《雙向凝膠電泳 》ppt課件

1、第五章第五章 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(2D-PAGE)蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)道路蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)道路雙向凝膠電泳技術(shù)的開展及原理雙向凝膠電泳技術(shù)的開展及原理儀器簡介儀器簡介樣品制備樣品制備技術(shù)流程技術(shù)流程1. 蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)道路蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)道路要求要求流程流程技術(shù)道路技術(shù)道路蛋白質(zhì)組分析的首要要求蛋白質(zhì)組分析的首要要求未來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包未來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)展分別、檢測含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)展分別、檢測和分析和分析 。生物學(xué)問題生物學(xué)問題的提出的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計的設(shè)計實(shí)驗(yàn)組和對照組實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備樣品的制備蛋

2、白樣品的蛋白樣品的IEF和和PAGE電泳分別電泳分別圖像掃描和初步分析圖像掃描和初步分析感興趣感興趣蛋白點(diǎn)蛋白點(diǎn)的切取的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步的進(jìn)一步驗(yàn)證驗(yàn)證蛋白信息的蛋白信息的初步獲得初步獲得蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)組組分分析析流流程程蛋白質(zhì)組研討的根本技術(shù)道路蛋白質(zhì)組研討的根本技術(shù)道路蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳雙向電泳圖像分析圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白凝膠中的蛋白溶液

3、中的蛋白溶液中的蛋白混合肽混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索數(shù)據(jù)搜索新的或知蛋白新的或知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定2. 雙向電泳技術(shù)的開展及原理雙向電泳技術(shù)的開展及原理雙向凝膠電泳的開展雙向凝膠電泳的開展 雙向凝膠電泳的根本原理雙向凝膠電泳的根本原理 雙向凝膠電泳的開展雙向凝膠電泳的開展雙向凝膠電泳的思緒最早是由雙向凝膠電泳的思緒最早是由Smithies 和和Poulik提出提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum prote

4、ins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白質(zhì)第一向電泳是根據(jù)其自在溶液遷移率，蛋白質(zhì)第一向電泳是根據(jù)其自在溶液遷移率 (free-solution mobility)，在濾紙條上進(jìn)展；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)展。在濾紙條上進(jìn)展；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)展。隨后，隨后，Raymond發(fā)明了聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)明了聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:

5、711)，雙向電泳的支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠，雙向電泳的支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyac-rylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)，這即是雙向凝膠電泳這即是雙向凝膠電泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE

6、)。同年，同年，2D PAGE在原理上又有了新的開展，以第一向?yàn)榈鞍踪|(zhì)等電聚焦在原理上又有了新的開展，以第一向?yàn)榈鞍踪|(zhì)等電聚焦的雙向凝膠電泳技術(shù)建立起來，即的雙向凝膠電泳技術(shù)建立起來，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combine

7、d elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seylers Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。20世紀(jì)世紀(jì)70年代初，在第二向電泳中又運(yùn)用了十二烷基磺酸鈉年代初，在第二向電泳中又運(yùn)用了十二烷基磺酸鈉 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165

8、-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向電泳根本上根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量來分別，從而奠定了，使第二向電泳根本上根據(jù)蛋白質(zhì)

9、的相對分子質(zhì)量來分別，從而奠定了現(xiàn)代雙向凝膠電泳的根底，即現(xiàn)代雙向凝膠電泳的根底，即IEF-SDS PAGE。1975年，年，OFarrell、Klose和和Scheele分別對雙向凝膠電泳做進(jìn)一步的優(yōu)分別對雙向凝膠電泳做進(jìn)一步的優(yōu)化，建立了高分辨率的雙向凝膠電泳化，建立了高分辨率的雙向凝膠電泳 (OFarrell PH. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；Klose J. protein mapping by combined isoele

10、ctric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。此項(xiàng)技術(shù)是目前獨(dú)一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分別并展現(xiàn)的分別技術(shù)，普此項(xiàng)技術(shù)是目前獨(dú)一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分別

11、并展現(xiàn)的分別技術(shù)，普通能分別通能分別1000 3000個蛋白質(zhì)點(diǎn)，最好的膠能分別得到個蛋白質(zhì)點(diǎn)，最好的膠能分別得到11000個左右的蛋白質(zhì)個左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。點(diǎn)。雙向凝膠電泳的根本原理雙向凝膠電泳的根本原理先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)在先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)在 pH 梯度膠內(nèi)進(jìn)展等電聚焦，然后按照它們的梯度膠內(nèi)進(jìn)展等電聚焦，然后按照它們的相對分子質(zhì)量大小進(jìn)展相對分子質(zhì)量大小進(jìn)展 SDS-PAGE 第二次電泳分別。第二次電泳分別。第一向進(jìn)展等電聚焦第一向進(jìn)展等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點(diǎn)特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至和等

