HPLC法測(cè)定北蒼術(shù)中蒼術(shù)素的含量

1、HPLCHPLC 法測(cè)定北蒼術(shù)中蒼術(shù)素的含量法測(cè)定北蒼術(shù)中蒼術(shù)素的含量摘要：摘要：蒼術(shù)具有燥濕健脾，祛風(fēng)濕的功效。主治濕阻中焦，風(fēng)寒濕痹，腳膝腫痛，痿軟無力，雀目夜盲。 采用高效液相色譜法測(cè)定了北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素含量。該實(shí)驗(yàn)采用島津 LC-8A 高島效色譜儀，以甲醇-水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,其中甲醇的流速為 0.8mL/m in,水的流速為 0.2mL/m in。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素的含量為 6.28%。該方法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,無需再作處理，無環(huán)境污染，可用于北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素含量的測(cè)定,具有很高的實(shí)用價(jià)值。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞: : 高效液相色譜法 含量測(cè)定 北蒼術(shù)

2、 蒼術(shù)素 揮發(fā)油目錄引言.11.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容.21.1 儀器及試劑 .21.2 色譜條件的選擇 .21.3 高效液相色譜法（HPLC）的原理 .21.4 北蒼術(shù)中揮發(fā)油的提取 .21.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 .21.6 蒼術(shù)素的含量測(cè)定 .32.結(jié)果.32.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 .32.2 高效液相色譜圖 .42.3 蒼術(shù)術(shù)的含量 .53.討論.54.結(jié)論.5參考文獻(xiàn).6致 謝.7引言：引言：中藥蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù) Atractylodes lan-cea(Thunb. ) DC.或北蒼術(shù) Atractylodes chinen-sis(DC. ) Koidz.的干燥根莖,始載于神農(nóng)本草經(jīng),具有燥濕健脾、祛

3、風(fēng)濕、明目之功效,臨床仍用于濕滯中焦證、風(fēng)濕痹證及外感風(fēng)寒挾濕之表證，為中醫(yī)常用藥材之一。與蒼術(shù)燥濕健脾功效相關(guān)的藥理作用為調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)功能，抗?jié)儯ㄉn術(shù)有較強(qiáng)的抗?jié)冏饔?。?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，北蒼術(shù)對(duì)幽門結(jié)扎型潰瘍、幽門結(jié)扎-阿司匹林潰瘍、應(yīng)激性潰瘍有較強(qiáng)的抑制作用，能顯著抑制潰瘍、動(dòng)物的胃液量、總酸度、總消化能力及胃黏膜損害。研究認(rèn)為，蒼術(shù)抗?jié)冏饔脵C(jī)理主要有兩個(gè)方面： 抑制胃酸分泌：北蒼術(shù)揮發(fā)油中的蒼術(shù)醇能抑制甾體激素的釋放，減輕甾體激素對(duì)胃酸分泌的刺激。 增強(qiáng)胃黏膜保護(hù)作用：北蒼術(shù)可使胃黏膜組織血流量增加，從蒼術(shù)中提取的氨基己糖具有促進(jìn)胃黏膜修復(fù)作用。 ） ，保肝，抑菌等作用。而降血糖，抗缺氧，

4、中樞抑制，抗腫瘤，促進(jìn)骨骼鈣化及對(duì)心血管系統(tǒng)的影響等作用，則是其藥理作用的現(xiàn)代研究進(jìn)展。蒼術(shù)的主要化學(xué)成分如下： 蒼術(shù)根莖含揮發(fā)油，揮發(fā)油 中主含蒼術(shù)素（atractylodin） 、-桉油醇（-eudesmol） 、茅術(shù)醇（hinesol） 、羥基蒼術(shù)酮（hydroxy-atractylon）等。其余主含 -桉葉醇和蒼術(shù)呋喃烴，還含 -芹子烯，左旋的 甜沒藥萜醇（ -bisabolol） ，茅術(shù)醇，欖香醇，蒼術(shù)酮，芹子二烯酮等。又含聚乙炔化合物：蒼術(shù)呋喃烴醇（atractyoldinol)，乙?；n術(shù)呋喃烴醇（ acetyl-tractylodinol） 。蒼術(shù)素的結(jié)構(gòu)式 ： 蒼術(shù)素的性狀為

5、 brown powder，分子式為 C13H10O，分子量為182.2179。 其藥理作用為保肝，抗缺氧，降血糖，抗炎抗腫瘤，抗菌抗病毒，抗心律失常，對(duì)消化道的作用及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用等。 中國藥典至今僅有其對(duì)照藥材(蒼術(shù)素)的鑒別,尚無其含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。蒼術(shù)的主要有效成分為聚乙炔類成分,即主要為蒼術(shù)素。本文以蒼術(shù)素為指標(biāo),采用高效液相色譜法(HPLC)建立了北蒼術(shù)中揮發(fā)油的有效成分蒼術(shù)素的含量測(cè)定方法,為蒼術(shù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了依據(jù)與方法。1.1.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.1 儀器及試劑 儀器：DW-2 型調(diào)溫電熱器（規(guī)格 5000ml，功率 1000w） ，回流冷凝管（直型） ，揮發(fā)油提取器，50

