流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用技巧

1、金從國(guó)金從國(guó)2009.11 2009.11 深圳深圳 利用流式細(xì)胞儀利用流式細(xì)胞儀( flow cytometer ) 通過(guò)檢測(cè)熒光通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞信號(hào)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)（表面或胞漿或胞核）的物理、化學(xué)特性并通過(guò)這些特性對(duì)細(xì)胞或顆粒核）的物理、化學(xué)特性并通過(guò)這些特性對(duì)細(xì)胞或顆粒進(jìn)行進(jìn)行定量。定量。 & 檢測(cè)表面標(biāo)記物檢測(cè)表面標(biāo)記物 & 檢測(cè)胞漿標(biāo)記物檢測(cè)胞漿標(biāo)記物 & 檢測(cè)胞核內(nèi)標(biāo)記物檢測(cè)胞核內(nèi)標(biāo)記物 & 檢測(cè)可溶性蛋白檢測(cè)可溶性蛋白流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）一、流式細(xì)胞儀的原理一、流式

2、細(xì)胞儀的原理應(yīng)用技巧的基應(yīng)用技巧的基礎(chǔ)礎(chǔ)光源：光源：激光激光(488nm 氬離子空冷激光氬離子空冷激光) 細(xì)胞：細(xì)胞： 單細(xì)胞懸單細(xì)胞懸液液 液流：液流：鞘液鞘液(sheath fluid) 流動(dòng)室：流動(dòng)室：flow cell檢測(cè)器：檢測(cè)器：光電倍增管光電倍增管(pmt)檢測(cè)信號(hào)：檢測(cè)信號(hào)：散射光散射光(fs，ss)，熒光信號(hào)，熒光信號(hào)(fl1fl4)統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī) 用熒光標(biāo)記抗體用熒光標(biāo)記抗體抗體特異性地結(jié)合細(xì)抗體特異性地結(jié)合細(xì)胞上對(duì)應(yīng)的抗原胞上對(duì)應(yīng)的抗原表達(dá)該抗原的細(xì)胞被表達(dá)該抗原的細(xì)胞被標(biāo)記上熒光；標(biāo)記上熒光；抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒抗原表達(dá)多的細(xì)胞熒光強(qiáng)度強(qiáng)光強(qiáng)度強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞

3、百分比或濃度陽(yáng)性細(xì)胞百分比或濃度靶蛋白濃度靶蛋白濃度（1）、直標(biāo)和間標(biāo)）、直標(biāo)和間標(biāo)（2）、細(xì)胞膜標(biāo)和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)）、細(xì)胞膜標(biāo)和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)（3）、兩種染色：抗體和染料）、兩種染色：抗體和染料（4）、組合標(biāo)記）、組合標(biāo)記間接免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法直接免疫熒光標(biāo)記直接免疫熒光標(biāo)記法法cd3, cd4, cd8, tetramercytokinesdnacd3,4,8, tetramer+cytokinescd3,4,8, tetramer+dnacytokines+dnacd3,4,8, tetramer+cytokines+dna（1）、方案：兩種圖形（散點(diǎn)圖、直方圖）、方案：兩種圖形（散點(diǎn)

4、圖、直方圖）（2）、百分率信息、強(qiáng)度信息）、百分率信息、強(qiáng)度信息（3）、分群：細(xì)胞大?。ǎ⒎秩海杭?xì)胞大?。╢s）細(xì)胞內(nèi)顆粒（）細(xì)胞內(nèi)顆粒（ss）（4）、設(shè)閾值、設(shè)門(mén)特征（細(xì)分）、設(shè)閾值、設(shè)門(mén)特征（細(xì)分）（5）、直接信息、間接信息）、直接信息、間接信息二、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧一二、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧一 整合項(xiàng)目，樹(shù)立體系化概念，整合項(xiàng)目，樹(shù)立體系化概念，提高流式使用價(jià)值提高流式使用價(jià)值患者出現(xiàn)癥狀患者出現(xiàn)癥狀各種抗原（參照白血病各種抗原（參照白血病抗原選擇原則）抗原選擇原則）診斷白血病，確診疾診斷白血病，確診疾病，對(duì)白血病進(jìn)行分病，對(duì)白血病進(jìn)行分型以指導(dǎo)治療型以指導(dǎo)治療治療治療初診時(shí)所用抗原

