基因芯片技術(shù)在病原微生物耐藥性檢測中的應(yīng)用講座

1、.基因芯片技術(shù)在病原微生物耐藥性檢測中的應(yīng)用上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 李擎天基因芯片的概念、原理和特點(diǎn)是什么？基因芯片技術(shù)的主要研究步驟是什么？他在病原體耐藥檢測中的應(yīng)用是怎樣的？基因芯片技術(shù)的芯片制備、樣本制備過程是怎樣的？一、基因芯片技術(shù)的概念和原理（一）概述基因芯片技術(shù)是將成千上萬個(gè)代表著不同的寡核苷酸探針，顧向華在支持無的表面上成為芯片，然后將待測的樣品，包括像DNA、RNA CDNA等進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的方式有同位素和銀光標(biāo)記，然后將待測無和同樣的探針進(jìn)行雜交，通過對(duì)雜交信號(hào)的監(jiān)測和處理而得到待測，五種相關(guān)的表達(dá)信息之所以講到相關(guān)基因的表達(dá)信息，因?yàn)橄喈?dāng)一部分基因芯片是來做基因的表達(dá)研究的，基

2、因芯片技術(shù)是建立在探針和再叫測序上的一種高質(zhì)量的序列分析手段。她通過將大量的探針分子固定在支持物上，與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)度以及雜交信號(hào)的分布來進(jìn)行分析，基因芯片技術(shù)可以在一塊一平方厘米大的小芯片上，根據(jù)需要固定成千上萬的基因，以此形成密集的基因方陣，來實(shí)現(xiàn)對(duì)千萬個(gè)基因的同步檢測。（二）基因芯片基本原理基因芯片技術(shù)主要涵蓋了一個(gè)固相的核酸序列，作為他的靶點(diǎn)而以一種或多種標(biāo)記的樣本，也就是說探針與芯片進(jìn)行雜交，還有一個(gè)檢測系統(tǒng)開進(jìn)行定量檢測，基因芯片的基本原理也就是利用基因互補(bǔ)配對(duì)的原則，在一個(gè)載體上來進(jìn)行基因檢測，實(shí)際上是一個(gè)高密度的雜交技術(shù)。由此我們可以得到基因芯片技術(shù)包

3、括以下四個(gè)主要的基本步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測和結(jié)果分析。（三）基因芯片的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)基因芯片的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，主要在于速度快。最新的基因芯片技術(shù)她主要在于雜交時(shí)間可以縮短在一分鐘以內(nèi)；效率高。在一張芯片上可以固化檢測數(shù)千個(gè)基因；成本降低就是使芯片更小，檢測更多樣化；制動(dòng)化程度高，減少人為誤差。（四）基因芯片的檢測過程基因芯片的檢測過程，首先是寡核苷酸的合成，也就是基因芯片的制備，基因芯片的實(shí)質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列，因此制造基因芯片，首先要解決的問題是：要如何在基因芯片上定位，合成高密度的核酸探針，目前基因芯片的合成主要有三種方法：光控化學(xué)合成技術(shù)；雅典印刷發(fā)；點(diǎn)樣發(fā)其中前兩種

4、實(shí)驗(yàn)為合成光控化學(xué)合成技術(shù)，是將故鄉(xiāng)化學(xué)合成個(gè)光科技書，有機(jī)地合成在一起，首先將支持物表面按計(jì)劃或者羥基化。接下來的過程是熒光標(biāo)記與同位素相比，熒光的優(yōu)勢(shì)是：他的低污染可以同時(shí)檢測不同的熒光，不同銀光的顏色可能是不一樣的，不同銀光的耐光不同，隨著外界環(huán)境的干擾和時(shí)間的延伸存在著銀光崔滅現(xiàn)象；第三點(diǎn)需要注意的是：過度標(biāo)記的問題也就是過于高濃度的標(biāo)記，可能是這些銀光集團(tuán)的距離過大而影響最后的檢測效率?；蛐酒臉颖?。包括DNA和RNA芯片DNA準(zhǔn)備相對(duì)比較簡單耳RNA就要注意以下幾點(diǎn)1減少RNA的降解2優(yōu)選RNA純化方法3在標(biāo)記前檢測RNA的量4在標(biāo)記前檢測RNA的質(zhì)量5使用統(tǒng)一的樣本方案以確保檢

