農(nóng)用微生物菌劑(GB20287-2006)

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農(nóng)用微生物菌劑（GB20287-2006）

前

言

本標準的5.1、5.3和第8章條文為強制性條款，其余為推薦性條款。

本標準的附錄A、附錄C和附錄D為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。

農(nóng)用微生物菌劑

1范圍

本標準規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑（即微生物接種劑）的術(shù)語和定義、產(chǎn)品分類、要求、試驗方法、檢驗規(guī)則、包裝、標識、運輸和貯存。

本標準適用于農(nóng)用微生物菌劑類產(chǎn)品。

2規(guī)范性引用文件（略）

3術(shù)語和定義（略）

4產(chǎn)品分類

產(chǎn)品按劑型可分為液體、粉劑、顆粒型；按內(nèi)含的微生物種類或功能特性可分為根瘤菌菌劑、固氮菌菌劑、解磷類微生物菌劑、硅酸鹽微生物菌劑、光合細菌菌劑、有機物料腐熟劑、促生菌劑、菌根菌劑、生物修復(fù)菌劑等。

5要求

5.1菌種

生產(chǎn)用的微生物菌種應(yīng)安全、有效。生產(chǎn)者應(yīng)提供菌種的分類鑒定報告，包括屬及種的學名、形態(tài)、生理生化特性及鑒定依據(jù)等完整資料。生產(chǎn)者應(yīng)提供菌種安全性評價資料。采用生物工程菌，應(yīng)具有允許大面積釋放的生物安全性有關(guān)批文。

5.2產(chǎn)品外觀（略）

5.3產(chǎn)品技術(shù)指標

5.3.1農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標見表1，其中有機物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標按表2執(zhí)行。

表1

農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標

項

目

劑

型

液體

粉劑

顆粒

有效活菌數(shù)(cfu)a

，億/g(mL)

≥

2.0

2.0

1.0

霉菌雜菌數(shù)，個/g(mL)

≤

3.0×106

3.0×106

3.0×106

雜菌率，

%

≤

10.0

20.0

30.0

水分，%

≤

-

35.0

20.0

細度，%

≥

-

80

80

pH值

5.0~8.0

5.5~8.5

5.5~8.5

保質(zhì)期b，月

≥

3

6

a

復(fù)合菌劑，每一種有效菌的數(shù)量不得少于0.01億/g(mL)；以單一的膠質(zhì)芽胞桿菌（Bacillusmucilaginosus）制成的粉劑產(chǎn)品中有效活菌數(shù)不少于1.2億/g。

b

此項僅在監(jiān)督部門或仲裁雙方認為有必要時檢測。

表2

有機物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標

項目

劑

型

液體

粉劑

顆粒

有效活菌數(shù)(cfu)，億/g(mL)

≥

1.0

0.50

0.50

纖維素酶活a，U/g（mL）

≥

30.0

30.0

30.0

蛋白酶活b，U/g(mL)

≥

15.0

15.0

15.0

水分，%

≤

-

35.0

20.0

細度，%

≥

-

70

70

pH值

5.0～8.5

5.5～8.5

5.5～8.5

保質(zhì)期c，月

≥

3

6

a

以農(nóng)作物秸稈類為腐熟對象測定纖維素酶活。

b

以畜禽糞便類為腐熟對象測定蛋白酶活。

c

此項僅在監(jiān)督部門或仲裁雙方認為有必要時檢測。

5.3.2農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品中無害化指標見表3。

表3

農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的無害化技術(shù)指標

參數(shù)

標準極限

糞大腸菌群數(shù)，個/g(mL)

≤

100

蛔蟲卵死亡率，%

≥

95

砷及其化合物（以As計），mg/kg

≤

75

鎘及其化合物（以Cd計），mg/kg

≤

10

鉛及其化合物（以Pb計），mg/kg

≤

100

鉻及其化合物（以Cr計），mg/kg

≤

150

汞及其化合物（以Hg計），mg/kg

≤

5

6試驗方法

6.1儀器設(shè)備（略）

6.2試劑（略）

6.3產(chǎn)品參數(shù)的檢測

6.3.1外觀(感官)的測定

取少量樣品放到白色搪瓷盤(或白色塑料調(diào)色板)中，仔細觀察樣品的顏色、形狀、質(zhì)地。

6.3.2有效活菌數(shù)的測定

采用平板計數(shù)法，根據(jù)所測微生物的種類選用適宜的培養(yǎng)基。

若采用最大可能數(shù)（MostProbableNumber，MPN）5管法，遵照附錄C的規(guī)定。

6.3.2.1系列稀釋

稱取樣品10g（精確到0.01g），加入帶玻璃珠的100mL的無菌水中(液體菌劑取l0.0mL加入90mL的無菌水中)，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即成母液菌懸液（基礎(chǔ)液）。