5、中能夠代初診時(shí)所用抗原中能夠代表白血病細(xì)胞的特殊抗原表白血病細(xì)胞的特殊抗原評(píng)價(jià)療效及治療的療評(píng)價(jià)療效及治療的療程程同上同上緩解期緩解期動(dòng)態(tài)跟蹤患者緩解期動(dòng)態(tài)跟蹤患者緩解期的白血病細(xì)胞變化，的白血病細(xì)胞變化，及時(shí)控制在相應(yīng)水平及時(shí)控制在相應(yīng)水平下下臨床過(guò)程臨床過(guò)程fcm檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)項(xiàng)目意義意義治療前病人免治療前病人免疫狀況評(píng)價(jià)疫狀況評(píng)價(jià)t亞群、亞群、nk、cik、細(xì)、細(xì)胞因子胞因子是否適合做、能否能是否適合做、能否能培養(yǎng)、值得做培養(yǎng)、值得做cik采集采集mncmnc數(shù)目、純度、數(shù)目、純度、 t亞群、亞群、nk、cik數(shù)目及比例數(shù)目及比例是否達(dá)到培養(yǎng)要求、是否達(dá)到培養(yǎng)要求、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)mn

6、c數(shù)目、數(shù)目、 t亞群、亞群、nk、cik數(shù)目及比例、數(shù)目及比例、cd3、cd8活化狀況活化狀況培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸培養(yǎng)是否達(dá)標(biāo)、回輸時(shí)機(jī)時(shí)機(jī)回輸后回輸后t亞群、亞群、nk、cik、細(xì)胞、細(xì)胞因子因子療效評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)、下療效評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)、下次治療的時(shí)機(jī)次治療的時(shí)機(jī)cik治療程序治療程序fcm檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)項(xiàng)目意義意義云云 南南 省省 腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 術(shù)術(shù) 報(bào)報(bào) 告告 單單 生物免疫治療檢測(cè)報(bào)告生物免疫治療檢測(cè)報(bào)告 門(mén)診號(hào): 住院號(hào): 42435 姓 名 曹淑英 性別 女 年齡 75 科別 腹一 編號(hào) 52 病床號(hào) 臨床診斷 胃癌術(shù)后

7、 送檢標(biāo)本 培養(yǎng)物 日期 2006 年 02 月 13 日 流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果：流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果： 采 集 前 培 養(yǎng) 后 項(xiàng) 目 % abs（610） % abs（610） cd45+cd3+ 58.5 1068 95.5 679 cd45+cd3+cd4+ 30.8 - 60.8 - cd45+cd3+cd8+ 21.1 - 21.4 - cd45+cd3-cd56+ 17.0 245 4.6 33 cd45+cd3+cd56+ 0.5 7 43.4 310 hla dr-cd3+ 54.8 - 24.1 - hla dr+cd3+ 15.3 - 67.2 - hla dr-cd

8、8+ 31.0 - 14.9 - hla dr+cd8+ 2.0 - 20.7 - 檢測(cè)日期 2006 年 01 月 13 日 2006 年 01 月 20 日 送檢醫(yī)生 周永春 實(shí)驗(yàn)者 金從國(guó)、李佳 報(bào)告日期 2006 年 02 月 20 日 基礎(chǔ)免疫水平基礎(chǔ)免疫水平t亞群、亞群、nk、cik當(dāng)?shù)夭煌挲g、性別、當(dāng)?shù)夭煌挲g、性別、民族的免疫水平基礎(chǔ)民族的免疫水平基礎(chǔ)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)高危人群高危人群hiv檢測(cè)陽(yáng)性檢測(cè)陽(yáng)性t亞群、亞群、nk、cik、 cd4凋亡、細(xì)胞因子凋亡、細(xì)胞因子hiv檢測(cè)陽(yáng)性前的免檢測(cè)陽(yáng)性前的免疫水平變化狀況及疫水平變化狀況及cd4的凋亡的凋亡t亞群、亞群、nk、cik 、cd

