實驗4_DNA片段的分離和回收,質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化-Li

1、實驗五實驗五 瓊脂糖凝膠中DNA片段的分離和回收 分離回收瓊脂糖凝膠中DNA片段 質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化第一部分第一部分 瓊脂糖凝膠中瓊脂糖凝膠中DNADNA片段的分離和回收片段的分離和回收硅基質(zhì)材料法分離回收瓊脂糖凝 膠中DNA片段實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?掌握利用硅基質(zhì)材料法從瓊脂糖凝膠中分離回收DNA片段的原理和操作技術(shù); 了解其他幾種方法的原理與操作技術(shù)。DNA片段分離回收常用方法：片段分離回收常用方法： 電洗脫法 低熔點瓊脂糖凝膠法 DEAE濾膜插片法 玻璃奶法 硅膠膜離心吸附柱法電洗脫法電洗脫法 將含DNA片斷的凝膠放在一個用半透膜隔離的空間中，通過電泳的電流使得DNA離開凝膠進入液相

2、。 回收液相后純化沉淀其中的DNA分子。 低熔點瓊脂糖凝膠法低熔點瓊脂糖凝膠法 將切好的回收膠塊放在回收膠槽內(nèi)，在切去膠塊處加入低熔點瓊脂糖膠，待其凝固后將其小心放回電泳槽繼續(xù)進行電泳。 待目的帶完全進入低熔點瓊脂糖膠后，在長波紫外燈下切下含有所需DNA帶的凝膠條，置于新的EP管中，加300 L TE。 65水浴10 min或更長使膠塊完全融化。 酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。DEAEDEAE濾膜插片法濾膜插片法 將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。 電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會兒，條帶上的DNA被膜片截留。 取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管

3、中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有DNA了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。 這個方法不適合做較大的DNA，因為洗脫比較困難。硅膠膜離心吸附柱法硅膠膜離心吸附柱法實驗原理：實驗原理： 硅膠膜離心吸附柱：在高鹽、低PH值的條件下通過電荷作用結(jié)合DNA，在低鹽、高PH值時釋放DNA。 硅基質(zhì)材料和獨特的緩沖液系統(tǒng)可以高效、專一結(jié)合DNA的，從TAE或TBE瓊脂糖凝膠上回收DNA片段，同時除去蛋白質(zhì)、其它有機化合物、無機鹽離子及寡核苷酸引物等雜質(zhì)，回收100 bp-30 kb DNA片段。DNA 結(jié)合率影響因素：結(jié)合率影響因素： 鹽濃度：鹽濃度： DNA100bp:低鹽狀態(tài)下結(jié)合率高。 pH值：值： p

4、H7.0:結(jié)合率高。應(yīng)應(yīng) 用：用： 從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段； 從DNA反應(yīng)物中純化目的DNA片段，如回收純化PCR產(chǎn)物、酶切連接反應(yīng)中的DNA片段； 從探針制備反應(yīng)中去除未標(biāo)記上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）； DNA濃縮，去鹽及去除雜質(zhì)。本方法的優(yōu)點：本方法的優(yōu)點： 高純度高純度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白質(zhì)及其它有機分子，可直接用于酶切、連接、探針制備、序列測定等； 簡便快速：簡便快速：所需主要儀器是一架臺式離心機；操作過程快速方便，幾十分鐘即可完成。 高效高效：獨特的離心柱和精心配制的緩沖液，保證最大量回收到高純度的目的DNA回收效率達到70%以上； 多樣：

5、多樣：可以回收單鏈、雙鏈DNA片段以及環(huán)狀質(zhì)粒DNA 多用途多用途：可以用于膠回收、PCR產(chǎn)物回收、DNA片段及探針的純化濃縮等； 安全安全：不接觸苯酚、氯仿等有害物質(zhì)。實驗材料：實驗材料： 使用TianGen通用型DNA純化回收試劑盒（ Universal DNA Purification Kit） 平衡液BL（Buffer BL） 30 ml 溶膠液PC（Buffer PC） 25 ml 漂洗液PW（Buffer PW） 15 ml 洗脫緩沖液EB（Buffer EB） 15 ml 無水乙醇方法和步驟：方法和步驟：瓊脂糖/EB凝膠電泳分離DNA片段切取所要的DNA條帶溶解瓊脂糖/EB凝膠上

6、柱，DNA結(jié)合硅膠模離心洗脫DNADNA產(chǎn)量和質(zhì)量測定方法和步驟方法和步驟1瓊脂糖/EB凝膠電泳分離DNA片段。2. 紫外燈下切取目的DNA條帶。3將切下膠塊放入干凈的1.5ml EP管中，稱重，以確定膠條的體積。若凝膠重為0.1g，其體積可視為100 l，則加入100l PC溶液。4. 向膠塊中加入等倍體積溶液PC，50水浴放置10min，不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如有未溶膠塊，可繼續(xù)放置幾分鐘或補加一些溶膠液，直至膠塊完全溶解。方法和步驟方法和步驟5. 柱平衡步驟：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500 l平衡液BL，12,000 rpm (13,400g )