5、測的可重復(fù)性因?yàn)樯飿悠返某煞直容^復(fù)雜為了提高準(zhǔn)確性需要先對(duì)樣品進(jìn)行處理比如說來自血液和組織中的DNA或者LRNA樣本要先擴(kuò)征然后再用銀光素來標(biāo)記探針。在芯片這一步要注意的是：要通過預(yù)雜交來優(yōu)化雜交的條件和緩沖液另外芯片雜交過程與我們熟悉的很多面性過程比較類似也就是說嚴(yán)格的洗滌對(duì)實(shí)驗(yàn)的成功是至關(guān)重要的?；蛐酒臋z測技術(shù)最后一步就是數(shù)據(jù)處理，她包括信號(hào)檢測質(zhì)量評(píng)估數(shù)據(jù)整理和聚類分析。首先是原始數(shù)據(jù)的獲取、提取生物樣本的MANA并且反轉(zhuǎn)錄成CDMA在壓箱中與探針進(jìn)行雜交這一類的實(shí)驗(yàn)過程。細(xì)末以后用掃描一部或芯片上的信號(hào)這個(gè)信號(hào)圖像的基因芯片原始數(shù)據(jù)，當(dāng)前已經(jīng)有許多圖片處理的分析軟件，他們能夠定位

6、并且識(shí)別芯片上的每個(gè)雜交點(diǎn)，通過背景調(diào)整或者分割技術(shù)，除去圖像上各種噪聲在頂兩個(gè)鐘信號(hào)輕度比，最后決定基因的變化情況數(shù)據(jù)處理，還包括數(shù)據(jù)處理和分析原始的數(shù)據(jù)化和標(biāo)準(zhǔn)化，并且轉(zhuǎn)化成矩陣以后，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以重中揭示一些化學(xué)分析，目前大致有兩類分析方法：也就是差異分析法和聚類分析法。當(dāng)前對(duì)于基因芯片的分析像純粹和結(jié)果的交流這些方面還缺乏一些大家公認(rèn)的方法。（五）基因芯片的技術(shù)應(yīng)用在基因芯片技術(shù)上的應(yīng)用方面，主要有以下幾個(gè)方面的應(yīng)用：基因表達(dá)分析這是最主要的一點(diǎn)，還有單核苷酸多態(tài)性檢測重復(fù)序列檢測蛋白質(zhì)的分析以及基因測序分析，像DNA的測序分析就是通過大量的固話花核苷酸探針和技術(shù)樣品的靶序列進(jìn)行雜

7、交產(chǎn)生雜交圖譜，并且排列出靶，DNA的序列將銀光標(biāo)記的待測DNA樣品與芯片上的一幀序列片段雜交，假如說二者完全相配則雜交信號(hào)較強(qiáng)；如果不配對(duì)，信號(hào)較弱，經(jīng)表達(dá)分析是一個(gè)方面，它的主要優(yōu)勢(shì)是：自動(dòng)化分析快速，表達(dá)水平的檢測一般用平行對(duì)比的方法?；蛐酒谂R場上的一般應(yīng)用舉了兩個(gè)例子一是藥物代謝，二是白血病的分型。上圖中右面的圖顯示的是藥物代謝，他解釋的是CUYP450基因和差異性用藥的關(guān)系，他和許多的藥物在機(jī)體內(nèi)的代謝有關(guān)系，這也符合我們目前臨場商議中，根據(jù)病人的遺傳背景差異來進(jìn)行差異化用藥的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)；而左圖揭示的是白血病的分型，可以通過基因芯片來分出一些像急性淋巴細(xì)胞白血病急性粒細(xì)胞白血病

8、以及混合細(xì)胞的白血病。二、基因芯片技術(shù)在病原微生物耐藥性檢測的應(yīng)用（一）必要性他的必要性也就是病原性微生物的耐藥性問題日趨嚴(yán)重，接下來分三點(diǎn)：基因芯片技術(shù)在細(xì)菌病毒、寄生蟲、耐藥性監(jiān)測中的應(yīng)用主要的核心內(nèi)容是在細(xì)菌耐藥性檢測中的應(yīng)用。首先我們來看：病原性的耐藥問題日趨嚴(yán)重，這里舉了兩個(gè)例子一個(gè)是金黃色葡萄球菌；另一個(gè)是結(jié)合診治桿菌。左圖顯示的葡萄桿菌，他顯示的是世界衛(wèi)生組織在2007年發(fā)布的衛(wèi)生報(bào)告，在1928年菌霉素被發(fā)現(xiàn)；1942年青霉素得到應(yīng)用而隨后不斷地增長。下面我們來看：基因芯片技術(shù)在細(xì)菌耐藥性檢測的應(yīng)用分論。首先看結(jié)合分支桿菌。首先我們看結(jié)核分枝桿菌這張片子，現(xiàn)實(shí)的是對(duì)于結(jié)核分枝桿