9、3、cd4、cd8活化狀況、活化狀況、細(xì)胞細(xì)胞因子、因子、cd4凋亡凋亡hiv陽(yáng)性陽(yáng)性aids檢出檢出hiv到發(fā)病的情到發(fā)病的情況況aids病人治療病人治療t亞群、亞群、nk、cik、細(xì)胞、細(xì)胞因子、因子、cd4凋亡、凋亡、 cd3、cd4、cd8活化狀況活化狀況療效評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)、治療效評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)、治療效果及病情動(dòng)態(tài)觀療效果及病情動(dòng)態(tài)觀察察aids過(guò)程過(guò)程fcm檢測(cè)項(xiàng)目檢測(cè)項(xiàng)目意義意義供者動(dòng)員效果監(jiān)測(cè)圖051015202530358月4日8月5日8月5日8月6日8月6日8月7日8月7日8月8日8月8日wbc(x 109/l)mnc(x108/l)cd34+ ( x 106/l)云云 南南 省省

10、腫腫 瘤瘤 醫(yī)醫(yī) 院院 腫腫 瘤瘤 研研 究究 所所 流流 式式 細(xì)細(xì) 胞胞 術(shù)術(shù) 報(bào)報(bào) 告告 單單 干干/ /祖細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)報(bào)告祖細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)報(bào)告 流式號(hào)： 門(mén)診號(hào): 住院號(hào) 外院 姓 名 李艷華 性別 男 年齡 25 科別 外院 標(biāo)本號(hào) 20070919 病床號(hào) 8 臨床診斷 nhl 送檢標(biāo)本 外周血 日期 2007 年 09 月 19 日 流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果：流式細(xì)胞檢測(cè)及分析結(jié)果： 項(xiàng)目 相對(duì)計(jì)數(shù) 絕對(duì)計(jì)數(shù) mnc 41.1% 30 x 108/l cd34+ 1.0% 30 x 106/l cd34+cd38- 0.9% 27 x 106/l cd34+cd38- 0.1

11、% 3 x 106/l 送檢醫(yī)生 何迪 實(shí)驗(yàn)者 金從國(guó)、陳曉群 報(bào)告日期 2007 年 09 月 19 日 凋亡啟動(dòng)凋亡啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ca2+ 動(dòng)員動(dòng)員 caspase激活激活脫水致細(xì)胞皺縮脫水致細(xì)胞皺縮核染色質(zhì)凝縮核染色質(zhì)凝縮 線粒體膜電位喪失線粒體膜電位喪失 細(xì)胞膜細(xì)胞膜ps外翻外翻 核碎片形成核碎片形成dna被切割成低分子量片段被切割成低分子量片段細(xì)胞內(nèi)酸化細(xì)胞內(nèi)酸化凋亡小體形成凋亡小體形成三、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧二三、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧二利用儀器的靈活性，充分整合項(xiàng)目利用儀器的靈活性，充分整合項(xiàng)目1 1、cikcik細(xì)胞作用腫瘤細(xì)胞的凋亡分細(xì)胞作用腫瘤細(xì)胞的凋亡分析析2 2、不同細(xì)

12、胞的轉(zhuǎn)染、表達(dá)情況、不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、表達(dá)情況3 3、不同分型增殖的細(xì)胞分布、不同分型增殖的細(xì)胞分布4 4、spsp細(xì)胞、非細(xì)胞、非spsp細(xì)胞細(xì)胞 5、腫瘤細(xì)胞診斷時(shí)、腫瘤細(xì)胞診斷時(shí) （1）、胸腹水：把白細(xì)胞和癌細(xì)胞分開(kāi)）、胸腹水：把白細(xì)胞和癌細(xì)胞分開(kāi) （2）、穿刺，手術(shù)細(xì)胞：）、穿刺，手術(shù)細(xì)胞： 6、組織中的浸潤(rùn)細(xì)胞：、組織中的浸潤(rùn)細(xì)胞：7、th1/th2細(xì)胞的分析細(xì)胞的分析四、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧三四、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧三 利用儀器提供的參數(shù)，對(duì)所做利用儀器提供的參數(shù)，對(duì)所做實(shí)驗(yàn)全面分析評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)全面分析評(píng)價(jià)1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中：、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中： 轉(zhuǎn)染率轉(zhuǎn)染率 疫苗疫苗 轉(zhuǎn)染的強(qiáng)度轉(zhuǎn)染的強(qiáng)度2、同