用無菌移液管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加入45mL無菌水中，按1:10進行系列稀釋，分別得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀釋的菌懸液（每個稀釋度應(yīng)更換無菌移液管）。

6.3.2.2加樣及培養(yǎng)

每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，用無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1mL，加至預(yù)先制備好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。

每一稀釋度重復(fù)3次，同時以無菌水作空白對照，于適宜的條件下培養(yǎng)。

6.3.2.3菌落識別

根據(jù)所檢測菌種的技術(shù)資料，每個稀釋度取不同類型的代表菌落通過涂片、染色、鏡檢等技術(shù)手段確認有效菌。當空白對照培養(yǎng)皿出現(xiàn)菌落數(shù)時，檢測結(jié)果無效，應(yīng)重做。

6.3.2.4菌落計數(shù)

以出現(xiàn)20~300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標準（絲狀真菌為10~150個菌落數(shù)），分別統(tǒng)計有效活菌數(shù)目和雜菌數(shù)目。當只有一個稀釋度，其平均菌落數(shù)在20～300個之間時，則以該平均菌落數(shù)計算。若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20～300個之間時，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定。若其比值小于等于2應(yīng)計算兩者的平均數(shù)；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計算。有效活菌數(shù)按式（1）或式（2）計算：

nm

=

kv1/(m0v2)

×10-8

…（1）

nv

=

kv1/(v0v2)

×10-8

…（2）

式中：

nm

—質(zhì)量有效活菌數(shù)，

億/g

nv

—體積有效活菌數(shù)，

億/mL

—菌落平均數(shù)，

個

k

—稀釋倍數(shù)

v1

—基礎(chǔ)液體積，

mL

v2

—菌懸液加入量，

mL

v0

—樣品量，

mL

m0

—樣品量，

g

6.3.3霉菌雜菌數(shù)的測定

采用馬丁培養(yǎng)基，測定方法同6.3.2。

6.3.4雜菌率的測定

除樣品有效菌外其它的菌均為雜菌。樣品中雜菌率按式（3）計算：

m

=

n1/(n1+n)×100

…（3）

式中：

m

—樣品雜菌率，

%

n1

—雜菌數(shù)，

億/g(mL)

n

—有效活菌數(shù)，

億/g(mL)

6.3.5水分的測定

將空鋁盒置于干燥箱中105

℃±2

℃烘干

0.5h，冷卻后稱量記錄空鋁盒的質(zhì)量。然后稱取2份平行樣品（顆粒型樣品，應(yīng)先粉碎過1.0mm試驗篩），每份20g（精確到0.01g），分別加入鋁盒中并記錄質(zhì)量。將裝好樣品的鋁盒置于干燥箱中105

℃±2

℃下烘干4h~6h。取出置于干燥器中冷卻20min后進行稱量。水分含量按式（4）計算（結(jié)果為兩次測定的平均值）：

w

=(m1-

m2)/(

m1-

m0)

×100

…（4）

式中：

w

—樣品水分含量，

%

m0

—空鋁盒的質(zhì)量，

g

m1

—樣品和鋁盒的質(zhì)量，

g

m2

—烘干后樣品和鋁盒的質(zhì)量，

g

6.3.6細度的測定

6.3.6.1粉劑樣品

稱取樣品50g（精確到0.1g），放入300mL燒杯中，加200mL水浸泡10min~30min后倒入孔徑0.18mm的試驗篩中，然后用水沖洗，并用刷子輕輕地刷篩面上的樣品，直至篩下流出清水為止。將試驗篩連同篩上樣品放入干燥箱中，在105

℃±2

℃烘干4h

~6h。冷卻后稱量篩上樣品質(zhì)量。樣品細度按式（5）計算：

s

={1-

m1/[

m0（1-w）]}

×100

…（5）

式中：

s

—篩下樣品質(zhì)量分數(shù)，

%

m0

—樣品質(zhì)量，

g

w

—樣品含水量，

%

m1

—篩上干樣品質(zhì)量，

g

6.3.6.2顆粒樣品

稱取樣品50g（精確到0.1g），將兩個不同孔徑的試驗篩（1.0mm和4.75mm）摞在一起放在底盤上(大孔徑試驗篩放在上面)。樣品倒入大孔徑試驗篩內(nèi)篩樣品，然后稱小孔徑試驗篩上的樣品質(zhì)量。顆粒細度按式（6）計算：

g

=

m1

/m0

×100

…（6）

式中：

g

—

樣品質(zhì)量分數(shù)，

%

m1

—

小孔徑試驗篩上樣品質(zhì)量，g

m0

—

樣品質(zhì)量，

g

6.3.7pH值的測定

打開酸度計電源預(yù)熱30min，用標準溶液校準。

pH值的測定，每個樣品重復(fù)三次，計算三次的平均值。

6.3.7.1液體樣品

用量筒取40mL樣品放入50mL的燒杯中，直接用酸度計測定，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。

