小鼠泛素結(jié)合酶UBE2W的抗體制備及組織表達譜分析

1、生物工程學報 cjbochin j biotech 2008, april 25; 24(4): 547-552 chinese journal of biotechnology issn 1000-3061 c 2006 institute of microbiology, cas a csm. all rights reserved研究報告小鼠泛素結(jié)合酶ube2w的抗體制備及組織表達譜分析張瑩瑩，朱恒奇，趙莉?qū)捴軙晕?，黃培堂軍事疾學科學院生物工程研究所.北京100071摘 要：迂素結(jié)合陣(e2)是妥白迂素化修飾所需的第二個連接峰.在迂素轉(zhuǎn)移和底物構(gòu)異性識別過程中發(fā)喬著篁妥作 用.ube2w

2、是一種新更現(xiàn)的e2峰.其果蠅屬同源長白可能在光紂導或視網(wǎng)膜變性過程中發(fā)揮作用，樂和人同源妥白功 能未見報道.生物信息學分析ube2w雙源氮氐酸序列.發(fā)現(xiàn)ube2w具有典型的ubc體構(gòu)域并在多種物種高度保守. 通過構(gòu)建ube2w原植裊達質(zhì)粒，在大腸桿菌中裊達并純化了 gst-ube2w融合安白以此鈍化妥白作為杭原免疫新西 生白兔制備抗ube2w多抗血清，并利用制備的ube2w抗原柱親和林化ube2w多抗.為了檢測純(化抗體料異44.在 a核細胞中瞬時表達了 mycube2w*k合蛋白，分別用myc單軌和ube2w多抗進行western blotting分析，結(jié)果及明獲 得了構(gòu)異性的ube2w抗體

3、.利用此抑異性抗體在小鼠腦、心臟、胃臟、肝臟.肺、肌角.脾臟和率丸等組織中均檢 測到了 ube2w的表達，且在小鼠奉丸中成年期表達最高.關健詞：迂素結(jié)合4lube2w,抗體,組織裊達語generation of mouse ube2w antibody and analysis of ube2w expression in mouse tissuesyingying zhang, hengqi zhu, lixia zhao, xiaowei zhou, and peitang huangbeijing institute of biotechnology. beijing 100071. c

4、hinaabstract: ubiquitin conjugating enzyme functions as the second enzyme required for protein ubiqjitination and plays an important rok in ubiquiun transferring and substrate specific recognition. ube2w； a newly described member of e2 family, was formeriy reported probably involving in phototransdu

5、ction or retinal degeneration in drosophila. in this study, we report that murine ube2w harbors a typical ubc domain and is highly conserved in different vertebrate homologues. gst-tagged ube2w was expressed in e. coli bl21 (de3) and purified with gst affinity chromatography. using this antigen* we

6、generated and further separated rabbit polyclonal antibody of (jbe2w, of which the activity and specificity were confirmed by immuncblotting of transiently expressed myc-ube2w fusion protein. wide expression of ube2w was found in brain, muscle, heart, lung, liver, spleen, kidney and testis of mouse

7、with the generated antibody, indicating the functional importance of this novel protein. furthermore, the ube2w highly expression was confined to the adult testis and was developmental suge-specific.keywords: ubiquitin conjugating enzyme, ube2w. antibody, tissue expression profile蛋白泛素化是真核細胞內(nèi)廣泛存在的一種蛋

8、白用，如基因表達調(diào)控、細胞周期調(diào)控、dna損傷修翻譯后修飾方式，其在多種生物途徑中發(fā)揮重要作復及細胞凋亡等11】。蛋白泛素化需要一系列泛素相ftomlv»d: august 15. 2007: accepted: september 18. 2007supported by： the natioml natural sciences foundation of chin* (no. 30470379).corrwpondlng author： xiaowei zhou. tel: 8-10-66948832; e-mail: amm%832。i 國家自然科學基金x目(no. 3047