13、時(shí)分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強(qiáng)度、同時(shí)分析轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)染強(qiáng)度3、稀有細(xì)胞的額外發(fā)現(xiàn)：、稀有細(xì)胞的額外發(fā)現(xiàn)： t亞期中：亞期中：cd45+、cd3+、cd4-、cd8- nk細(xì)胞：細(xì)胞：cd3-cd16+56+ cd3+cd16+56+4、tunecl方法中方法中 不同周期的凋亡狀況不同周期的凋亡狀況 細(xì)胞阻滯狀況細(xì)胞阻滯狀況 dna斷片發(fā)生時(shí)斷片發(fā)生時(shí)sos狀況狀況五、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧四五、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧四 了解相關(guān)知識(shí)及現(xiàn)有的評(píng)價(jià)方法，了解相關(guān)知識(shí)及現(xiàn)有的評(píng)價(jià)方法，充分應(yīng)用流式細(xì)胞充分應(yīng)用流式細(xì)胞熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙熒光顯微鏡下經(jīng)丫啶橙/溴化乙啶染色溴化乙啶染色sgc-7901細(xì)胞24hsgc

14、-7901蒿甲醚組24 hsgc-7901 ddp組24hecv-304細(xì)胞 24hecv-304蒿甲醚組24hecv-304 ddp組24 h六、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧五六、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用技巧五 專項(xiàng)應(yīng)用中的問(wèn)題及解決方案專項(xiàng)應(yīng)用中的問(wèn)題及解決方案免疫細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)免疫細(xì)胞相對(duì)絕對(duì)計(jì)數(shù)造血干細(xì)胞和其他稀有細(xì)胞的檢測(cè)造血干細(xì)胞和其他稀有細(xì)胞的檢測(cè)血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測(cè)血小板活化、膜糖蛋白及抗體檢測(cè)dna倍體分析，周期、異倍體分析倍體分析，周期、異倍體分析細(xì)胞內(nèi)因子（細(xì)胞內(nèi)因子（th1/th2）細(xì)胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）細(xì)胞因子（體液及培養(yǎng)液因子）各種凋亡檢測(cè)（各種凋亡檢測(cè)（apo.

15、2.7 tunecl、dna亞二倍體）亞二倍體）組織中免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞（如組織中免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞（如cxcr、ccr）基因蛋白檢測(cè)（如基因蛋白檢測(cè)（如p53、bcl-2等）等）白血病免疫分型白血病免疫分型b27檢測(cè)檢測(cè)動(dòng)物檢測(cè)過(guò)程中的問(wèn)題動(dòng)物檢測(cè)過(guò)程中的問(wèn)題免疫細(xì)胞的檢測(cè)免疫細(xì)胞的檢測(cè)t細(xì)胞細(xì)胞 分群標(biāo)志分群標(biāo)志 活化標(biāo)志活化標(biāo)志 亞群標(biāo)志亞群標(biāo)志b細(xì)胞細(xì)胞nk細(xì)胞細(xì)胞cik細(xì)胞細(xì)胞以以t細(xì)胞亞群檢測(cè)為例，其余的免疫細(xì)胞出現(xiàn)的問(wèn)題類似細(xì)胞亞群檢測(cè)為例，其余的免疫細(xì)胞出現(xiàn)的問(wèn)題類似1、標(biāo)準(zhǔn)方案、標(biāo)準(zhǔn)方案 抗抗 凝凝 血血 組組 織織 胸腹水、灌洗液（單細(xì)胞懸液）胸腹水、灌洗液（單細(xì)胞懸液）加