9、菌和異煙肼耐藥性的監(jiān)測，這里多于一些陽性的、陰性的點(diǎn)，提示的是核苷酸乃至氨基酸的變異而導(dǎo)致了它的耐藥，而我們另外應(yīng)當(dāng)注意的一點(diǎn)，包括后面的片子里同時(shí)注意的一點(diǎn)，就是在同樣一個(gè)片子上，還加上了不同的對(duì)照點(diǎn)，像空白陽性和陰性對(duì)照，包括我們?cè)贐圖和C圖的右下角看見的IS6110的插入片段的。上圖是另一個(gè)米撫平和異煙肼耐藥的結(jié)核分枝桿菌的耐藥檢測。第一行顯示的是單個(gè)基因的變異，而第二行揭示的是多個(gè)基因的變異引起的耐藥。上圖顯示的是結(jié)核桿菌利福平的耐藥檢測，她檢測了29處耐藥突變，他的檢測敏感度達(dá)到百分之八十，特異性100%，他檢測的是RDR這個(gè)特意的區(qū)段發(fā)生的區(qū)段和缺失的免疫。接下來繼續(xù)關(guān)注的是結(jié)核分

10、枝桿菌，這里顯示的是一種叫PCA這個(gè)基因的分型，而這種基因適合結(jié)合分支桿菌對(duì)必行酰胺耐藥的有關(guān)系，這里給出了一些數(shù)據(jù)是不同的菌株，它不同的抗性是否對(duì)必行酰胺有抗性，以及基因序列的變化和相應(yīng)的氨基酸序列的變化。我們轉(zhuǎn)到第二個(gè)致菌，也就是金黃色葡萄球菌，這里顯示的對(duì)金黃色葡萄球菌對(duì)所氧氟沙星的抗性，以及甲氧西林抗性基因MARKA的檢測，這里這個(gè)芯片的特點(diǎn)是它是一個(gè)三維芯片，也就是不同層的芯片，它包括一個(gè)外殼，然后將第一層、第二層的芯片采用面對(duì)面的方式重疊，芯片之間留下0.1到20mm高的空隙，而在芯片不同的芯片層之間設(shè)置有密封圈。上圖研究做的是金黃色葡萄球菌對(duì)象甲氧西林、四環(huán)素類、紅霉素以及萬股霉

11、素的耐藥基因檢測，也就是檢測了這個(gè)九個(gè)基因。繼續(xù)葡萄球菌，這個(gè)研究做得是葡萄球菌對(duì)青霉素、甲氧西林、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、以及林可酰胺類抗性基因的檢測，我們也可以從芯片的圖上看到它對(duì)不同抗生素的抗性基因的分布情況。我們轉(zhuǎn)到腸桿菌科，這里做得一個(gè)是對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的超廣光譜內(nèi)酰胺酶，以及治理接到的內(nèi)酰胺酶的抗性基因檢測。上圖顯示的是尿大腸I細(xì)菌中對(duì)佛喹諾酮類抗性的檢測，我們?cè)谟疑辖强吹降娜S圖則是檢測的項(xiàng)目和尿大腸I細(xì)菌的不同的濃度也有關(guān)系。利用基因芯片技術(shù)高同亮的特性，這里對(duì)大腸I細(xì)菌對(duì)三十種抗性基因進(jìn)行檢測，這些檢測對(duì)于大腸I細(xì)菌對(duì)環(huán)境的影響以及他的病原學(xué)和流行病學(xué)的研究都有很重要的意義。（二）利用基因芯片的技術(shù)這一頁設(shè)施一抗生素為主題的系還發(fā)能看見環(huán)境誒就是你卡機(jī)發(fā)放你的希勒對(duì)于等抗性基因。（三）基因芯片技術(shù)在病毒，寄生蟲，耐藥性檢測性的應(yīng)用首先來看流感病毒對(duì)金剛烷耐藥性基因的檢測，我們看到為了顯示的需要，用藍(lán)色表示敏感基因的系列，用紅色表示耐藥性基因的系列。上圖是在我國流行很廣的乙肝病毒，乙肝病毒對(duì)拉美夫定抗性基因的研究，許多研究都是關(guān)注與180和204這兩個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的突變，在左上角的A圖芯片圖中用白色的框來表示突變的點(diǎn)，B圖則是相應(yīng)的測序結(jié)果總結(jié) 作為一種高通量的自動(dòng)化檢測技術(shù)，基因芯片在病原體的檢測和疾病   診斷、藥物靶點(diǎn)篩選、耐藥性和疾