9、0379)費助張毒瑩等：小鼠泛索結(jié)合iwube2w的抗體制備及組織表達譜分析550關酶的參與0”首先，在消耗atp情況下，泛素激 活醉(e1醉)半胱氨酸活性位點與泛索c端甘氨酸 (gly)形成高能破酹鍵而活化泛素；然后通過轉(zhuǎn)酯作 用將活化的泛素轉(zhuǎn)移至泛索結(jié)合酶(e2醐)，并與之 形成第二個高能破酷鍵；最后，在e2醐作用下，催 化泛索c端的甘氨酸(gly)與底物蛋白的賴氨酸 (lysb氨基基團之間形成異肽鍵而將泛素轉(zhuǎn)移至底 物蛋白。有些e2解可以通過其末端結(jié)構(gòu)立接識別底 物蛋白，但大多數(shù)e2醯還需要泛素連接酶(e3酶) 的幫助才能將泛素分子轉(zhuǎn)移給底物蛋白。e3醉可以 特異性識別底物蛋白和特定e2

10、酶，從而直接或間接 催化泛素從e2酶向底物蛋白的轉(zhuǎn)移。泛素結(jié)合酶是蛋白泛素化修飾所需的第二個連 接酶，在各物種中均有發(fā)現(xiàn)并高度保守。它們都有 一個約150個氨基酸組成的ubc結(jié)構(gòu)域和一保守的 活性半胱氨酸，在泛索-e2的硫酯鍵形成中起關鍵 作用網(wǎng)。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同 e2的一般分作四類叫i 類e2旃僅含有150犯的核心ubc結(jié)構(gòu)域；ii類e2 醐除了含有一個核心ubc結(jié)構(gòu)域外，還具有一個c 末端的延伸結(jié)構(gòu);iii類e2酶則僅含有一個n末端延 伸；iv類e2酸則同時具有n端和c端延伸結(jié)構(gòu)。 這些延伸結(jié)構(gòu)介導了 e2酶的亞細胞定位或(和)特定 底物識別“°川。ube2w是我們實驗室毋近鑒定出

11、的一個能夠與 范可尼貧血蛋白fancl相互作用的e2醉，目前僅 有果蠅屬同源基因47220于果蠅復眼感光細胞中富 集的報道，提示可能在光轉(zhuǎn)導或視網(wǎng)膜變性過程中 發(fā)揮作用“2,。為進一步研究其功能，本研究對其氨 基酸序列進行了初步的生物信息學分析，以推測可 能的生物學功能。在此基礎上，構(gòu)建原核表達載體、 制備并純化ube2w多抗，并檢測了 ube2w在小鼠 組織中的表達潛。1材料與方法1.1 材料1.1.1 菌株和質(zhì)粒大腸桿菌 dh5a、bl21(de3)及質(zhì)粒 pgex-6p-l 由本室保存；質(zhì)粒pcmv-myc/ubc2w由盧柏松博士 構(gòu)建。1.1.2 細胞系和實驗動物293ft細胞由本室保

12、存；雌性新西蘭白兔購自 軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。1.1.3 工具酶、試劑和抗體taq plus dna聚合薛購自上海生工；限制性內(nèi) 切陶、t4 dna連接酶如自neb公司；細胞轉(zhuǎn)染試 制 lipofectamine 2000 購自 invitrogen 公司,gst 親和純化預裝柱 gstrapeff、2-d quant kit. hrp 標記的gst抗體、pvdf膜和ecl顯色試劑盒購自 amersham公司，弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自 sigma,抗體親和純化試劑盒aminolink® plus immobilization kit 購自 pierce 公司；抗 myc 鼠

13、單 克隆抗體購自tiangen公司，抗b-actin鼠單克隆 抗體、hrp標記的羊抗鼠igg和羊抗兔igg購自 santa cratz公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 ube2w氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域分析利用 ncbi 數(shù)據(jù)庫上 blast (http:/www.ncbi. n】/blast/)軟件對ube2w氨基酸序列進 行搜索，得到ube2w在各物種中的同源蛋白序列, 利用蛋白質(zhì)序列分析軟件dnaman v5.2.2對各同 源序列進行多重序列比對。利用ncbi數(shù)據(jù)庫上 cdd(htlp:/cdd/)軟件和 pdb 數(shù)據(jù)