16、入加入1ml 溶血素（溶血素（nh4cl或或c液或液或a、b、c液）液） 上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè) 結(jié)果：結(jié)果：cd3+ t cell ：%、abs cd4+ t cell ：%、abs cd8+ t cell ：%、abscd4/ cd8比值比值 2hr內(nèi)加入內(nèi)加入 100ul flow count （100ul/份）份） + 10ul 抗體標(biāo)本標(biāo)記抗體標(biāo)本標(biāo)記 15-30 min2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法（1）、標(biāo)本環(huán)節(jié)）、標(biāo)本環(huán)節(jié) 抗凝血：抗凝血： a、抗凝效果不好：如果沒(méi)有大的凝血塊，該血可以使、抗凝效果不好：如果沒(méi)有大的凝血塊，該血可以使 用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時(shí)最

17、好采用用，但結(jié)果可能受影響。設(shè)閾值時(shí)最好采用fl1 （cd45所在所在）;如果有大的凝血塊，不能用于檢測(cè)。如果有大的凝血塊，不能用于檢測(cè)。 b、標(biāo)本在、標(biāo)本在4或以下放置過(guò)：一般不做檢測(cè)用?；蛞韵路胖眠^(guò)：一般不做檢測(cè)用。 c、標(biāo)本放置時(shí)間大于、標(biāo)本放置時(shí)間大于48小時(shí)：檢測(cè)時(shí)盡量用小時(shí)：檢測(cè)時(shí)盡量用fl1設(shè)閾值。設(shè)閾值。 建議：最好使用新鮮標(biāo)本檢測(cè)，尤其是做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)。建議：最好使用新鮮標(biāo)本檢測(cè)，尤其是做絕對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)。 d、動(dòng)物血：對(duì)于豬、猴、兔、狗等大動(dòng)物的，如人一樣、動(dòng)物血：對(duì)于豬、猴、兔、狗等大動(dòng)物的，如人一樣 處理。而如小白鼠等小動(dòng)物，由于所采血量少，需要處理。而如小白鼠等小動(dòng)物，由于所

18、采血量少，需要 先溶血，后加樣處理。如需做絕對(duì)計(jì)數(shù)，則要求計(jì)算先溶血，后加樣處理。如需做絕對(duì)計(jì)數(shù)，則要求計(jì)算 稀釋倍數(shù)，比如稀釋倍數(shù)，比如10ul血加入血加入490ul溶血素相當(dāng)于稀釋了溶血素相當(dāng)于稀釋了 350倍。倍。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法組織標(biāo)本：組織標(biāo)本： 組織標(biāo)本做免疫細(xì)胞時(shí)，通常需要組織標(biāo)本做免疫細(xì)胞時(shí)，通常需要cd45設(shè)行設(shè)行，這樣可排，這樣可排 除非血細(xì)胞。除非血細(xì)胞。a、組織標(biāo)本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：、組織標(biāo)本通常不需要研磨，只需用針頭反復(fù)搗碎便可：這樣可以減少組織細(xì)胞的量。這樣可以減少組織細(xì)胞的量。b、穿刺細(xì)胞：手術(shù)標(biāo)本需要反復(fù)清洗表

19、面附有的血液，、穿刺細(xì)胞：手術(shù)標(biāo)本需要反復(fù)清洗表面附有的血液，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。c、組織標(biāo)本一般保存在生理鹽水中。、組織標(biāo)本一般保存在生理鹽水中。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法胸腹水、灌洗液胸腹水、灌洗液： 通常也需要通常也需要cd45設(shè)門(mén)設(shè)門(mén)a、都需要濃縮處理：一般取、都需要濃縮處理：一般取250ml左右，靜置左右，靜置4hr后取沉后取沉淀物離心。淀物離心。b、如果需要計(jì)數(shù)，則需做體積換算，比如、如果需要計(jì)數(shù)，則需做體積換算，比如250ml500ul，相當(dāng)于濃縮了，相當(dāng)于濃縮了500倍。倍。組織、胸腹水標(biāo)本，希望做組織、胸腹水標(biāo)本，希望做2次過(guò)濾，第一次