6、00ml 圓底燒瓶，變壓器，15ml 容量瓶，膠頭滴管，2ml移液管，試劑瓶，超聲波清洗器，一次性針管，微孔濾膜，電子天平，Shimadzu LC-8A 制備型高效液相色譜儀。 試劑： 北蒼術(shù)，甲醇（CH3OH） ，乙酸乙酯(Et0Ach)，水，蒼術(shù)素對(duì)照品。1.2 色譜條件的選擇色譜條件的選擇:選擇了甲醇-水常見的流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果表明在這個(gè)系統(tǒng)中色譜峰的峰形較好,基線平穩(wěn),故選擇甲醇-水系統(tǒng)為流動(dòng)相。當(dāng)采用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇-水溶液等度洗脫時(shí),蒼術(shù)素出峰太慢，時(shí)間太長;當(dāng)采用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇-水溶液等度洗脫時(shí),蒼術(shù)素出峰時(shí)間為 10min 左右，時(shí)間較合理，此時(shí)色譜峰的峰形較好,基

7、線平穩(wěn)，因此最終優(yōu)化的色譜條件如下：進(jìn)樣體積:20L;流動(dòng)相:水(A)-甲醇(B)溶液,其中泵 A（水）的流速為 0.2ml/min、泵B（甲醇）的流速為 0.8ml/min。1.3 高效液相色譜法（HPLC）的原理 高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí), 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程, 各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出, 通過檢測(cè)器時(shí), 樣品

8、濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。1.4 北蒼術(shù)中揮發(fā)油的提取 稱取 500.8g 北蒼術(shù)，將其放入 5000ml 圓底燒瓶?jī)?nèi)，并加水至圓底燒瓶1/2 處，然后將其放置于 DW-2 型調(diào)溫電熱器內(nèi)，在圓底燒瓶口裝上揮發(fā)油提取器，接著在提取器口上套上回流冷凝管，接上水，打開電源，開始加熱。加熱兩個(gè)小時(shí)左右開始沸騰，等待提取器中揮發(fā)油的出現(xiàn)，并提取 1ml 左右的揮發(fā)油。1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 首先稱取蒼術(shù)素純品 5.0mg，放入 1 號(hào) 15ml 容量瓶中，接著取 10ml 乙酸乙酯放入 1 號(hào)瓶?jī)?nèi)，然后用超聲波加速溶解 10min，取出待冷卻后，加甲醇至刻度線，搖勻。接著

9、用移液管從 1 號(hào)容量瓶中移取 12.5ml 的溶液置于 2 號(hào)容量瓶中，再向 2 號(hào)中加甲醇至刻度線，依次類推，完成 3 號(hào)、4 號(hào)、5 號(hào)、6 號(hào)容量瓶溶液的配制，則六瓶溶液濃度依次遞減。然后按濃度由小到大的順序依次進(jìn)樣，即分別精密吸取0.0000172mol/L，0.0000343mol/L，0.0000687mol/L，0.000137mol/L，0.000275mol/L，0.000549mol/L 各20L，每個(gè)濃度進(jìn)樣兩次，測(cè)兩次峰面積，最后平均同一濃度下的兩次峰面積，結(jié)果見表一。接著以平均后的峰面積為縱坐標(biāo)，蒼術(shù)素的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖（1） ，得方程方程y=639

10、7683284.6435x+78880.1304，相關(guān)系數(shù) R2=0.9942，R=0.9971。1.6 蒼術(shù)素的含量測(cè)定將溶于甲醇的揮發(fā)油（揮發(fā)油為 0.0497g）轉(zhuǎn)移至 15ml 的容量瓶中，加甲醇至刻度線，可再加 2ml 乙酸乙酯助溶。搖勻，然后用移液管從中取出 1ml，移至小試劑瓶中，再加 1ml 甲醇稀釋，搖勻，用微型濾膜過濾。接著取 20L該溶液，注入高效液相色譜儀中，在 10min 處開始出峰，見圖（2） 。重復(fù)操作一次，最后平均兩個(gè)峰面積。將該峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，最后計(jì)算揮發(fā)油中蒼術(shù)素的含量，即北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素的含量為 6.28%。2.2.結(jié)果結(jié)果2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線表

11、2-1 序號(hào)坐標(biāo)123456濃度（mol/L）0.0005490.0002750.0001370.00006870.00003430.0000172平均峰面積(mAU)3607625.71722134.81113581.15579613.1245391.7122109.5蒼術(shù)素標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 6397683284.6435 x + 78880.1304R2 = 0.99420500000100000015000002000000250000030000003500000400000000.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006濃度峰面積圖（1）蒼術(shù)素標(biāo)準(zhǔn)