14、庫(http:/pdb。分別對 ube2w 蛋 白的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)溝進行分析,rasmol v2.7.3 軟件讀取責白三維結(jié)構(gòu)分子數(shù)據(jù)文件。1.2.2 ube2w基因的擴增以表1中所列序列為上、下游引物.以質(zhì)粒 pcmv-myc/u從2w為模板,退火溫度55,常規(guī) pcr反應25個循環(huán)，擴增出ube2w基因全長。上游 引物中加入bamhi位點，下游引物加入no”位點。pcr擴增所用的引物及其序列table 1 primers used for am plincation of ubelwprimerssequences5-cgqfiiccatggcgtcaatgcag

15、aube2w-bamh ifube2n<a 1raacgact-3,sttgcgcccgctcaacaagtgtcatcatgataccacc-3r1.2.3 表達載體的構(gòu)建用bamh 1和nor i雙醉切pcr產(chǎn)物和pgex-6p-l 載體，瓊脂糖凝膠電泳純化、回收ube2基因和線 性化載體，t4 dna連接酶16。(：連接過夜。連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5a,經(jīng)克隆篩選，獲得插入 ube2片段的pgex6pl/be2w重組子。挑取單克 隆進行醯切鑒定并測序。1.2.4 ube2w 在bl2mde3)中的表達將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl2kde3), 37培養(yǎng)過夜。挑選轉(zhuǎn)化子，

16、分別于25和37 條件下培養(yǎng)細菌至00600=08再分別轉(zhuǎn)移至20 和37條件下，1 mmol/l iptg誘導表達14 ho離 心收集菌體，gst抗體進行western blotting檢測網(wǎng) 合蛋白的表達以轉(zhuǎn)化了 pgex-6p.1空載體的 bl21(de3)作為對照。對25培養(yǎng)、20。：誘導表達 的細菌進行超聲破碎，分別以3000 g、6000 g和 12000 g離心裂解產(chǎn)物15 min,收集沉淀和上清， gst抗體進行western blotting檢測融合蛋白以何種 形式表達。1.1.1 融達產(chǎn)物的純化收集菌體并重懸于80 ml pbs中，置于冰上超 聲破碎，12000 g離心15

17、 min收集上清。在akta purifier蛋白純化系統(tǒng)上，將上清以0.8 ml/min的速 率通過gst親和純化柱gstrap ff,用gst elution buffer (50 mmol/l tris-hclt 10 mmol/l 還原 型谷胱甘肽，ph 8.0)進行連續(xù)梯度洗脫gst融合蛋 白。依據(jù)系統(tǒng)中uv.檢測蛋白洗脫曲線收集純化 蛋白，sds-page ft western blotting 進行檢測. 純 化蛋白經(jīng)hiprep26/10 desalting柱除去谷胱甘肽 后,2.d quant kit測定蛋白濃度。1.2.6 兔多抗血清的制舒和純化0.2 mg純化蛋白與弗氏完

18、全佐劑混合后，進行 皮下免疫，以后每隔3周，用0.1 mg抗原與弗氏不 完全佐劑乳液進行加強免疫.共進行4次，于每次 加強免疫前一周小盤抽取兔血進行elisa檢測抗體 效價。免疫結(jié)束后1周內(nèi)，每天從耳緣靜脈取血 10-20ml,直至抗體效價下降，心臟一次完全取血。 所有血液立即于4 5000 g離心10 min收獲血清。 按照pierce公司抗體純化試劑盒說明,將血清與 樣品緩沖液(0 025 mol/ltris, 0.15 moi/l nacl, ph7.2) 等體積混合,緩緩通過偶聯(lián)有純化gst-ube2w融 合蛋白的抗原親和柱，樣品緩沖液洗滌親和柱后，加 人 8 ml 洗脫緩沖液(0.1