6.3.7.2粉劑樣品

稱取樣品15g，放入50mL的燒杯中，按1:2(樣品:無離子水)的比例將無離子水加到燒杯中(如果樣品含水量低，可根據(jù)基質(zhì)類型按1:3~1:5的比例加無離子水)，攪拌均勻。然后靜置30min，測樣品懸液的pH值，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。

6.3.7.3顆粒樣品

樣品先研碎過1.0mm試驗篩，按照6.3.7.2的方法測定。

6.3.8糞大腸菌群數(shù)的測定

應(yīng)符合GB/T19524.1《肥料中糞大腸菌群的測定》的規(guī)定。

6.3.9蛔蟲卵死亡率的測定

應(yīng)符合GB/T19524.2《肥料中蛔蟲卵死亡率的測定》的規(guī)定。

6.3.10纖維素酶活、蛋白酶活的測定

應(yīng)符合附錄D的規(guī)定。

6.3.11砷、鎘、鉛、鉻、汞的測定

應(yīng)符合GB18877—2002中的5.12~5.17的規(guī)定。

6.3.12保質(zhì)期的檢驗

在產(chǎn)品說明書標明的保質(zhì)期前，按6.3.1~6.3.11方法測定產(chǎn)品相應(yīng)指標。

7檢驗規(guī)則

本標準中產(chǎn)品技術(shù)指標的數(shù)字修約應(yīng)符合GB8170的規(guī)定；產(chǎn)品質(zhì)量合格判定應(yīng)符合GB1250中修約值比較法的規(guī)定。

7.1抽樣

按每一發(fā)酵罐菌液（或每批固體發(fā)酵）加工成的產(chǎn)品為一批，進行抽樣檢驗，抽樣過程嚴格避免雜菌污染。

7.1.1抽樣工具

無菌塑料袋(瓶)，金屬勺、抽樣器、量筒、牛皮紙袋、膠水、抽樣封條及抽樣單等。

7.1.2抽樣方法和數(shù)量

一般在成品庫中抽樣，采用隨機法抽取。

抽樣以件為單位，小包裝以每一包裝箱為一件。隨機抽取3~5件，每件中隨機抽取一袋(瓶)；若每袋(瓶)包裝小于500g（mL）的產(chǎn)品，應(yīng)多抽幾件。大包裝產(chǎn)品以一袋(桶)為一件，隨機抽取5~10件，在無菌條件下，每件取樣500g(mL)，然后將抽取樣品混勻，按四分法分裝3袋(瓶)，每袋（瓶）不少于500g(mL)。

7.2檢驗分類（略）

7.3判定規(guī)則

7.3.1具下列任何一條款者，均為合格產(chǎn)品

a.

檢驗結(jié)果各項技術(shù)指標均符合標準要求的產(chǎn)品；

b.

在產(chǎn)品的外觀、水分、細度、pH值等檢測項目中，有1項不符合要求，而其它各項技術(shù)指標符合要求的產(chǎn)品。

7.3.2具下列任何一條款者，均為不合格產(chǎn)品

a.

有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標；

b.

霉菌雜菌數(shù)不符合技術(shù)指標；

c.

雜菌率不符合技術(shù)指標；

d.

糞大腸菌群不符合技術(shù)指標；

e.

蛔蟲卵死亡率不符合技術(shù)指標；

f.

砷、鎘、鉛、鉻、汞中任一含量不符合技術(shù)指標；

g.

有機物料腐熟劑產(chǎn)品中所測酶活不符合技術(shù)指標；

h.