12、電點(diǎn)特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)展電泳時，會向與其所梯度介質(zhì)上進(jìn)展電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向挪動。挪動過程中，蛋白分子能夠獲得或失去質(zhì)子，并帶電荷相反的電極方向挪動。挪動過程中，蛋白分子能夠獲得或失去質(zhì)子，并隨著挪動的進(jìn)展，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電隨著挪動的進(jìn)展，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點(diǎn)點(diǎn) pH 位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再挪動。當(dāng)?shù)鞍追稚⒌降陀谄涞任恢脮r，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再挪動。當(dāng)?shù)鞍追稚⒌降陀谄涞入婞c(diǎn)電點(diǎn) pH 區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極挪動。同樣，假設(shè)蛋區(qū)域時，帶正電荷，在

13、電場的影響下重新向陰極挪動。同樣，假設(shè)蛋白質(zhì)分散到高于其等電點(diǎn)的白質(zhì)分散到高于其等電點(diǎn)的 pH 區(qū)域時，那么帶負(fù)電，在電場的作用下會向陽區(qū)域時，那么帶負(fù)電，在電場的作用下會向陽極挪動。根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的極挪動。根據(jù)各自不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的pH 梯度介梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常運(yùn)用預(yù)制膠條質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常運(yùn)用預(yù)制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分別，將聚焦好的等電聚焦分別，將聚焦好的 IPG 膠條在含有膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。的緩沖液中平衡。第二向是將在第二向是將在

14、IPG 膠條中經(jīng)過第一向分別的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膠條中經(jīng)過第一向分別的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 SDS-PAGE凝凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分別。沿大小與第一向相垂直的分別。沿垂直的方向進(jìn)展垂直的方向進(jìn)展 SDS-PAGE 電泳，按分子量大小進(jìn)展分別。樣品經(jīng)過電荷和電泳，按分子量大小進(jìn)展分別。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分別后，得到等電點(diǎn)和分子量的信息。質(zhì)量兩次分別后，得到等電點(diǎn)和分子量的信息。 IPG 膠的資料是膠的資料是 Immobilines，為擁有，為擁有CH2=CH-CO-NH-R構(gòu)造的構(gòu)造的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中種丙烯酰胺衍

15、生物系列，其中R包含羧包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH 310不同值的不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)經(jīng)過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而構(gòu)成經(jīng)過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而構(gòu)成pH梯度。經(jīng)過這種方式生成的梯度。經(jīng)過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電浸透作用，不會發(fā)生電浸透作用，因此可以進(jìn)展特別穩(wěn)定的因此可以進(jìn)展特別穩(wěn)定的IEF分別到達(dá)真正的平衡形分別到達(dá)真正的平衡形狀。狀。三種雙向凝膠等電聚焦系

16、統(tǒng)三種雙向凝膠等電聚焦系統(tǒng)根據(jù)第一向等電聚焦條件和方式的不同，可將雙向凝膠電泳分為三種系根據(jù)第一向等電聚焦條件和方式的不同，可將雙向凝膠電泳分為三種系統(tǒng)：統(tǒng)：ISO-DALT、NEPHGE和和IPG-DALT。在在ISO-DALT系統(tǒng)中，等電聚焦在聚丙烯酰胺管膠系統(tǒng)中，等電聚焦在聚丙烯酰胺管膠 (tube gel) 中進(jìn)展，載中進(jìn)展，載體兩性電解質(zhì)體兩性電解質(zhì) (carrier ampholyte) 在外加電場的作用下構(gòu)成在外加電場的作用下構(gòu)成pH梯度，梯度，pH梯度梯度在堿性區(qū)不穩(wěn)定陰極漂移、反復(fù)性不易掌握和上樣量低是其主要缺陷，在堿性區(qū)不穩(wěn)定陰極漂移、反復(fù)性不易掌握和上樣量低是其主要缺陷，

17、并且普通不能分別等電點(diǎn)大于并且普通不能分別等電點(diǎn)大于8.0的堿性蛋白質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是電泳設(shè)備要求不高，的堿性蛋白質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是電泳設(shè)備要求不高，電泳溶液容易配制，易于開展任務(wù)，各種電泳條件經(jīng)優(yōu)化后，可到達(dá)非常高電泳溶液容易配制，易于開展任務(wù)，各種電泳條件經(jīng)優(yōu)化后，可到達(dá)非常高的分辨率，也可獲得好的反復(fù)性，目前獨(dú)一分辨到的分辨率，也可獲得好的反復(fù)性，目前獨(dú)一分辨到10000個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的圖譜個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的圖譜正是采用了這一系統(tǒng)。正是采用了這一系統(tǒng)。NEPHGE為非平衡為非平衡pH梯度電泳梯度電泳 (nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是，是IPG (

18、immobilized pH gradient) 膠發(fā)明前用于分別堿性蛋膠發(fā)明前用于分別堿性蛋白質(zhì)的一種方法，蛋白質(zhì)在等電聚焦場中到達(dá)平衡前終了電泳，第一向的白質(zhì)的一種方法，蛋白質(zhì)在等電聚焦場中到達(dá)平衡前終了電泳，第一向的pH也是依托載體兩性電解質(zhì)和電場來建立。也是依托載體兩性電解質(zhì)和電場來建立。IPG-DALT的第一向電泳是采用的第一向電泳是采用1982年發(fā)明的年發(fā)明的IPG膠膠 (Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG et al. Isoelectric focusing in immobilized pH gradient: principle, methodo