19、 mol/l glycine-hcl, ph3.0) 洗脫抗體。每管收集1 ml,sds-page檢測。1.2.7 ube2w多抗特異性檢測在24孔細胞培養(yǎng)板中，用lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒pcmv-myc/ube2w 0.8 gg至293ft細胞，瞬時表達融合蛋白myc-ube2wo50心 ixsds上樣緩沖液裂解細胞后，取裂解液8hl上樣， 分別用純化的ube2w抗體(1 :500)和myc標簽單抗 (1 : 2000)進行western blotting檢測。以轉(zhuǎn)染了空載 體和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞為陰性對照，以bactin為上 樣量內(nèi)參照。1.2.8 ube2w在小

20、鼠各組織中的表達譜脫臼法處死成年雄性昆明小鼠，取小鼠腦、腎、 肝、肺、脾、掣丸(不同年齡)、心、肌肉等組織,在 預冷的pbs(ph7.4)中剝?nèi)パ芎徒钅げ⒓羲榻M織塊, 按1 :比例加入含蛋白酶抑制劑的ripa裂解液，冰上勻漿 30-40 min。4 15000 g 離心 30 min. 吸取上清.分別用ube2w多抗(1 : 125)和。actin(l : 2000)單抗進行 western blotting 檢測。2結(jié)果2.1 ube2w具有一個典型的ubc結(jié)構(gòu)域blast結(jié)果顯示,ube2w在人、類人猿、猿猴、 小鼠、原雞、非洲始蛛、蜜蜂和岡比亞按蚊等種屬 均存在同源氨基酸序列，且具有較

21、高的序列一致性， 尤其在人、類人猿、琳猴和小鼠等哺乳動物中相似 性高達90%以上。cdd數(shù)據(jù)庫和pdb數(shù)據(jù)庫搜索 結(jié)果顯示，小鼠源ube2w蛋白中包含著一個典型 ubc結(jié)構(gòu)域，其人同源蛋白具有ubc典型三維結(jié)構(gòu), 并在ubc結(jié)構(gòu)中存在1個保守的活性半胱氨酸(圖 1).這一般被認為在e2番結(jié)合和轉(zhuǎn)移泛索活性中發(fā) 揮作用。2.2 裝達純化ube2w抗原經(jīng)常規(guī)pcr擴增，獲得全長約450 bp的小鼠 汕e2w cdna片段(圖2),將其插入pgex-6p-l載體， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl2kde3),經(jīng)不同溫度q5c和 37。培養(yǎng)和不同溫度(20°c和37。誘導后,gst和 gst融合蛋白在25

22、條件下培養(yǎng)的細菌中獲得明 顯表達(圖3a)0將25。(：培養(yǎng)、20誘導表達的細 菌進行超聲破碎，經(jīng)不同轉(zhuǎn)速離心分離細菌裂解懸 液各組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標蛋白在上清和沉淀中均存 在(圖3b)。此結(jié)果表明在25培養(yǎng)、20誘導條 件下,ube2w在bl21(de3)中獲得可溶性表達。按照優(yōu)化后表達條件，大鼠培養(yǎng)、表達ube2w 融合蛋白，利用gst親和純化柱gstrap ff對其 進行純化，經(jīng)10 mmol/l還原性谷胱甘肽梯度濃度j552issn1000-3061 cn11-1998/qchin j biotechapril 25,2008 vol.24 no.4 31tinmn i«wy

23、ui;廿 hi inmlfldnnrwvrv :«2圖1生物僖息學分析ube2w二級結(jié)構(gòu)(a)和高級結(jié)構(gòu)(b)fig. 1 structure of ube2wa: ube2w conu.ns a typical ubc domain and a conserved active cystine (asterisk) showed in cdd database; b: structural ribbon ofube2w (the human homologous protein of cg722o) in the rasmol software shows that ube2w h

24、arbors a typical ubc domainj3000 20001200800500圖2 pcr擴增如e2w基因片段fig. 2 amplication of 血2w from pcmv,myc/血2w1: pcr products of 血2w; 2: dna marker洗脫，獲得了純度較高的ube2w蛋白，濃度測定為2.5 mg/mlo sds-pgae 和 western blotting 檢測部分 樣品結(jié)果見圖4。23制備ube2w特異性多抗抗ube2w多抗血清經(jīng)抗原親和柱純化、 sds-page分析后，可以清晰看到抗體重鏈、輕鏈 （圖5）0為檢測純化后ube2w多抗的特異