12、曲線2.2 高效液相色譜圖圖（2）蒼術(shù)素樣品溶液高效液相色譜圖圖（3）蒼術(shù)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液高效液相色譜圖2.3 蒼術(shù)素的含量 北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素的平均峰面積為 2111301.2，將該數(shù)據(jù)代入方程y=6397683284.6435x+78880.1304，得其中蒼術(shù)素濃度為 3.17710-4 mol/L，再經(jīng)進(jìn)一步計(jì)算，最終得北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素的含量為 6.28%。2.2.討論討論采用本文建立的蒼術(shù)素含量的測(cè)定方法,即運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC)，此方法簡(jiǎn)單、可靠、易于操作、重現(xiàn)性好、無需再作處理、無環(huán)境污染，對(duì)于北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素含量的測(cè)定,具有很高的實(shí)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：北蒼術(shù)揮發(fā)油中

13、蒼術(shù)素的含量為 6.28%。高效液相色譜以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于 100um 的吸附劑（ 硅膠、氧化鋁等）。這種傳統(tǒng)的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡(jiǎn)單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度?。?um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高。當(dāng)然我們?cè)诓僮鞲咝б合嗌V儀時(shí)，失誤也是有的，例如進(jìn)樣是對(duì)的，卻不出峰、或者出峰有偏差。但經(jīng)過討論和總結(jié)，明白了要確保高效液相色譜儀出峰，就要在注射樣品溶液后快速、平穩(wěn)地從 LOAD 狀態(tài)轉(zhuǎn)換到 INJECT 狀態(tài),以

14、保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。蒼術(shù)素在消化道系統(tǒng)、抗炎、利膽及黃嘌呤氧化酶(XO)阻礙等方面均顯示良好的活性,其活性與蒼術(shù)藥材本身的功效接近;另外,該類成分主要存在于蒼術(shù)中,且含量較高。因此以蒼術(shù)素為指標(biāo),建立其含量測(cè)定方法更為合理。3.3.結(jié)論結(jié)論本文建立的蒼術(shù)素含量的測(cè)定方法,即運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC)，此方法簡(jiǎn)單、可靠、易于操作、重現(xiàn)性好、無需再作處理、無環(huán)境污染，對(duì)于北蒼術(shù)揮發(fā)油中蒼術(shù)素含量的測(cè)定,具有很高的實(shí)用價(jià)值。建議有關(guān)部門將本方法作為蒼術(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定的檢測(cè)方法。參參 考考 文文 獻(xiàn)獻(xiàn)1 陳炎明,侴桂新,王崢濤，等. 反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒼術(shù)中的兩種聚乙炔類化合物J . 色

15、譜 , 2007，1：84-87.2 陳炎明,陳靜,侴桂新,等. 蒼術(shù)化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展J. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 第 20 卷第 4 期 ，2006，12.3 高英，李衛(wèi)民，倪晨，周欣欣，馮毅凡，郭曉玲，孟昔，等. 分子蒸餾技術(shù)在分離蒼術(shù)油有效部位中的應(yīng)用J. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 第 21 卷第 6 期 , 2004，11.4 孟青，馮毅凡，郭曉玲，陳耕夫，李衛(wèi)民，高英，等. 蒼術(shù)有效部位化學(xué)成分的研究J. 中草藥(Chinese Traditional and Herbal Drugs） ，第 35卷第 2 期 ，2004，2.5 歐陽臻，江濤濤，繆亞東，韓麗，楊凌。蒼術(shù)的化學(xué)成

16、分、道地性和藥理活性研究進(jìn)展J;時(shí)珍國醫(yī)國藥;2006 年 10 期6 李曼玲,范莉,馮偉紅,康琛,趙宇新;蒼術(shù)的化學(xué)藥理研究進(jìn)展J;中國中醫(yī)藥信息雜志;2002 年 11 期7 劉曉冬,閻雪,衛(wèi)永第,閻吉昌;蒼術(shù)揮發(fā)油成分的分析J;分析測(cè)試學(xué)報(bào);1998 年 03 期8 孫勇;馮煦;董云發(fā);蒼術(shù)化學(xué)成分與現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展A;藥用植物研究與中藥現(xiàn)代化第四屆全國藥用植物學(xué)與植物藥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集C;2004年9 許臘英,裴彩云,毛維倫,李路軍,夏荃;蒼術(shù)化學(xué)成分及飲片炮制現(xiàn)代研究概況J;湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2004 年 02 期10 劉樹芬,黃惠云,曲濤,李曉紅,楊曉紅;氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定蒼術(shù)揮發(fā)油包合前后的成分與含量J;中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;1993 年 05 期 致 謝非常感謝張老師在畢業(yè)設(shè)計(jì)階段給自己的指導(dǎo)，從最初的定題，到資料的收集，到寫作、修改，到論文定稿，他給了我耐心的指導(dǎo)和無私的幫助。為了指導(dǎo)我們的畢業(yè)論文，他放棄了自己的休息時(shí)間，他的這種無私奉獻(xiàn)的敬業(yè)精神令人欽佩，在此我向他表示我誠摯的謝意。同時(shí)，感謝所有的任課老師和所有的同學(xué)在這三年來給自己的指導(dǎo)和幫助，是他們教會(huì)了我專業(yè)知識(shí)，教會(huì)了我如何學(xué)習(xí)，教會(huì)了我如何做人。正是由于他們，我