19、logy and some applications. J Biochem Biophys Methods, 1982, 6: 317-339)，其，其pH梯度的構(gòu)成依賴于不同梯度的構(gòu)成依賴于不同pK值的一種合成的化合物值的一種合成的化合物immobiline，該，該化合物是丙烯酰胺的衍生物，為非兩性的弱酸和弱減，在凝膠聚合過程中，化合物是丙烯酰胺的衍生物，為非兩性的弱酸和弱減，在凝膠聚合過程中，能與聚丙烯酰胺共價結(jié)合，因此，能與聚丙烯酰胺共價結(jié)合，因此，IPG膠的膠的pH梯度是穩(wěn)定的，不依賴于外加梯度是穩(wěn)定的，不依賴于外加電場，根本上抑制了電場，根本上抑制了ISO-DALT的主要缺陷，無論在

20、反復(fù)性和上樣量上均優(yōu)的主要缺陷，無論在反復(fù)性和上樣量上均優(yōu)于于ISO-DALT。非變性非變性2D-PAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)展，這樣分別的蛋：兩向均在非變性條件下進(jìn)展，這樣分別的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；值是一樣的；非變性非變性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非變性：第一向采用非變性IEF，之后在，之后在2% SDS溶液中平衡；第二向也在溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進(jìn)展。適于分析存在的條件下進(jìn)展。適于分析非共價鍵銜接的蛋白非共價鍵銜接的蛋白-蛋白間的相互作用。蛋白間的相互作用。

21、非變性非變性/復(fù)原復(fù)原/SDS-2D-PAGE：非變性條件下：非變性條件下IEF聚焦，之后用聚焦，之后用8M尿素尿素 + 5%-ME + 2%SDS進(jìn)展平衡，再進(jìn)展第二向進(jìn)展平衡，再進(jìn)展第二向SDS-PAGE電泳。此時分別的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)展點(diǎn)的切取、蛋白酶消電泳。此時分別的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)展點(diǎn)的切取、蛋白酶消化、化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵銜接的多分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵銜接的多肽的信息。肽的信息。變性變性2D-PAGE：樣品先用：樣品先用2%SDS + 5%-ME + 95變性變性5min, IEF在在8M尿素尿素 + 1%NP-40條件下進(jìn)展，之后膠條用條件下進(jìn)展

22、，之后膠條用2%SDS + 5%-ME平衡，然后進(jìn)展平衡，然后進(jìn)展SDS-PAGE。該技術(shù)適于。該技術(shù)適于DNA序列和序列和多肽構(gòu)造的分析，或分析被碳?xì)滏I銜接和其它翻譯后修飾所引多肽構(gòu)造的分析，或分析被碳?xì)滏I銜接和其它翻譯后修飾所引起的多肽構(gòu)造微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于起的多肽構(gòu)造微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100KD的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式。點(diǎn)少于第三種方式。雙向電泳的分類雙向電泳的分類3. 儀器簡介儀器簡介第一向：第一向：采用珀耳帖溫度控制聚焦平臺；最大電壓采用珀耳帖溫度控制聚焦平臺；最大電壓為為10, 000伏；有不同的電壓上升方式；可分步伏；有不同的電壓上升方式；可分步進(jìn)展時

23、間或電壓進(jìn)展時間或電壓小時控制；重泡脹可采取整體小時控制；重泡脹可采取整體的或獨(dú)立的步驟；程序可時時控制；可同時聚的或獨(dú)立的步驟；程序可時時控制；可同時聚焦焦24根根7cm，12根根17cm膠條；有三個預(yù)設(shè)程序膠條；有三個預(yù)設(shè)程序的方法；有十個用戶自定方法；采集運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)的方法；有十個用戶自定方法；采集運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)可經(jīng)可經(jīng)RS232端口輸出或任何熱敏打印紙。端口輸出或任何熱敏打印紙。BIO-RAD公司公司PROTEAN IEF Cell 等電聚焦儀：等電聚焦儀：Amersham pharmcia Biotech公司公司IPGphor等電聚焦儀：等電聚焦儀：電極區(qū)域?yàn)殂~鍍金板；最多上電極區(qū)域?yàn)殂~鍍金板

24、；最多上12個樣品；平臺溫度為個樣品；平臺溫度為18-251；膠；膠條槽條槽 (Holder) 體為氧化鋁陶瓷，丙烯酸的蓋子；適宜體為氧化鋁陶瓷，丙烯酸的蓋子；適宜7、11、13和和18cm的膠的膠條；程序參數(shù)包括重泡脹時間、平臺溫度、每根膠條的最大限流、每步的電條；程序參數(shù)包括重泡脹時間、平臺溫度、每根膠條的最大限流、每步的電壓、每步的電流改動方式、每步的時間；可編輯壓、每步的電流改動方式、每步的時間；可編輯10個程序，每個程序分有九個程序，每個程序分有九個步驟；電壓輸出最大為個步驟；電壓輸出最大為8000V；最大電流為；最大電流為1.5mA；最大功率為；最大功率為12W。第二向：第二向：