7、離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（平衡液BL的加入能夠改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和穩(wěn)定性，消除高溫/潮濕或其他不良環(huán)境因素對吸附柱造成的影響。）6. 將上述第4步所得溶液加入平衡后的吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm (13,400g )離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。方法和步驟方法和步驟7. 向吸附柱CB2中加入600 l漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm 離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。8. 重復(fù)操作步驟7。9.

8、 將吸附柱CB2放回收集管中，12,000 rpm 離心2 min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，防止殘留漂洗液影響下一步實驗。 漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。方法和步驟方法和步驟10. 將吸附柱CB2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2 min。12,000 rpm 離心2 min收集DNA溶液。注意：洗脫體積不應(yīng)小于30 l，體積過少影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效

9、率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，以防DNA降解。DNA也可以用緩沖液(10 mM Tris-Cl, pH8.0) 洗脫。為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2 min，12,000 rpm離心2 min，將DNA溶液收集到離心管中。11. DNA產(chǎn)量和質(zhì)量測定：適當(dāng)稀釋DNA，測定A260及A280。按照計算公式計算DNA濃度：DNA濃度=吸光度260 x50 x稀釋倍數(shù)mg/mlDNA純度=A260/A280, 1.8表明樣品核酸純度90%。方法和步驟方法和步驟注意事項：注意事項： DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時應(yīng)使用長波紫外燈，切膠時間盡

10、量短，以免對DNA造成損傷。 使用前檢查平衡液BL是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。 對于300 bp的小片段可在加入PN完全溶膠后再加入1/2膠塊體積的異丙醇以提高回收率；膠塊完全溶解后最好將溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在室溫時結(jié)合DNA的能力較強。 吸附柱容積為800 l，若樣品體積大于800 l可分批加入。第二部分第二部分 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的連的連接和轉(zhuǎn)化接和轉(zhuǎn)化實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康牧私庵亟MDNA分子連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原理與基本操作方法。一、一、DNADNA分子的體外連接分子的體外連接實驗原理實驗原理 DNA分子的體外連接：在一定條件下，由DNA

11、連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5端磷酸基團與3端羥基，使二者之間形成磷酸二酯鍵的生物化學(xué)過程。DNA分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補序列基礎(chǔ)上進行的。DNADNA連接酶連接酶 常用的DNA連接酶: 來自大腸桿菌的DNA連接酶 來自噬菌體的T4 DNA連接酶 DNA連接酶作用機理（T4 DNA連接酶為例）： T4 DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物。 酶-ATP復(fù)合物結(jié)合到具有5-磷酸基和3-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。 產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。T7 DNA ligaseT4 DNA ligase注意事項注意事項 連接反應(yīng)的溫度：DNA連接酶的最適反應(yīng)

12、溫度為37，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定。不同公司生產(chǎn)的DNA連接酶的最佳連接溫度不同，對粘性末端與平末端的連接溫度也不同。 連接效率：粘性末端效率高，平末端效率低，因而在底物濃度、酶濃度選擇上存在差異。提高連接效率的方法：提高連接效率的方法： 提高DNA的濃度，增加重組子比例。 缺點：會出現(xiàn)DNA自身連接問題，對于單酶切和平末端的DNA片段尤其如此。 解決方法：對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其5端的磷酸基，防止環(huán)化，通過連接反應(yīng)后形成的缺口在轉(zhuǎn)化細胞后得以修復(fù)。提高連接效率的方法：提高連接效率的方法： 將連接液放置4過夜可以增加連接效果。 連接反應(yīng)結(jié)果檢測： 轉(zhuǎn)化宿主菌，陽性克

13、隆篩選。 DNA凝膠電泳。實驗材料：實驗材料： 純化后的酶切質(zhì)粒載體 目的基因片段 DNA Ligation Mix（Takara） T4 DNA 連接酶 緩沖液系統(tǒng)方法和步驟方法和步驟 反應(yīng)體系： 線性化載體 pCDNA3 （EcoR I 和Xba I 酶切） 3 l（0.1 g）3倍分子的目的基因p38片段 （EcoR I 和Xba I 酶切） 5 lDNA Ligation Mix 8 總體積 16 l蓋上管蓋，混勻，臺式離心機上離心秒。24連接1-3小時。反應(yīng)結(jié)束后于-20保存。 二、重組二、重組DNADNA的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選實驗原理實驗原理: 轉(zhuǎn)化(Transf