20、為標(biāo)記前，次過(guò)濾，第一次為標(biāo)記前，采用采用200目過(guò)濾，第二次為上機(jī)檢測(cè)前，采用目過(guò)濾，第二次為上機(jī)檢測(cè)前，采用300目過(guò)濾。目過(guò)濾。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法（2）、抗體環(huán)節(jié)）、抗體環(huán)節(jié)試劑選擇試劑選擇a、盡量選擇試劑組合多的作為標(biāo)記抗體，比如、盡量選擇試劑組合多的作為標(biāo)記抗體，比如t亞群亞群cd45/cd4/cd3/cd8：最佳選擇最佳選擇cd4/cd8/cd3： 可用，但做起來(lái)會(huì)有很多麻煩可用，但做起來(lái)會(huì)有很多麻煩單一抗體：?jiǎn)我豢贵w： 不可用不可用 2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法b、選擇試劑時(shí)，不但需要選擇陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)也需要選、選擇試劑時(shí)，不但需要選

21、擇陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)也需要選擇陰性標(biāo)記。擇陰性標(biāo)記。比如：比如：cd4t 細(xì)胞細(xì)胞cd45+cd3+cd4+cd8- b 細(xì)胞細(xì)胞cd19+cd3- nk 細(xì)胞細(xì)胞cd3-cd16+56+ cd34+ 細(xì)胞細(xì)胞cd34+cd38-尤其在科研項(xiàng)目中，一般應(yīng)選擇尤其在科研項(xiàng)目中，一般應(yīng)選擇2-3個(gè)陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)選個(gè)陽(yáng)性標(biāo)記，同時(shí)選擇擇1-2個(gè)陰性標(biāo)記，否則所做出來(lái)的結(jié)果將會(huì)有很大誤差。個(gè)陰性標(biāo)記，否則所做出來(lái)的結(jié)果將會(huì)有很大誤差。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法c、在醫(yī)學(xué)中，一般標(biāo)記抗原較弱的，需選擇較強(qiáng)的染料，、在醫(yī)學(xué)中，一般標(biāo)記抗原較弱的，需選擇較強(qiáng)的染料，尤其我們?cè)谧鱿∮屑?xì)胞的時(shí)候

22、，比如尤其我們?cè)谧鱿∮屑?xì)胞的時(shí)候，比如dc細(xì)胞，細(xì)胞，cd34細(xì)胞，細(xì)胞，cik細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，一般均選擇標(biāo)記細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞等，一般均選擇標(biāo)記pe細(xì)胞。細(xì)胞。標(biāo)記條件：標(biāo)記條件：一般一般18 25，如果溫度低或高效果都不好，如果溫度低或高效果都不好標(biāo)記時(shí)間：標(biāo)記時(shí)間：根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于根據(jù)所用試劑量決定，一般不得低于15 min。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法標(biāo)記的先后順序標(biāo)記的先后順序 a、先標(biāo)記膜表面的，后標(biāo)記胞漿內(nèi)、先標(biāo)記膜表面的，后標(biāo)記胞漿內(nèi) b、先處理、先處理抗體抗體，后加染料，后加染料 c、透膜處理后的標(biāo)本不能強(qiáng)烈振蕩。、透膜處理后的標(biāo)本不能

23、強(qiáng)烈振蕩。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法 溶血環(huán)節(jié)溶血環(huán)節(jié)溶血素的選擇溶血素的選擇 a、a b 液（主要是甲酸成分），一般需要專門(mén)的制備儀液（主要是甲酸成分），一般需要專門(mén)的制備儀 c b、nh4cl（主要成分是（主要成分是nh4cl 、nh4hco3、edta ） c、溶血素、溶血素c（專配試劑）（專配試劑）2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法 自配溶血素要求：自配溶血素要求： a、必須在儀器試驗(yàn)后方可使用、必須在儀器試驗(yàn)后方可使用 b、有條件時(shí)需做、有條件時(shí)需做ph、微粒分析、微粒分析 c、放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，尤其是、放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，尤其是a液液2、可能的問(wèn)題及解