25、BIO-RAD公司公司PROTEAN II xi Cell電泳槽：電泳槽： 電極是直徑為電極是直徑為0.01英寸的白金電極；適用于英寸的白金電極；適用于16.520cm 凝膠電泳；凝膠凝膠電泳；凝膠厚度為厚度為1.0mm；可同時運(yùn)轉(zhuǎn)；可同時運(yùn)轉(zhuǎn)1-2塊膠；上槽緩沖溶液塊膠；上槽緩沖溶液350ml，下槽緩沖溶液，下槽緩沖溶液1.2 L；典型；典型SDS-PAGE電泳時間：無冷卻時為電泳時間：無冷卻時為5小時，帶冷卻時為小時，帶冷卻時為3.5小時。配套小時。配套電源為電源為Power Pac 1000：在進(jìn)展電泳時，最大電壓不超越：在進(jìn)展電泳時，最大電壓不超越1000V，最大功率不，最大功率不超越

26、超越80W，最大室溫不超越，最大室溫不超越50。 Amersham pharmcia Biotech公司公司Ettan DALT II System： (1) 此系統(tǒng)的電源控制為此系統(tǒng)的電源控制為Power Supply/Control Unit：最大輸出功率是：最大輸出功率是200W；溫度控制范圍是；溫度控制范圍是10-50最大電壓最大電壓600V；最大電流；最大電流1A。(2) 運(yùn)用運(yùn)用Gel caster灌膠模具：最多可同時灌灌膠模具：最多可同時灌25.520.5cm、1mm厚的梯度膠或均一膠厚的梯度膠或均一膠14塊。塊。Amersham pharmcia Biotech公司公司Hoef

27、et miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit：膠大小為膠大小為10.08cm ;最多可同時跑兩塊膠；跑一塊膠時需最多可同時跑兩塊膠；跑一塊膠時需1.7L電極緩沖液，電極緩沖液，跑兩塊膠時需跑兩塊膠時需1.2L電極緩沖液；最大電壓是電極緩沖液；最大電壓是600V，最大功率是，最大功率是25W；所配置電；所配置電源為源為Electrophoresis Power Supply EPS 301。圖像分析軟件：圖像分析軟件： Amersham pharmcia Biotech公司：公司： imageMasterTM 2D version:5.0B

28、IO-RAD公司：公司： PDQuesTM4. 雙向電泳分析中的樣品制備雙向電泳分析中的樣品制備應(yīng)使一切待分析的蛋白樣品全部處于溶解形應(yīng)使一切待分析的蛋白樣品全部處于溶解形狀包括多數(shù)疏水性蛋白，且制備方法應(yīng)狀包括多數(shù)疏水性蛋白，且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾如酶性或化學(xué)性降解等。學(xué)修飾如酶性或化學(xué)性降解等。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，盡量去除起干擾

29、作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研討蛋白的可檢測性。從而保證待研討蛋白的可檢測性。樣品的分級處置樣品的分級處置經(jīng)過采用亞細(xì)胞分級、液相電泳和選經(jīng)過采用亞細(xì)胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)展分級處擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)展分級處置，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋置，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處置是采用分級白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處置是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)展分別。抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)展分別。 樣品的溶解樣品的溶解是是2-DE勝利分別蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵要素之一。勝利分別蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵要素之一。1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全

30、破壞，從、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而構(gòu)成各個多肽的溶解液否那么樣品中結(jié)合結(jié)實(shí)的蛋白而構(gòu)成各個多肽的溶解液否那么樣品中結(jié)合結(jié)實(shí)的蛋白復(fù)合物能夠使復(fù)合物能夠使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個多中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會下降；肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會下降；2、溶解方法必需允答應(yīng)能干擾、溶解方法必需允答應(yīng)能干擾2-DE分別的鹽、脂類、多糖和分別的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中堅(jiān)持溶解形狀。、溶解方法要保證樣品在電泳過程中堅(jiān)持溶解形狀。溶解的目的：溶解的目的：添加樣品溶解性的手段添加樣品溶解性的手段變性

31、劑：經(jīng)過改動溶液中的氫鍵構(gòu)造使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏變性劑：經(jīng)過改動溶液中的氫鍵構(gòu)造使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。是尿素和硫尿。外表活性劑：經(jīng)過變性劑處置而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常外表活性劑：經(jīng)過變性劑處置而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種外表活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的外表活性劑需至少一種外表活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的外表活性劑有離子去污劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑、非離子去污劑Triton X-100和和NP-40、兩、兩性離子去污劑性離子去污劑CHAPS、OB

32、G等。其中等。其中CHAPS和和SB3-10最好。最好。復(fù)原劑：在變性劑和外表活性劑聯(lián)用條件下，加復(fù)原劑可使已變復(fù)原劑：在變性劑和外表活性劑聯(lián)用條件下，加復(fù)原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自在巰基的性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自在巰基的DTT或或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦 (TBP) 進(jìn)展進(jìn)展復(fù)原。復(fù)原。起載體作用的兩性電解質(zhì)：即使在變性劑和外表活性劑存在的情起載體作用的兩性電解質(zhì)：即使在變性劑和外表活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需求在鹽離子的作用下才干堅(jiān)持其處于況下，某些蛋白質(zhì)也需求在鹽離子的作用下才干堅(jiān)持其處于溶解形

