[12秋]C22免疫學檢測技術(shù)的基本原理(1學時)

1、12免疫學檢測技術(shù)的基本原理 體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點及影響因素 體內(nèi)：抗原+抗體免疫反應(yīng) 體外：抗原+抗體進行檢測 檢測抗原和抗體的體外實驗(血清學實驗） 凝集反應(yīng) 沉淀反應(yīng) 免疫標記技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 免疫細胞功能的檢測3第一節(jié) 體外抗原抗體反應(yīng)的特點及影響因素（一）抗原抗體反應(yīng)的特點 1. 特異性 2. 可逆性 3. 比例性 4.抗原抗體反應(yīng)的兩個階段 抗原抗體特異性結(jié)合階段 可見反應(yīng)階段 41.1.高度特異性高度特異性抗原抗體反應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位(決定簇)與抗體分子超變區(qū)間的互補結(jié)合。5抗原和抗體的結(jié)合是互補性的特異性結(jié)合?？乖涂贵w的結(jié)合是互補性的特異性結(jié)合。不形成牢固的共價鍵

2、，通過非共價鍵結(jié)合。不形成牢固的共價鍵，通過非共價鍵結(jié)合。2.2.表面化學基團之間的可逆結(jié)合（可逆性）表面化學基團之間的可逆結(jié)合（可逆性）6AbAgAbAg特異性特異性結(jié)合力的表示方法結(jié)合力的表示方法親和力和親合力親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab結(jié)合的力結(jié)合的力親和力親合力73.3.適宜的抗原抗體濃度和比例（比例性）適宜的抗原抗體濃度和比例（比例性）Ab 過剩Ag 過剩比例適當，交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò)8（二）抗原抗體反應(yīng)的影響因素1.1.電解質(zhì)電解質(zhì) 0.85%0.85%氯化鈉或各種緩沖液氯化鈉或各種緩沖液2 2 . .溫度溫度 3737 56 563 3 . .酸堿度酸堿度 最適最適pHpH值在

3、值在6-86-8之間之間9第二節(jié)第二節(jié) 檢測抗原和抗體的體外試驗檢測抗原和抗體的體外試驗抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)直接凝集直接凝集間接凝集間接凝集沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫比濁免疫比濁單向免疫擴散單向免疫擴散雙向免疫擴散雙向免疫擴散免疫電泳免疫電泳蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)免疫標記免疫標記熒光熒光酶酶同位素同位素化學發(fā)光化學發(fā)光膠體金膠體金免疫印跡免疫印跡10定義： 細菌、細胞等顆粒性抗原或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。一、凝集反應(yīng)（一、凝集反應(yīng)（agglutination reactions)11包括：1.直接凝集反應(yīng) (d

4、irect agglunitation reatctions) 玻片法：ABO血型鑒定、細菌鑒定 試管法：抗體效價的判定2.間接凝集反應(yīng) (indirect agglunitation reactions)12直接凝直接凝集反應(yīng)集反應(yīng) 1:2稀釋待測血清 1:4 1:8 1:16 玻片法玻片法試管法試管法ABO血型血型或菌種鑒或菌種鑒定定檢測抗體檢測抗體的的滴度或滴度或效價效價13 將可溶性將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)上，形成致敏顆粒，然后再與相應(yīng)Ab/Ag進進行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫做間接凝集反應(yīng)。行反應(yīng)產(chǎn)生凝集，叫做間接凝集反應(yīng)。間接凝

5、集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)14凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷凝集反應(yīng)常用于溶血性疾病的診斷+病人的病人的RBC體內(nèi)體內(nèi)anti-Rh由于抗體多屬于由于抗體多屬于IgG，分子，分子量較小，抗體與紅細胞間的量較小，抗體與紅細胞間的結(jié)合力不能克服細胞間的排結(jié)合力不能克服細胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集斥力，不出現(xiàn)凝集+體外加入體外加入抗人抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象出現(xiàn)凝集現(xiàn)象正常人正常人O型血型血的的Rh+的的RBC+患者血清內(nèi)的患者血清內(nèi)的游離游離anti-Rh+體外加入體外加入抗人抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象出現(xiàn)凝集現(xiàn)象直接庫姆試驗直接庫姆試驗間接庫姆試驗間接庫姆試驗15二、沉淀反應(yīng)（二、沉淀反應(yīng)（precipitat

6、ion reactions）定義： 毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。16可在液體可在液體/ /半固體瓊脂中進行。半固體瓊脂中進行。包括： 1.速率散射比濁法/免疫比濁法 2.單向瓊脂擴散 3.雙向瓊脂擴散 4.免疫電泳17AgAgAgAgAb in gel單向瓊脂擴散免疫比濁過量Ab Ab Ab Ab用于確定用于確定抗原濃度抗原濃度18Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴散鑒定多種抗原是完全相同、部鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同分相同或完全不同19免疫電泳 存在于不同區(qū)域的抗原存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結(jié)合，在比例適宜

7、處與抗體結(jié)合，在比例適宜處形成沉淀弧。形成沉淀弧。 沉淀弧的數(shù)量、位置和沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標準品相對比，可分形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質(zhì)。析樣品的成分及其性質(zhì)。20 將抗原抗體反應(yīng)與標記技術(shù)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的一類試驗方法。 為了提高單純的抗原和抗體檢測的靈敏性，將已為了提高單純的抗原和抗體檢測的靈敏性，將已知的抗體或抗原標記上示蹤物質(zhì)，通過檢測標記物，知的抗體或抗原標記上示蹤物質(zhì)，通過檢測標記物，間接測定抗原抗體復(fù)合物。間接測定抗原抗體復(fù)合物。 三、免疫標記技術(shù)三、免疫標記技術(shù)(immunolabeling techniques)21常用的標記物： 酶 熒光素

