨號(hào)報(bào)價(jià)（元）60&#

12、215;15 mm 組織培養(yǎng)皿40個(gè)Falcon cat. no. 353002122.824孔細(xì)胞培養(yǎng)板10個(gè)Falcon cat. no. 3530471625 ml 聚丙烯圓底管20個(gè)Falcon cat. no. 352063137.415 ml 聚丙烯圓椎管20個(gè)Falcon cat. no. 352095174.650 ml 聚丙烯圓椎管10個(gè)Falcon cat. no. 352070114.8表三、組織解離液配方組織解離液2.0M NaCl 15.5ml1.0M KCl1.25ml1.0M MgCl20.8ml155mM NaHCO341.9ml1.0M Glucose2.5m

13、l108mM CaCl20.23ml蒸餾水188.0ml此分離液在4度過濾和儲(chǔ)存在使用之前在95% O2和5% co2中充氣10分鐘。表四、消化酶混合液配方消化酶混合液報(bào)價(jià)（元）Trypsin(sigma. cat.no.T5266)0.04g534.69Type-1-S Hyaluronidase(sigma. cat.no.H3506)0.02g1,075.23Kynurenic acid(sigma. cat.no.K3375)0.004g1,387.62此消化酶溶液溶解于30ML組織分離液中，并用0.22um的膜過濾，分裝成1ML，儲(chǔ)存于-20度冰箱。表五、無血清培養(yǎng)液配方無血清培養(yǎng)液

14、（SFM 100ml）報(bào)價(jià)（元）DMEM/F12(Invitrogen cat. no. 11330-032)94.3ml40430% Glucose2.0 ml1.0M Hepes Buffer0.5ml孕酮（1000X） (Sigma cat. no. P-8783)0.1mlPutrescine（100X）(Sigma cat. no. P5780) 1.0ml286.65B27 Growth supplement  (Invitrogen cat. no. 17504-044)2.0 ml1190EGF(Sigma cat. no. E

15、4127)20ul1728.09FGF(Sigma cat. no. F0291)20ul1,291.68ITSITSS(Cyagen cat. no. ITSS-10201-10)100ul490肝素(Sigma cat. no. H3149)7.32ul4,829.76新開封的DMEM/F12（500ml）培養(yǎng)基中需要增加8ML 15%的NaHCO3溶液并儲(chǔ)存于4度表六、抗體和試劑列表抗體名稱數(shù)量公司貨號(hào)報(bào)價(jià)（元）Nestin1Abcam-ab931574,189 TuJ11Abcam-ab145454,595GFAP1Abcam-ab72604,443Brdu1Abcam-ab63264,443TrypLETM express1Invitrogen-12604-021605 BrdU Labeling Reagent1Invitrogen- 00-0103713實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)：1.神經(jīng)球的形成：此實(shí)驗(yàn)即使嚴(yán)格按照protocol來操作，也會(huì)伴隨著很多不確定的風(fēng)險(xiǎn)。如，在組織分離過程中污染問題或是配置分離培養(yǎng)基時(shí)產(chǎn)生的污染。在神經(jīng)球培養(yǎng)的過程中，如果起始細(xì)胞密度過于高，那么死細(xì)胞或是即將死的細(xì)胞就會(huì)降低培養(yǎng)基的PH值， PH值降低將會(huì)阻止神經(jīng)球的形成和發(fā)育。2.雖然所有腦區(qū)都能