33、狀，否那么這些蛋白質(zhì)在其處于溶解形狀，否那么這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時會發(fā)生沉淀。點(diǎn)時會發(fā)生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。運(yùn)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于而保證蛋白質(zhì)的溶解性。運(yùn)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2(w/v)。濃度過高會使。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證的速度降低。另外，為了保證明驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在選擇不同明驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在選擇不同pH范圍的范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的性電解質(zhì)的pH值與之相符合。值與之相符合。樣品中核酸的去除樣品中核酸的去除對電泳

34、的影響：添加樣品粘度、與蛋白質(zhì)構(gòu)對電泳的影響：添加樣品粘度、與蛋白質(zhì)構(gòu)成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。處理方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)處理方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)展降解，或是利用合成載體兩性電解切酶進(jìn)展降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)質(zhì) (SCA) 同核酸結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物的才干，再同核酸結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物的才干，再經(jīng)過超速離心來去除復(fù)合物。經(jīng)過超速離心來去除復(fù)合物。 亞蛋白質(zhì)組樣品的制備亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)分別出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適用超離心技術(shù)分別出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)展溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅

35、大大減少樣品的當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)展溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分別的蛋白質(zhì)進(jìn)展亞細(xì)胞定位。但該法需復(fù)雜性，而且可對分別的蛋白質(zhì)進(jìn)展亞細(xì)胞定位。但該法需求專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。求專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。第一步：用第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用規(guī)范用規(guī)范IEF樣品液溶解提取高疏水樣品液溶解提取高疏水性蛋白；性蛋白；第三步：用含復(fù)合外表活性劑的蛋白溶解液，最后抽提早兩第三步：用含復(fù)合外表活性劑的蛋白溶解液，最后抽提早兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的次抽提后不能溶

36、解的膜蛋白約占整個樣品的11%W/W。順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差別，器具有順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差別，器具有不同溶解才干的蛋白溶解液進(jìn)展抽提不同溶解才干的蛋白溶解液進(jìn)展抽提的方法。的方法。特殊樣品的制備特殊樣品的制備低豐度蛋白的分別：雖然添加上樣量和提高總蛋白的溶解度能添低豐度蛋白的分別：雖然添加上樣量和提高總蛋白的溶解度能添加分別時的低豐度蛋白的量加分別時的低豐度蛋白的量, 但同時添加了高豐度蛋白的負(fù)荷，但同時添加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且呵斥蛋白的疊加效應(yīng)而影響分別。現(xiàn)常用預(yù)分級窄且呵斥蛋白的疊加效應(yīng)而影響分別?，F(xiàn)常用預(yù)分級窄pH膠膠的微制備技術(shù)進(jìn)展分別：即將總蛋白組分成蛋白

37、質(zhì)組亞群，的微制備技術(shù)進(jìn)展分別：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用再用pH梯度小于梯度小于2個個pH單位的單位的IPG膠進(jìn)展窄膠進(jìn)展窄pH范圍的分別。范圍的分別。 強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)如核糖體的處置：先將蛋白預(yù)處置以富集，再強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)如核糖體的處置：先將蛋白預(yù)處置以富集，再用特殊用特殊pH梯度的梯度的IPG膠條如膠條如pH3-12、4-12或或10-12) 進(jìn)展等進(jìn)展等電聚焦。其中窄范圍堿性電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠如膠如pH10-12) 的挑戰(zhàn)是抑制的挑戰(zhàn)是抑制反向、陰極向陽極、電滲流和程度條紋方式，而寬范圍的堿反向、陰極向陽極、電滲流和程度條紋方式，而寬范圍的堿性性IPG膠如膠如pH3-12

38、、4-12) 等消除了窄范圍膠所需求的專門等消除了窄范圍膠所需求的專門水化液。水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于和大于200kD的蛋白在常規(guī)的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這能夠是在上不易看到，這能夠是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游緩沖液中，樣品和游離的離的dodelcyl sulfate ions繼續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白繼續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染白的分辨率；在膠底端，高濃度的十

39、二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的緣由能夠是在變性條件下，色困難。至于高分子量蛋白少的緣由能夠是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者能夠是大分子。蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者能夠是大分子。5. 雙向凝膠電泳技術(shù)流程雙向凝膠電泳技術(shù)流程IPG重泡漲及樣品加樣重泡漲及樣品加樣第一向等電聚焦第一向等電聚焦第二向第二向SDS-PAGE檢測檢測問題及處理方法問題及處理方法IPG膠條的重泡脹膠條的重泡脹重泡漲時間至少要重泡漲時間至少要10h，泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收。，泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收。重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時需參照相關(guān)闡

