酶工程課件——CH5-2固定化酶的性質(zhì)

1、CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)1. 固定化處理對(duì)酶性質(zhì)的影響固定化處理對(duì)酶性質(zhì)的影響 從溶液酶的游離狀態(tài)，到固定化酶的從溶液酶的游離狀態(tài)，到固定化酶的“局限局限”狀態(tài)，是一個(gè)很大的轉(zhuǎn)變。不僅酶分子本身，狀態(tài)，是一個(gè)很大的轉(zhuǎn)變。不僅酶分子本身，而且酶反應(yīng)的環(huán)境也有所不同。因而，固定化而且酶反應(yīng)的環(huán)境也有所不同。因而，固定化酶的性質(zhì)與溶液酶大相徑庭酶的性質(zhì)與溶液酶大相徑庭固定化酶的制備方法很多，酶在固定化過(guò)程中，固定化酶的制備方法很多，酶在固定化過(guò)程中，對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響各不相同。對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響各不相同。我們我們假定假定酶固定化之后，在載體表面或多孔介質(zhì)內(nèi)的分酶固定化之后，在

2、載體表面或多孔介質(zhì)內(nèi)的分布完全均勻布完全均勻，我們不考慮固定化處理過(guò)程中，我們不考慮固定化處理過(guò)程中，技術(shù)操作的問(wèn)題，我們技術(shù)操作的問(wèn)題，我們可以將固定化帶來(lái)影響可以將固定化帶來(lái)影響概括為如下三個(gè)方面：概括為如下三個(gè)方面： 構(gòu)象改變、立體屏蔽構(gòu)象改變、立體屏蔽酶在固定化過(guò)程中，由于酶和載體之間相互作用，引起酶分子構(gòu)象發(fā)酶在固定化過(guò)程中，由于酶和載體之間相互作用，引起酶分子構(gòu)象發(fā)生某種扭曲，從而導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力發(fā)生生某種扭曲，從而導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力發(fā)生改變，在大多數(shù)情況下，固定化致使酶活性不同程度下降。而立體屏改變，在大多數(shù)情況下，固定化致使酶活性不

3、同程度下降。而立體屏蔽是指固定化后，由于載體孔隙太小，或固定化的結(jié)合方式不對(duì)蔽是指固定化后，由于載體孔隙太小，或固定化的結(jié)合方式不對(duì)( (如圖如圖所示所示) )使酶活性中心或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使效應(yīng)物或底物與使酶活性中心或調(diào)節(jié)部位造成某種空間障礙，使效應(yīng)物或底物與酶的鄰近或接觸受到限制。酶的鄰近或接觸受到限制。圖 固定化酶的立體屏障效應(yīng)活性中心向里活性中心向里活 性 中 心 向活 性 中 心 向外外 分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制分配效應(yīng)和擴(kuò)散限制這兩種效應(yīng)都和微環(huán)境密切相關(guān)。所謂微環(huán)境是指緊鄰固這兩種效應(yīng)都和微環(huán)境密切相關(guān)。所謂微環(huán)境是指緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域，主要是載體的疏水親水及電荷性質(zhì)帶定

4、化酶的環(huán)境區(qū)域，主要是載體的疏水親水及電荷性質(zhì)帶來(lái)的影響。來(lái)的影響。 分配效應(yīng)分配效應(yīng) 是由于載體性質(zhì)造成的酶的底物或其他效是由于載體性質(zhì)造成的酶的底物或其他效應(yīng)物在微觀環(huán)境和宏觀體系之間的不等性分配，從而影響應(yīng)物在微觀環(huán)境和宏觀體系之間的不等性分配，從而影響酶促反應(yīng)速度的一種效應(yīng)。酶促反應(yīng)速度的一種效應(yīng)。 擴(kuò)散限制效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng) 是指底物、產(chǎn)物和其它效應(yīng)物在環(huán)境是指底物、產(chǎn)物和其它效應(yīng)物在環(huán)境中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度受到的限制作用。有外擴(kuò)散限制和內(nèi)擴(kuò)中的遷移運(yùn)轉(zhuǎn)速度受到的限制作用。有外擴(kuò)散限制和內(nèi)擴(kuò)散限制兩種類(lèi)型。前者是指物質(zhì)從宏觀體系穿過(guò)包圍在固散限制兩種類(lèi)型。前者是指物質(zhì)從宏觀體系穿過(guò)包圍在固