14、ormation)：細菌細胞的生物學(xué)特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變。 重組DNA轉(zhuǎn)化：DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。 感受態(tài)(Competence)：通過人工誘導(dǎo)的方法，使自然狀態(tài)下無法發(fā)生轉(zhuǎn)化的細菌，如大腸桿菌，處在易于接受外源DNA分子的狀態(tài)即感受態(tài)，從而使轉(zhuǎn)化得以高效率地進行。 轉(zhuǎn)化子(Transformant)：即轉(zhuǎn)化后的受體菌,又叫重組子。重組子在培養(yǎng)環(huán)境中形成的克隆稱為陽性克隆，外源DNA可在陽性克隆中大量擴增、繁殖、保存以及表達目的基因產(chǎn)物。質(zhì)粒質(zhì)粒

15、DNADNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌：轉(zhuǎn)化大腸桿菌： DNA分子轉(zhuǎn)化步驟：吸附：雙鏈DNA分子吸附于受體菌表面；轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈，一條鏈進入受體菌，另一條降解；自穩(wěn)：外源質(zhì)粒DNA分子的細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；表達：供體基因隨同復(fù)制子同時復(fù)制、分裂、轉(zhuǎn)錄翻譯。 轉(zhuǎn)化效率：105107轉(zhuǎn)化子/g DNA。獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)細菌的制備。感受態(tài)細胞能接受外來感受態(tài)細胞能接受外來DNA 分子的機制分子的機制 局部原生質(zhì)體化假說局部原生質(zhì)體化假說細胞表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA 分子能通過質(zhì)膜進細胞。證據(jù)有： 發(fā)芽的芽孢桿菌容易轉(zhuǎn)化； 大腸桿菌的原生質(zhì)體不能被噬菌

16、體感染，卻能受噬菌體DNA 轉(zhuǎn)化； 適量的溶菌酶能提高轉(zhuǎn)化率。 酶受體假說酶受體假說感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受DNA 的酶位點，使DNA分子能進入細胞。證據(jù)是： 蛋白質(zhì)合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉(zhuǎn)化作用； 細胞分裂過程中，一直有局部原生質(zhì)化，但感受態(tài)只在生長對數(shù)期的中早期出現(xiàn)； 分離到感受態(tài)因子，能使非感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芗毎?。轉(zhuǎn)化子的篩選方法：轉(zhuǎn)化子的篩選方法： 插入失活法 抗性篩選 藍白篩選(互補法) 雜交篩選 免疫學(xué)篩選 酶切圖譜鑒定 菌落PCR鑒定常用方法：常用方法： 抗性篩選法： 菌株為某種抗性缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素、卡拉霉素等），這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含

17、該抗生素的培養(yǎng)基上長出。 互補法： 許多載體（如pUC系列 ）含有一個大腸桿菌-半乳糖苷酶基因(lac z基因)的短區(qū)段，其中含有l(wèi)ac z的調(diào)控序列和頭146個氨基酸編碼區(qū)，這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。而受體菌則含編碼-半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。當(dāng)沒有外源基因插入時，二者融為一體后，有-半乳糖苷酶表達，它能水解培養(yǎng)基中生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal ）形成藍色菌落。而當(dāng)有外源基因插入到多克隆位點，造成插入失活，從而使lac z基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同可以區(qū)分重組子和非重組子。X-gal + IPTG + AMPwith lacZ = blue

18、colony實驗材料實驗材料 LB培養(yǎng)基 質(zhì)粒pCDNA3-p38連接產(chǎn)物（含Amp抗生基因） CaCl2 0.1M Amp DH5 大腸桿菌 感受態(tài)細胞制備感受態(tài)細胞制備1. 將宿主菌DH5 大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37培養(yǎng)1620h。2. 挑取單菌落轉(zhuǎn)入20ml LB培養(yǎng)基錐瓶中，37震蕩過夜。3. 從中取2ml菌液轉(zhuǎn)入50ml LB培養(yǎng)基中37震蕩培養(yǎng)45h，測A600達0.40.5。4. 培養(yǎng)物冰上放置10min。5. 轉(zhuǎn)入一50ml離心管，于4000rpm下4離心10min。6. 棄上清，倒置離心管1min，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2，置冰上10min。7. 5000rpm 4離心10min，棄上清。8. 加入300 l 0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，于4過夜。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 化化 1. 在1.5ml Eppendorf管中加入100 l感受態(tài)細胞和10l pCDNA3-p38 DNA連接反應(yīng)液，溫和混勻，置冰上30分鐘。2. 42水浴4560秒。3. 立即冰浴2分鐘。4. 加入900 l LB培養(yǎng)液，37孵育60分鐘。5. 10000rpm 離心15秒，吸去800上清。用剩余200 l