40、明書。重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時需參照相關(guān)闡明書。不同的加樣方法和加樣量會導(dǎo)致最終結(jié)果的差別。不同的加樣方法和加樣量會導(dǎo)致最終結(jié)果的差別。溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時溫度普通穩(wěn)定在溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時溫度普通穩(wěn)定在20，太低尿素會結(jié)晶出，太低尿素會結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)也會呵斥膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)位置的變化。來，溫度不穩(wěn)也會呵斥膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)位置的變化。重泡漲時加上重泡漲時加上30-50V的低電壓會促進(jìn)膠條對蛋白質(zhì)的吸收，但這一點(diǎn)在制備的低電壓會促進(jìn)膠條對蛋白質(zhì)的吸收，但這一點(diǎn)在制備型電泳時才有意義。型電泳時才有意義。商品化的膠條運(yùn)用前是以干膠條的方式和塑料支撐薄膜粘在一同，加

41、樣前商品化的膠條運(yùn)用前是以干膠條的方式和塑料支撐薄膜粘在一同，加樣前需求先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。重泡漲液的成分是：需求先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。重泡漲液的成分是：8mol/L Urea, 2% CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5%IPG Buffer, 痕量痕量Bromophenol Blue，和裂解，和裂解液成分根本一樣，在液成分根本一樣，在10-100mmol/L濃度范圍內(nèi)適當(dāng)提高濃度范圍內(nèi)適當(dāng)提高DTT的濃度可提高的濃度可提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進(jìn)展，此時樣品曾經(jīng)加到重泡漲液中，在加樣杯重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進(jìn)展，此時樣品曾經(jīng)

42、加到重泡漲液中，在加樣杯上樣上樣 (cup loading) 方式中，膠條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等方式中，膠條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電聚焦盤內(nèi)加樣。電聚焦盤內(nèi)加樣。泡脹的本質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的方式進(jìn)入泡脹的本質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的方式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)展接下內(nèi)，從而能進(jìn)展接下來的來的IEF。 加樣加樣樣品可以在重泡漲時參與，稱為膠內(nèi)重泡漲樣品可以在重泡漲時參與，稱為膠內(nèi)重泡漲 (in-gel rehydration)，也可以重泡漲完成后再參與，如加樣杯上樣。重，也可以重泡漲完成后再參與，如加樣杯上樣。重泡加樣相對不可靠，操作比較困難而且蛋白質(zhì)容易在膠

43、和樣品泡加樣相對不可靠，操作比較困難而且蛋白質(zhì)容易在膠和樣品的界面產(chǎn)生沉淀，然而在某些特殊情況下，重泡漲后加樣具有的界面產(chǎn)生沉淀，然而在某些特殊情況下，重泡漲后加樣具有優(yōu)勢，如運(yùn)用優(yōu)勢，如運(yùn)用 pH 6-9 的膠條分別堿性蛋白質(zhì)時，在陽極用加樣的膠條分別堿性蛋白質(zhì)時，在陽極用加樣杯加樣，可以得到更好的圖譜。普通而言，膠內(nèi)重泡漲是引薦杯加樣，可以得到更好的圖譜。普通而言，膠內(nèi)重泡漲是引薦方式，可以添加蛋白質(zhì)的上樣量，也防止了在陰極或陽極加樣方式，可以添加蛋白質(zhì)的上樣量，也防止了在陰極或陽極加樣的方向問題。的方向問題。分析型雙向凝膠電泳上樣量在幾十至幾百微克之間，制備型雙分析型雙向凝膠電泳上樣量在

44、幾十至幾百微克之間，制備型雙向凝膠電泳上樣量在數(shù)百銀染到最大幾十毫克考馬斯亮向凝膠電泳上樣量在數(shù)百銀染到最大幾十毫克考馬斯亮藍(lán)染色之間，上樣量的大小和膠條的藍(lán)染色之間，上樣量的大小和膠條的pH范圍也有關(guān)系，范圍也有關(guān)系，pH 范圍越窄，上樣量月大。但由于蛋白質(zhì)定量方法的反復(fù)性并不范圍越窄，上樣量月大。但由于蛋白質(zhì)定量方法的反復(fù)性并不非常可靠，最正確的上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來優(yōu)化。非?？煽?，最正確的上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來優(yōu)化。蛋白載樣量蛋白載樣量影響影響IPG膠條對蛋白載樣量的要素包括：膠條對蛋白載樣量的要素包括：待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳

45、的目的：假設(shè)只是得到一張好的圖片，那么無需電泳的目的：假設(shè)只是得到一張好的圖片，那么無需思索太多其它要素。思索太多其它要素。待研討蛋白的豐度：待研討蛋白的豐度：樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡能夠的了樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡能夠的了解所包含的每種蛋白，需求反復(fù)實(shí)驗(yàn)才干完成。假解所包含的每種蛋白，需求反復(fù)實(shí)驗(yàn)才干完成。假設(shè)將待檢樣品被富集以后那么更易分析。設(shè)將待檢樣品被富集以后那么更易分析。IPG膠條的膠條的pH范圍：范圍：IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Prep

46、arative Load(Coom staining)7cm10100 g /125 l200500ug/125 l11cm50200 g /185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中 pH梯度的選擇梯度的選擇 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。預(yù)分步預(yù)分步搜集搜集細(xì)胞漿細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞核 細(xì)胞膜細(xì)胞膜核糖體及其他核糖體及其他特定細(xì)胞成份特定細(xì)胞成份細(xì)胞分細(xì)胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH 3-4pH 4-5pH 5-6pH 6-7

