掃描電鏡樣品制備

1、實(shí)驗(yàn)十一實(shí)驗(yàn)十一 掃描電鏡樣品制備掃描電鏡樣品制備選作掃描電鏡即掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，簡稱SEM）。主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)表面的結(jié)構(gòu)等。一、掃描電鏡工作原理：主要是利用樣品表面產(chǎn)生的二次電子成像來對物質(zhì)主要是利用樣品表面產(chǎn)生的二次電子成像來對物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，是探索微觀世界的有力工具。的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，是探索微觀世界的有力工具。主要優(yōu)點(diǎn)：景深長，所獲得的圖像立體感強(qiáng)，可用來觀察生物樣品的各種形貌特征。二、實(shí)驗(yàn)用品二、實(shí)驗(yàn)用品1. 材料 植物的的根、莖、葉或動物的臟器等。2. 試劑 丙酮、乙醇、2戊二醛溶液、1鋨

2、酸、0.1mol/L PH7.2磷酸緩沖液、醋酸異戊酯、液體二氧化碳、導(dǎo)電膠等。3. 器材 掃描電鏡、 臨界點(diǎn)干燥法、真空噴鍍儀、青霉素小瓶、培養(yǎng)皿、載玻片、牙簽、脫脂棉等。1. 取樣：取樣： 將取下的動植物組織放入預(yù)冷的含有2戊二醛溶液的載玻片上，用刀片將組織塊切成長4mm左右、高3mm左右的小塊。2. 樣品的清潔：樣品的清潔： 把載玻片上切好的樣品快，用牙簽輕輕地逐個撥入盛有0.1mol/L PH7.2磷酸緩沖液的青霉素小瓶中漂洗，并反復(fù)更換用于清洗的緩沖液，一般漂洗1小時，換液3-4次。3. 樣品的固定樣品的固定 樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但

3、由于掃描電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透射電鏡樣品處理有不同之處。 一般在4的條件下完成固定比較好， 戊二醛、鋨酸均可單獨(dú)固定，也可用“戊二醛-鋨酸”雙重固定法。 固定1-3小時（依樣品種類和固定劑而已）后，吸出固定液， 加入0.1mol/L PH7.2磷酸緩沖液，漂洗1小時，換液3-4次。4. 脫水脫水 從小瓶中吸出緩沖液， 加入乙醇逐級梯度脫水，脫水劑的乙醇濃度依次為30%50%70%80%90%100%乙醇（兩次）逐級脫水；樣品在每級停留15-30分鐘。5. 置換乙醇置換乙醇 吸出乙醇，加入醋酸異戊酯與乙醇1：1的混合液，浸泡10-

4、20分鐘并適當(dāng)搖動，再吸棄混合液，加入純醋酸異戊酯浸泡10-20分鐘并適當(dāng)搖動。6. 樣品的干燥樣品的干燥 常規(guī)臨界點(diǎn)干燥法。臨界點(diǎn)干燥法臨界點(diǎn)干燥法臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面(液相氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷。具體處理步驟如下： 裝樣： 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0處預(yù)冷1015min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中)。 注入液體二氧化碳 依次打開

5、二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在010下，向樣品杯注入液體二氧化碳。 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置1520min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后，打開儀器排氣流量計閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80左右，關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液。 加溫置換：將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20處經(jīng)1520min后，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置

6、換。 氣化：將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(3540)，此時隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加，達(dá)到二氧化碳的臨介點(diǎn)，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時，經(jīng)5min后，即可排氣。 排氣：在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源)，打開流量計的排氣閥門，以1.01.51min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)4560min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。 臨界點(diǎn)干燥操作時的注意事項(xiàng)：臨界點(diǎn)干燥操作時的注意事項(xiàng)： 在樣品放進(jìn)樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至010。 樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干

7、半濕時送入樣品杯。因?yàn)檫^濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒有意義了。 一次加入的樣品不宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點(diǎn)。 充入液體二氧化碳的量要足。因?yàn)槌湟毫坎蛔?，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用，一般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右。 在加溫氣化時，實(shí)際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài)。 開、閉閥門時，動作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢

8、，一般放氣時間應(yīng)在4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午。 7. 粘貼樣品粘貼樣品 用牙簽將少量導(dǎo)電膠涂到樣品臺上，膠面應(yīng)略小于樣品底面。用鑷子輕夾樣品側(cè)面，保證觀察面向上貼牢在涂膠上。粘貼后，待導(dǎo)電膠干透，才能進(jìn)行真空鍍膜和SEM鏡檢。8. 樣品的導(dǎo)電處理樣品的導(dǎo)電處理 生物樣品和其他非金屬樣品的表面電阻率很高，在電鏡觀察時，往往容易發(fā)生荷電現(xiàn)象。另外，生物樣品都是由低原子序數(shù)的碳、氫、氧、氮等元素組成，二次電子的發(fā)射率很低，信號弱，難以獲得必要的圖像反差。因此，為了消除或減少以上不良現(xiàn)象的產(chǎn)生，生物樣品和非導(dǎo)電的樣品在掃描電鏡觀察前，均需進(jìn)行表面導(dǎo)電處理。掃描電鍍樣品的表面導(dǎo)電處理方法

9、，主要有金屬鍍膜法和組織導(dǎo)電處理法兩種。其中金屬鍍膜法又有真空鍍膜及離子濺射鍍膜法等方法，本實(shí)驗(yàn)采用離子濺射鍍膜法進(jìn)行鍍膜。 離子濺射鍍膜法離子濺射鍍膜法: 在低真空中進(jìn)行輝光放電時，由于離子沖擊，陰極金屬物質(zhì)有飛濺現(xiàn)象稱為濺射。利用離子濺射儀對樣品進(jìn)行金屬鍍膜的方法，稱為濺射鍍膜法。濺射鍍膜法的裝置很簡單，主要由真空部分(真空泵)和濺射部分(真空罩)組成，在真空罩內(nèi)裝有陰極和陽極，陰極對著陽極的一面裝有用于濺射用的金屬靶(黃金靶、鉑靶、白金靶或鈀靶等)，樣品放在陽極的樣品座上面。當(dāng)真空罩內(nèi)的真空度抽到101Pa時，在陰極與陽極之間加上10003000V的直流電壓，兩極之間產(chǎn)生弧光放電的電場。在電場的作用下，罩內(nèi)殘余的氣體分子被電離為正離子和電子，正離子被陰極吸引轟擊金屬靶，激發(fā)出金屬顆粒和電子，并被陽極吸引附著在樣品表面而形成金屬導(dǎo)電膜。 離子濺射鍍膜法操作注意事項(xiàng)：離子濺射鍍膜法操作注意事項(xiàng)： 樣品要充分干燥，否則，金屬顆粒不但不能附著，反而會引起樣品損傷，特