25、性，分別 利用商業(yè)化myc標簽單抗和純化多抗進行western blotting對在直核細胞中表達的ube2w蛋白進行檢 測。結(jié)果顯示，同myc標簽抗體一樣，利用此純化 多抗同樣可以在myc-ube2w蛋白預期大?。s 19 kd）處檢測到特異條帶（圖6）。此雄果表明我們獲 得了特異性較好的ube2w多抗。2.6 ube2w在小鼠組織中廣泛表達利用純化后的抗ube2w抗體，通過western blotting方法分析ube2w在小鼠各組織中的表達。 結(jié)果顯示在小鼠各組織中均檢測到了與預期大小一cultured in 25 v cultured in j7 1；6p.|/ubc'mind

26、uced at 20i：3456 m圖3 gst-ube2w融合蛋白在大腸桿菌bl21(de3)中的表達fig. 3 gst-ube2w fusion protein expressed in e. coli bl21 (de3)a: conditions for expression of gst-ube2w in bl21 (de3); m: protein marker; the arrowhead indicates the expressed fusion prexein b:the formation ofgst-ube2w expressed in bl2! (de3); 1:

27、bl21; 2: bl21/gst-ubcm; 3: 3000 g precipitation; 4: 6000 g precipiution;5: 12 000 g precipiuiion; 6: supemaunt; m: protein marker554 issn 1000-3061 cn11-1998/qchin j biotechapril 25. 2008 vol 24 no.4圖4 gst親和純化ube2w融合蛋白fig. 4 ube2w fusion protein purified by gstrap affinitychromatographya: sds-page o

28、f purified gst tagged ube2w protein; b: western blotting analysis of purified protein 致的目標條帶（圖7）,表明ube2w在小鼠組織中是 廣泛表達的，且除睪丸組織外，在各組織表達垃均 極低。進一步檢測ube2w在小鼠不同發(fā)育時期睪 丸中的表達，發(fā)現(xiàn)ube2w在泰丸組織中的表達隨 著年齡的增長而增加（圖8）。圖7 ube2w在小鼠組織中廣泛表達fig. 7 extensive expression of ube2w in moose tissuesjl bk2w圖8 ube2w在小鼠量丸不同發(fā)育時期的表達 fi

29、g. 8 developmental stage-specificity of ube2w expression in mouse testis一 30圖s sds-page分析純化的ube2w抗體fig. 5 ube2w antibody purified by athnity chromatography圖6 ube2w抗體檢測細胞瞬時表達的ube2w蛋白fig. 6 high-specificity of ube2w polyclonal antibodymyc-ube2w transiently expressed in 293ft ceils was analyzed byimmun

30、oblotting with ube2w antibody (a) and myc antibody (b);m: protein marker3討論在蛋白質(zhì)功能研究中，抗體是最宜接、有效的 傳統(tǒng)工具。特異性抗體常常用于蛋白質(zhì)的亞細胞定 位分析、抗原在組織或細胞中的表達譜分析以及發(fā) 現(xiàn)和鑒定與抗原蛋白相互作用的蛋白質(zhì)等諸多方 面“3為了研究ube2w的功能，我們利用大腸桿 需表達的鼠源ube2w微合蛋白免疫新西蘭白兔制 備多抗血清，考慮到融合蛋白中gst標簽可能在免 空動物過程中對抗體生成造成影響,我們曾構(gòu)建了 特his標簽的ube2w表達載體,但在各種誘導表達 條件下，目的蛋白均未荻得有效表

31、達。我們也曾進 斤傅切gst標簽，但切除標簽后,ube2w蛋白極易 發(fā)生沉淀。因此,我們采用gst-ube2w融合蛋白 直接進行免疫新西蘭白兔,然后利用純化的 3st-ube2w蛋白制備抗原親和柱.以通過抗原親 和純化制備出高特異性抗體。從對ube2w抗體的 mestern blotting特異性檢測結(jié)果看.ube2w抗體基 本可以同商品化myc標簽抗體一樣用于ube2w的 western blotting 檢測。生物信息學分析發(fā)現(xiàn),ube2w在各物種中的同 源序列具有較高的序列一致性（85%）,表明 ube2w在進化上具有高度的保守性。在本研究中, 我們利用制備的特異性抗體，通過wester