在外觀、水分、細度、pH值等檢測項目中，有2項（含）以上不符合要求。

8包裝、標識、運輸和貯存

參見NY885-2004《農(nóng)用微生物產(chǎn)品標識要求》

附錄A

常用檢測培養(yǎng)基

參見NY/T1114-2004《微生物肥料實驗用培養(yǎng)基技術(shù)條件》

附錄B

（資料性附錄）

常用染色劑

B.1革蘭氏染色劑

B.1.1結(jié)晶紫染色液（Hucker氏配方）

甲液：結(jié)晶紫（Crystalviolet）

2.0g

乙醇(95%)

20.0mL

乙液：草酸銨[(NH4)2C2O4?H2O]

0.8g

蒸餾水

80.0mL

甲、乙兩液相混，過濾，棕色瓶保存。

B.1.2盧哥(Lugol)氏碘液

碘(I2)片

1.0g

碘化鉀(KI)

2.0g

蒸餾水

300mL

先溶碘化鉀于少量蒸餾水中，再將碘溶于碘化鉀溶液中，可稍加熱，最后加足蒸餾水，棕色瓶保存。

B.1.3脫色液

95%的乙醇液。

B.1.4復(fù)染液

0.5%的番紅水溶液（SafraninO)

2.5%的番紅酒精溶液

20mL

蒸餾水

80mL

B.2芽胞染色液

B.2.1孔雀綠染色液（Malachitegreen）

孔雀綠

5.0g

蒸餾水

100mL

B.2.20.5%番紅染色液

B.3石碳酸復(fù)紅染色液

甲液：堿性復(fù)紅(Basicfuchsin)

0.3g

95%酒精

10.0mL

乙液：石碳酸(PhenoecrystalsC.P)

5.0g

蒸餾水

95mL

將甲、乙兩液混合后即得石碳酸復(fù)紅染色液原液。染色時，將原液稀釋5~10倍使用。

附錄C

（規(guī)范性附錄）

稀釋法（MPN5管法）

C.1稀釋

稱取樣品10.0g，加入帶玻璃珠的100mL的無菌水中(液體菌劑取l0.0mL加入90mL的無菌水中)，靜置20min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，即得到1×101稀釋度的菌懸液。

用無菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀釋度的菌懸液（每個稀釋度應(yīng)更換無菌移液管）。

C.2加樣

選擇適宜的5個連續(xù)稀釋度，用無菌移液管分別吸取不同稀釋度的菌懸液1.0mL，加到已準備好的盛有9.0mL無菌培養(yǎng)基的螺口試管中，每一稀釋度重復(fù)接5支試管（不同稀釋度間更換無菌移液管），同時用無菌培養(yǎng)液作對照。

C.3培養(yǎng)

接種后立即擰緊塑料帽并搖勻，將接種好的試管放到適宜的條件下培養(yǎng)。

C.4計算

根據(jù)各稀釋系列試管中有無待測微生物生長或其生理反應(yīng)的正或負得出數(shù)量指標，并在相應(yīng)的MPN統(tǒng)計表中查出近似值（見表C1），即可計算出待測樣品的有效活菌數(shù)，以億個/mL或億個/g表示。

計算方法：

1mL（g）樣品中的有效活菌數(shù)=菌數(shù)近似值×數(shù)量指標第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)

C.5計數(shù)規(guī)則

在稀釋系列中必須最后一個稀釋度所有重復(fù)間都沒有微生物生長。確定數(shù)量指標系取稀釋系列中所有重復(fù)都有生長(或是正反應(yīng))的最高稀釋度為數(shù)量指標的第一位數(shù)字，總共取三個連續(xù)稀釋管的結(jié)果查表。

C.5.1在全部5支試管中均出現(xiàn)生長的稀釋度中，把出現(xiàn)生長的稀釋度倍數(shù)最高的那一級放入數(shù)列。例如：為5-5-3-0-0時，則取5-3-0數(shù)列；

C.5.2在全部5支試管中均不出現(xiàn)生長的稀釋度中，把稀釋度倍數(shù)最低的那一級放入數(shù)列。例如：為5-3-0-0-0時，則取5-3-0數(shù)列；

C.5.3如果應(yīng)用上述兩條規(guī)則，會出現(xiàn)采用如5-5-4-3-0這樣的4個等級的稀釋度的情況。此時，可先取前面的5-4-3數(shù)列，后取4-3-0數(shù)列，分別求出lgMPN，然后算出其真數(shù)的平均值。在此列中，數(shù)列5-4-3的lgMPN為1.447，數(shù)列4-3-0的lgMPN為0.431+1（后一數(shù)列與前一數(shù)列相應(yīng)稀釋了10倍，故要加1進行校正），（1.447+1.431）/2=1.439，所以MPN=27.5。

表C.1

MPN，lgMPN表

陽性試管數(shù)

MPN

（相當于第一稀釋管1毫升）

LgMPN