47、pH 7-8pH 8-9pH 9-10pH 10-11pH 11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范圍陣列分別范圍陣列分別低豐度或交叉覆蓋蛋白低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細(xì)胞定位位陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì)置的功能蛋白質(zhì)亞蛋白質(zhì)組陣列戰(zhàn)略的框架圖亞蛋白質(zhì)組陣列戰(zhàn)略的框架圖3倍3倍聚焦時間的優(yōu)化聚焦時間的優(yōu)化 重泡漲終了后，在膠條和電極之間加上潤濕的小紙片，它可以重泡漲終了后，在膠條和電極之間加上潤濕的小紙片，它可以吸收鹽離子和補(bǔ)充水分。在陰極加上吸收鹽離子和補(bǔ)充水分。在陰極加上20mmol/L DTT潤濕的紙潤濕的紙片可減少堿性端的程度條紋并且有助于堿性蛋白質(zhì)的聚

48、焦。片可減少堿性端的程度條紋并且有助于堿性蛋白質(zhì)的聚焦。從實(shí)際上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和反復(fù)性所需的最正確時間從實(shí)際上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和反復(fù)性所需的最正確時間是是IEF分別到達(dá)穩(wěn)定態(tài)所需的時間。分別到達(dá)穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導(dǎo)致程度和垂直條紋的出現(xiàn)。聚焦時間太短，會導(dǎo)致程度和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會由于活性水轉(zhuǎn)過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會由于活性水轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠外表滲出電滲而呵斥蛋白圖譜變膠外表滲出電滲而呵斥蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生程度條紋以及蛋白喪失。性，在膠條堿性端產(chǎn)生程度條紋以及蛋白喪失。

49、最正確時間確實(shí)定需求根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、最正確時間確實(shí)定需求根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍范圍和膠條長度經(jīng)過閱歷來確定。和膠條長度經(jīng)過閱歷來確定。等電聚焦的電壓上升分為三個階段首先加上一個比較低的電壓，等電聚焦的電壓上升分為三個階段首先加上一個比較低的電壓，去出膠條中的過多的鹽離子；然后開場加高電壓，電壓上升的去出膠條中的過多的鹽離子；然后開場加高電壓，電壓上升的方式為緩慢上升；最后是繼續(xù)高壓，電壓上升的方式為快速上方式為緩慢上升；最后是繼續(xù)高壓，電壓上升的方式為快速上升。普通原那么是：根據(jù)膠條的升。普通原那么是：根據(jù)膠條的pH范圍和上樣量的多少，總范圍和上樣量的多少，總電壓時間積可

50、以在一定的范圍內(nèi)調(diào)整。電壓時間積可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)整。IEF的根本條件的根本條件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-

51、hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid兩維間的平衡兩維間的平衡 一維等點(diǎn)聚焦電泳終了后可馬上進(jìn)展二維電泳，一維等點(diǎn)聚焦電泳終了后可馬上進(jìn)展二維電泳，也可保管在兩片塑料膜間于也可保管在兩片塑料膜間于80保管數(shù)月。保管數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)展膠條的平衡，以便于被但在二維電泳前一定要進(jìn)展膠條的平衡，以便于被分別的蛋白質(zhì)與分別的蛋白質(zhì)與SDS完好結(jié)合，從而在完好結(jié)合，從而在SDS-PAGE 時電泳能順利進(jìn)展。時電泳能順利進(jìn)展。建議方案是：用含建議方案是：用含2% (m/v) SDS、1% (m/v) DTT、6 mM尿素和尿素和30%甘油的甘

52、油的50mM Tris (pH8.8) 緩沖液緩沖液先平衡先平衡15min，再用，再用5% (m/v) 碘乙酰胺取代碘乙酰胺取代DTT后后的上述緩沖液平衡的上述緩沖液平衡15 min。假設(shè)用。假設(shè)用TBP替代替代DTT那那么只需一步平衡。么只需一步平衡。 二維二維 SDS-PAGE同普通同普通SDS-PAGE類似。類似。但普通在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，可以把但普通在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，可以把 IPG 膠條看作是緊縮膠，由膠條看作是緊縮膠，由于在于在 IPG 膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以以為非限制性膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以以為非限制性 IEF 膠低濃膠低濃度丙烯酰胺膠充任了濃

53、縮膠，所以只需運(yùn)用分別膠也可運(yùn)用緊縮膠。度丙烯酰胺膠充任了濃縮膠，所以只需運(yùn)用分別膠也可運(yùn)用緊縮膠。IPG 膠條平衡好后，普通將膠條在電泳緩沖夜里浸一下，這樣一方面可以膠條平衡好后，普通將膠條在電泳緩沖夜里浸一下，這樣一方面可以清洗膠條去除膠條上的平衡液，另一方面，潤濕的膠條也容易沿著玻璃板清洗膠條去除膠條上的平衡液，另一方面，潤濕的膠條也容易沿著玻璃板推到推到SDS-PAGE膠上端。膠上端。IPG膠條轉(zhuǎn)移到膠條轉(zhuǎn)移到SDS-PAGE有兩種方式：一種方式是先將有兩種方式：一種方式是先將IPG膠條放到膠條放到SDS-PAGE膠上，再參與熔化的瓊脂糖溶液；另一種方式是先參與熔化的瓊脂糖膠上，再參與