32、n blotting 分析，發(fā)現(xiàn)ube2w在小雙組織中是廣泛表達的,且 在睪丸組織中的表達量明顯高于其它組織（圖7）,進 一步對不同年齡的小鼠睪丸組織分析發(fā)現(xiàn)ube2w 在黑丸組織中的表達隨著年齡的增長而增加，成年 期表達量增至最高（圖8）0巳有文獻報道，果蠅屬同 源基因cg7220在果蠅復眼感光細胞中富集皿。這 些提示ube2w可能在參與普遍生命過程的同時也 參與某些組織特異的功能發(fā)生過程，如生殖細胞發(fā) 育和光轉(zhuǎn)導或視網(wǎng)膜變性等。生物信息學分析還發(fā) 現(xiàn),ube2w包含一個育度保守的ubc結(jié)構(gòu)域，且無 任何末端延伸，提示ube2w可能是一個i型e2酶。 s. cerevisiae ubc4/5

33、是i類e2酶的典型代表，并在 許多短命蛋白或異常蛋白的泛素依賴性降解中起重 要作用口汽因此ube2w具有i類泛素結(jié)合酶結(jié)構(gòu)提 示其可能也在泛素依賴的蛋白降解過程中起作用。ube2w所定位的人8號染色體q21.1區(qū)域常常存在 基因高度擴增并導致癌癥的發(fā)生，在ube2w基因上 下不到15 mb的范置內(nèi)存在著巾。家族成員tpd52 和pc、e3醉wwpi和轉(zhuǎn)錄延伸因子b tc£b1等 癌基因|以叫這些基因的擴增均已證明在癌癥的發(fā) 生發(fā)展中起著重要作用。本研究制備了 ube2w特異性多抗，并檢測了 ube2w在小鼠組級中的表達，為研究鼠源和人源 ube2w蛋白的功能及其可能參與的疾病奠定了基

34、礎。致 謝 美國 wake forest university health sciences 盧柏松博士為本研究提供原始質(zhì)粒和技術指導，在 此表示感謝。references1 smalle j. vierstn rd. the ubiquitin 26s proteasome proteolytic pathway. annu rc plant bid. 2004,55:555-590.2 sun lj. cben zj. the novel functions of ubiquitination io signaling. cell biology. 2004. u: 11-126.3 p

35、ickart cm. ubiquitin io chains. tibs. 2000, 25: 544-548.4 cheng fk. cory h. tbyoko t, kari h, et al. rad6 plays a role in transcriptional activation through ubiquitylation of histone h2b. genes and development. 2004. 18: 184-195.5 nandi d. tahiliani p, kumar a. chandu d. the ubiquitin，proteasome sys

36、tem. j biosci, 2006,31: 137-155.6 hershko a. ciechanover a. varshavsky a. et al. the ubiquitin-proceasome. not med. 2000,6(10): 73-84.7 robinson pa. ardley hc. ubiquitin-protein ligases. cell sci. 2004.117:5191-5194.8 cook wj. jeffrey lc. sullivan ml. ct al. three dimensional structure of an ubiquit

37、io conjugating enzyme (.jbiolchem. 1992.267:15116-15121.9 cook wj. jeffrey lc, xu y. er al. tertiary structures of class i ubiquiun-conjugatiog enzymes are highly conserved: crystal ttrocture of yeast ubc4. j biol chern, 1993,32: 1380-13817.10 kolman cj, toth j9 gonda dk identification of a portable

38、 determinant of cell cycle function within the auboxyl- termini! domain of the yeast cdc34 (ubc3) ubiquitin conjugating (e2) enzyme. embo jt 1992. u: 3081-3090.11 silver et. gwozd tj, ptak ct al. a chimeric ubiquitin conjugating enzyme that combines the cell cycle properties of cdc34 (ubc3) and the

39、dna repair properties of rad6 (ubc2): implications for the structure, function, and evolution of the e2s. embo j. 1992. 11: 3091-3098.12 yang zy. edenberg hjt davis rl. isolation of mrna from specific tissues of drosophila by mrna tagging. nud acids res. 2005,33: e!48.13 xu h. lee sj. suzuki er a/.