24、決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法溶血液加入可能出現(xiàn)的問(wèn)題溶血液加入可能出現(xiàn)的問(wèn)題 溶血效果不好溶血效果不好v 溫度問(wèn)題：溫度問(wèn)題：c液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放液溶血和溫度關(guān)聯(lián)較大，一般不能放 4冰冰 箱，可以采用水浴箱，可以采用水浴 37 v 溶血?jiǎng)┎粔颍嚎梢噪x心后追加溶血?jiǎng)┤苎獎(jiǎng)┎粔颍嚎梢噪x心后追加溶血?jiǎng)?以上處理如果還不可以，則需要選擇：以上處理如果還不可以，則需要選擇：不重要的標(biāo)本不重要的標(biāo)本：重新再標(biāo)記：重新再標(biāo)記重要而又沒(méi)有剩余的標(biāo)本重要而又沒(méi)有剩余的標(biāo)本：反復(fù)離心，選擇：反復(fù)離心，選擇1200-2000轉(zhuǎn)左轉(zhuǎn)左右的速度，建議每次離心均加入右的速度，建議每次離心均加入2-3mlnh

25、4cl溶血素。溶血素。有些抗體或染料對(duì)酸比較敏感：有些抗體或染料對(duì)酸比較敏感：比如比如pe標(biāo)記，溶血后會(huì)使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜標(biāo)記，溶血后會(huì)使其脫離，但這種現(xiàn)象是可逆的，靜置置10 -30 min2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法加入加入flowcout環(huán)節(jié)環(huán)節(jié) flowcout必須在加入溶血素后才能加入，否則會(huì)影響檢測(cè)必須在加入溶血素后才能加入，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)加入結(jié)果，同時(shí)加入flowcout后后 2 hr 后必須上機(jī)檢測(cè)。后必須上機(jī)檢測(cè)。2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法（5）、檢測(cè)出結(jié)果環(huán)節(jié)：）、檢測(cè)出結(jié)果環(huán)節(jié)：a、上機(jī)前需要搖勻標(biāo)本，儀器開(kāi)機(jī)

26、超過(guò)、上機(jī)前需要搖勻標(biāo)本，儀器開(kāi)機(jī)超過(guò)30min，flow check 10% 2% 外電壓穩(wěn)定等等。外電壓穩(wěn)定等等。b、方案盡量采用完整方案，比如方案盡量采用完整方案，比如t亞群：亞群：由于由于flowcout微球在所有通道上都有信號(hào)，一般選擇沒(méi)有使用微球在所有通道上都有信號(hào)，一般選擇沒(méi)有使用的熒光通道作為收集通道，如果沒(méi)有剩余通道，就選擇熒光較的熒光通道作為收集通道，如果沒(méi)有剩余通道，就選擇熒光較強(qiáng)的染料所在的通道強(qiáng)的染料所在的通道方案是實(shí)現(xiàn)正確操作和得到正確結(jié)果的平臺(tái)，建議建立方方案是實(shí)現(xiàn)正確操作和得到正確結(jié)果的平臺(tái)，建議建立方 案時(shí)盡量建立完整方案案時(shí)盡量建立完整方案2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法c、檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)結(jié)果1）、檢測(cè)結(jié)果必須嚴(yán)格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如）、檢測(cè)結(jié)果必須嚴(yán)格按醫(yī)學(xué)含義得到，比如 cd4+t細(xì)胞細(xì)胞cd45+cd3+cd4+cd8-(百姓定義上的結(jié)果百姓定義上的結(jié)果) (醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果醫(yī)學(xué)定義上的結(jié)果) 2、可能的問(wèn)題及解決辦法、可能的問(wèn)題及解決辦法2）、相對(duì)計(jì)數(shù)：一般醫(yī)院檢測(cè)）、相對(duì)計(jì)數(shù)：一般醫(yī)院檢測(cè)t亞群時(shí)可以只做相對(duì)數(shù)，這亞群時(shí)可以只做相對(duì)數(shù)，這樣就可以樣就可以使用使用prism門(mén)，門(mén)，cd3+%、cd4+%、cd8+ %，如果