54、熔化的瓊脂糖溶液；另一種方式是先參與熔化的瓊脂糖溶液，再將溶液，再將 IPG 膠條放到膠條放到 SDS-PAGE 膠膠 上。兩種方法各有優(yōu)劣，第一種方上。兩種方法各有優(yōu)劣，第一種方式圖譜不易變形，但在兩塊膠之間容易有小氣泡發(fā)生，第二種方式非常好式圖譜不易變形，但在兩塊膠之間容易有小氣泡發(fā)生，第二種方式非常好地處理了膠之間的氣泡問題，但瓊脂糖容易凝固，插入地處理了膠之間的氣泡問題，但瓊脂糖容易凝固，插入 IPG 膠時有時會呵膠時有時會呵斥圖譜變形。相比較之下，氣泡對圖譜的影響較小，故常引薦第一種方式。斥圖譜變形。相比較之下，氣泡對圖譜的影響較小，故常引薦第一種方式。SDS-PAGE膠的濃度需根據(jù)

55、研討目的和樣品性質(zhì)而定。常用的是膠的濃度需根據(jù)研討目的和樣品性質(zhì)而定。常用的是12%和和12.5 %的均一膠，灌膠方便，反復(fù)性好，但相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較的均一膠，灌膠方便，反復(fù)性好，但相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較為聚集，分別不佳。如采用為聚集，分別不佳。如采用9-16%的線性梯度膠，相對分子質(zhì)量不同的蛋白的線性梯度膠，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)點(diǎn)在整塊凝膠上分布比較均勻，但灌膠不易。質(zhì)點(diǎn)在整塊凝膠上分布比較均勻，但灌膠不易。電泳過程中溫度普通控制在電泳過程中溫度普通控制在10-15。聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的理想顯色劑

56、的7S平安平安 (safety)；靈敏靈敏 (sensitivity)；簡單簡單 (simplicity)；特異性特異性 (specificity)；快速快速 (speed)；穩(wěn)定穩(wěn)定 (stability)；兼容性兼容性 (synergy)。有機(jī)染料和銀染有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為810ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進(jìn)展修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯 (PVDF) 和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺陷是：對某些種類的

57、蛋白質(zhì)染色效果差，對其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析呵斥影響。這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 負(fù)負(fù) 染染能專門提高 PAGE 膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快 (515min)，蛋白質(zhì)的生物活性能堅(jiān)持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA 或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)展提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完好蛋白質(zhì)的膠上被動提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅咪唑染料等的運(yùn)用。膠體分散染料膠體分散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀

58、染類似。這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。有機(jī)熒光團(tuán)染料有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是曾經(jīng)商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對SDS-PAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)展一步染色，約3060min完成，靈敏度為210ng。染色后的凝膠用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)展照像保管，其線性范圍為3個數(shù)量級。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中經(jīng)過SAGE所獲得的基因表達(dá)程度的動態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)展免疫染色或Edman測序來鑒定蛋白質(zhì)。金屬螯合染料金屬螯

59、合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研討相兼容的、相對較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺 (包括自動化凝膠染色儀、圖像分析任務(wù)站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解任務(wù)站和質(zhì)譜儀等) 相結(jié)合。其中SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。凝膠的圖像處置和分析凝膠的圖像處置和分析典型流程：典型流程：凝膠圖像的掃描；凝膠圖像的掃描；圖像加工；圖像加工；斑點(diǎn)檢測和定量；斑點(diǎn)檢測和定量；凝膠配比；凝膠配比；數(shù)據(jù)分析；數(shù)據(jù)分析；數(shù)據(jù)呈遞和解釋；數(shù)據(jù)呈遞和解釋；2-DE數(shù)據(jù)庫的建立。數(shù)據(jù)庫的建立。2D-PAGE問題

60、與緣由問題與緣由第一向等電聚焦的問題第一向等電聚焦的問題問題與現(xiàn)象問題與現(xiàn)象可能原因與解決措施可能原因與解決措施IPG膠條在靠近膠條在靠近電極附近燒焦電極附近燒焦電流限制太高，最大電流限制設(shè)為電流限制太高，最大電流限制設(shè)為50A；IPG膠條沒有完全重泡漲；膠條沒有完全重泡漲；應(yīng)檢查重泡漲液的體積，保證重泡漲液的體積足夠；應(yīng)檢查重泡漲液的體積，保證重泡漲液的體積足夠；IPG膠條過于干燥；重泡漲和等電聚焦時加礦物油。膠條過于干燥；重泡漲和等電聚焦時加礦物油。電壓太低，達(dá)不電壓太低，達(dá)不到最高電壓到最高電壓樣品鹽濃度太高；樣品鹽濃度太高；脫鹽或稀釋樣品，等電聚焦脫鹽或稀釋樣品，等電聚焦12h后更換電