8、放射性元素 膠體金 化學發(fā)光物質(zhì)等22免疫酶測定法a) 雙抗體夾心法ELISAb) 間接ELISAa）b）c) BASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁d) 微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) 將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強物素、親和素、酶相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。度判斷未知抗原的含量。23e) 免疫組化技術(shù)定位、定性、定量檢測定位、定性、定量檢測24免疫熒光技術(shù)25放射免疫測定 用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。用

9、放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的將同位素的敏感性敏感性與抗原抗體結(jié)合的與抗原抗體結(jié)合的特異性特異性結(jié)合起來，結(jié)合起來，具有重復(fù)性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于激素、具有重復(fù)性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I?；瘜W發(fā)光免疫技術(shù) 將化學發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種將化學發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是新的免疫分析技術(shù)。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾魯米諾。 靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。26免疫膠體金技術(shù)1.用膠體金顆粒

10、標記用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知，以檢測未知Ag/Ab的方法。的方法。2.氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。3.該技術(shù)可應(yīng)用于該技術(shù)可應(yīng)用于免疫組化免疫組化(光鏡下檢查光鏡下檢查)和和免疫層析免疫層析快速診斷?？焖僭\斷。27免疫印跡法-Western blotting28四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微陣列，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列。根據(jù)又稱為蛋白質(zhì)微陣列，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列

11、。根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。29第三節(jié)第三節(jié) 免疫細胞功能的檢測免疫細胞功能的檢測淋巴細胞及其淋巴細胞及其亞群的分離亞群的分離免疫細胞免疫細胞功能測定功能測定磁珠分離法磁珠分離法免疫吸附分離法免疫吸附分離法流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)肽肽-MHC-MHC四聚體技術(shù)四聚體技術(shù)T T細胞功細胞功能測定能測定B B細胞功細胞功能測定能測定細胞因細胞因子檢測子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒細胞毒試驗試驗吞噬功吞噬功能測定能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法

12、細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法30一、免疫細胞的分離稀釋血液淋巴細胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078) 離心單 個核細胞(PBMC，包括淋巴細胞、DC和NK)紅細胞和粒細胞血漿外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞的分離31磁珠分離法磁珠分離法免疫吸附分離法免疫吸附分離法流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)肽肽MHCMHC四聚體技術(shù)四聚體技術(shù)淋巴細胞及其亞群的分離淋巴細胞及其亞群的分離32免疫吸附分離法免疫吸附分離法加入淋巴加入淋巴細胞懸液細胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清棄上清33磁珠分離法磁珠分離法34流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)熒光抗體標記混

13、合細胞噴嘴單細胞懸液5000-10000個/秒細胞分選器熒光檢測器35抗原肽抗原肽-MHC四聚體分離技術(shù)四聚體分離技術(shù)親和素親和素抗原肽抗原肽MHC I生物素生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素熒光素36二、免疫細胞功能的測定二、免疫細胞功能的測定T T細胞功細胞功能測定能測定B B細胞功細胞功能測定能測定細胞因細胞因子檢測子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒細胞毒試驗試驗吞噬功吞噬功能測定能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法37T

14、 T細胞功細胞功能測定能測定T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應(yīng)的檢測T細胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測：1. 形態(tài)計數(shù)法：形態(tài)計數(shù)法：活化細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；2.3H-TdR或或125I-UdR摻入法：摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。3. MTT (四甲基偶氮唑鹽四甲基偶氮唑鹽)比色法：比色法：外來抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答后，再用相同的抗原作皮試，可導(dǎo)致遲發(fā)型超敏反應(yīng)，T細胞活化并釋放多種細胞因子，產(chǎn)生以單個核細胞浸潤為主的炎癥，局部

15、發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達高峰。陽性反應(yīng)表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應(yīng)強烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應(yīng)，細胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應(yīng)。常用于檢測某些微生物感染、免疫缺陷病、腫瘤患者免疫功能測定。38B B細胞功細胞功能測定能測定抗體含量測定溶血空斑試驗可通過單項瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等測定標本中各類Ig的含量。綿羊紅細胞(SRBC)免疫動物4天后取出動物脾臟，在脾細胞懸液中含有抗SRBC的漿細胞脾細胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶血空斑。1個空斑區(qū)代表1個漿細胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細胞的數(shù)目

16、加入新鮮補體，倒入平皿中培養(yǎng)39細胞毒細胞毒試驗試驗51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法靶細胞被殺傷后，向體系中加入臺盼蘭，可進入膜破損的細胞內(nèi)，將細胞染成藍色?；罴毎苋径恢?。40凋亡細胞檢測法瓊脂糖電泳法正常細胞基因組DNA凋亡細胞TUNEL法在細胞中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生物素標記的核苷酸TdT能在游離的DNA3端缺口連接標記的核苷酸加入親和素-酶復(fù)合物，在DNA斷裂處顯色41巨噬細胞吞噬試驗吞噬功吞噬功能測定能測定硝基藍四氮唑(NBT)試驗在殺菌過程中產(chǎn)生反應(yīng)性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進細胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞可反映PMN的殺傷功能。將待測mf與雞紅細胞混合溫育后，雞紅細胞被mf吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細胞的mf/mf總數(shù)42細胞因細胞因子檢測子檢測生物活性檢測法免疫學檢測法夾心ELISA熒光素標記抗體染胞內(nèi)細胞因子，F(xiàn)ACS分析細胞增殖或增殖抑制法，如細胞因子依