40、a lysosomal tetraspamn associated with retinal degeneration identified via a genome-wide screen. embo j. 2004, 23: 811-822.14 ed harlow. david j. antibodies, a laboratory manual. new york: cold spring harbor laboratory press. 1998, pp. 282-318.15 seuferc w, jeotsch s. ubtquitin-conjugatiag enzymes u

41、bc4 and ubc5 mediate selective degradation of shortlived and abnormal prouins. embo j. 1990. 9: 543-550.16 wang rx, xu jc. outi saranumki« et al. prlz, a novel prosute-ipecific and androgen-responsive gene of the tpd52 family, amplified in chromosome 8q21.1 and overexpressed in human prostate c

42、ancer. cancer res. 2004, 64: 1589-1594.17 porkka k, sanunlki o, tanner m. et al. amplification and overexpressioa of elongin c gene discovered in prostate cancer by cdna micrcarrayt. lab invest. 2002, 82(5): 629-637.18 chen c, sun x, guo p. et al. ubiquitio e3 ligase wwpi as an oncogenic factor in h

43、uman prostate cancer. oncogene. 2007. 26: 2386-2394.小鼠泛素結(jié)合酶ube2 w抗體制備及組織表達譜分析cb丈聚斡共作者：張瑩瑩，朱恒奇，趙莉霞，周曉巍，黃培堂，yingying zhang , hengqi zhu , lixia zhao , xiaowei zhou , peitang huang作者單位：軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所北京100071刊名：生物工程學報英文刊名：chinese journal of biotechnology年，卷（期）： 被引用次數(shù)：2008,24(4)2次參考文獻(18條)1. smalle j;vie

44、rstra rd the ubiquitin 26s proteasome proteolytic pathway外文期刊2004(0)2. sun lj;chen zj the novel functions of ubiquitination in signaling外文期刊20043. pickart cm ubiquitin in chains外文期刊20004. cheng fk;cory h;toyoko t;karl h rad6 plays a role in transcriptional activation through ubiquitylation of histon

45、e h2b外文期刊20045. nandi d;tahiliani p;kumar a;chandu d the ubiquitin-proteasome system外文期刊20066. hershko a;ciechanover a;varshavsky a the ubiquitin-proteasome外文期刊2000(10)7. robinson pa;ardley hc ubiquitin-protein ligases 外文期刊20048. cook wj;jeffrey lc;sullivan ml three dimensional structure of an ubiqu

46、itin conjugating enzyme (e2) 19929. cook wj;jeffrey lc;xu y tertiary structures of class i ubiquitin-conjugating enzymes are highly conserved:crystal structure of yeast ubc4 199310. kolman cj;toth j;gonda dk identification of a portable determinant of cell cycle function withinthe carboxyl-terminal

47、domain of the yeast cdc34 (ubc3) ubiquitin conjugating (e2) enzyme199211. silver et;gwozd tj;ptak c a chimeric ubiquitin conjugating enzyme that combines the cell cycleproperties of cdc34 (ubc3) and the dna repair properties of rad6 (ubc2):implications for the structure,function,and evolution of the

48、 e2s199212. yang zy;edenberg gj;davis rl isolation of mrna from specific tissues of drosophila by mrna tagging 外文期刊200513. xu h;lee sj;suzuki a lysosomal tetraspanin associated with retinal degeneration identified via a genome-wide screen 夕卜文期干u 200414. ed harlow;david j.antibodies a laboratory manu

49、al 199815. seufen w;jentsch s ubiquitin-conjugating enzymes ubc4 and ubc5 mediate selective degradation of shortlived and abnormal proteins 199016. wang rx;xu jc;outi sarama"ki prlz,a novel prostate-specific and androgen-responsive gene of the tpd52 family,amplified in chromosome 8q21.1 and overexpressed