5、定化酶顆粒周?chē)跬囊耗佣ɑ割w粒周?chē)跬囊耗? (又稱又稱NernslNernsl層層) )達(dá)到顆達(dá)到顆粒表面時(shí)所受到的限制。內(nèi)擴(kuò)散限制是指上述物質(zhì)進(jìn)一步粒表面時(shí)所受到的限制。內(nèi)擴(kuò)散限制是指上述物質(zhì)進(jìn)一步向顆粒內(nèi)部酶所在點(diǎn)擴(kuò)散所受到的限制。向顆粒內(nèi)部酶所在點(diǎn)擴(kuò)散所受到的限制。 微擾微擾由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性質(zhì)，直由于載體的親水、疏水作用和介質(zhì)的介電常數(shù)等性質(zhì)，直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力，這種接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力，這種效應(yīng)稱為微擾。目前還不能作定量描述。實(shí)際上構(gòu)象改變，效應(yīng)稱為微擾。目前還不能作定量描述。實(shí)際上構(gòu)象

6、改變，立體屏蔽效應(yīng)，也還不能作定量描述。近年來(lái)，關(guān)于蛋白立體屏蔽效應(yīng)，也還不能作定量描述。近年來(lái)，關(guān)于蛋白質(zhì)質(zhì)“可及表面可及表面”計(jì)算方法的進(jìn)展，似為這幾種效應(yīng)的定量計(jì)算方法的進(jìn)展，似為這幾種效應(yīng)的定量討論，展示了一種前景。以上效應(yīng)將具體表現(xiàn)在酶的動(dòng)力討論，展示了一種前景。以上效應(yīng)將具體表現(xiàn)在酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、酶的穩(wěn)定性、酶促反應(yīng)影響因素、乃至酶的底物學(xué)性質(zhì)、酶的穩(wěn)定性、酶促反應(yīng)影響因素、乃至酶的底物專(zhuān)一性等方面。專(zhuān)一性等方面。CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)2. 固定化的酶性質(zhì)固定化的酶性質(zhì) 分配效應(yīng)對(duì)分配效應(yīng)對(duì)KmKm的影響的影響 這種影響通常用分配系數(shù)這種影響通常用分配系數(shù)()()

7、來(lái)描述：來(lái)描述：SiSi S (1)S (1)式中式中 SiSi 和和SS分別表示底物或其它效應(yīng)分別表示底物或其它效應(yīng)物在微環(huán)境中的局部濃度和宏觀體系中物在微環(huán)境中的局部濃度和宏觀體系中的總體的總體( (或平均或平均) )濃度。濃度。對(duì)最簡(jiǎn)單的固定化酶系統(tǒng)而言，其動(dòng)力學(xué)性態(tài)，一般仍對(duì)最簡(jiǎn)單的固定化酶系統(tǒng)而言，其動(dòng)力學(xué)性態(tài)，一般仍服從米氏方程。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，消除外擴(kuò)散服從米氏方程。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，消除外擴(kuò)散限制影響時(shí)，只考慮分配效應(yīng)的影響，則反應(yīng)速度可表限制影響時(shí)，只考慮分配效應(yīng)的影響，則反應(yīng)速度可表示如下：示如下： VmaxSiVmaxSi v= (2) v= (2) Km+

8、Si Km+Si Vmax VmaxS S = (3) = (3) Km+S Km+S VmaxS Vmax VmaxS VmaxSS = = (4) = = (4) Km/+S K Km/+S Km+Sm+S K Km= Km/ (5)m= Km/ (5)這表明分配系數(shù)的影響，是改變了這表明分配系數(shù)的影響，是改變了KmKm。K Km m是分配效應(yīng)是分配效應(yīng)影響下的表觀米氏常數(shù)。由式影響下的表觀米氏常數(shù)。由式(1)(1)和和(5)(5)，可以看出，可以看出 SiSi SS，則，則1 1， K Km mKmKm，表明固定化作用降低酶，表明固定化作用降低酶對(duì)底物的親和力。對(duì)底物的親和力。 通過(guò)載體

9、和底物電荷性質(zhì)、離子強(qiáng)度和通過(guò)載體和底物電荷性質(zhì)、離子強(qiáng)度和pHpH值對(duì)分配值對(duì)分配效應(yīng)的影響討論，可以得出一般性規(guī)律如下：效應(yīng)的影響討論，可以得出一般性規(guī)律如下： 載體與底物帶相同電荷時(shí)，相斥，載體與底物帶相同電荷時(shí)，相斥， SiSi SS，K Km mKmKm。 當(dāng)載體帶正電荷時(shí)，局部當(dāng)載體帶正電荷時(shí)，局部H H+ + 濃度低于總體濃度，濃度低于總體濃度， SiSi 變大，變大，K K變小，即酶活力一變小，即酶活力一pHpH曲線向酸性方向偏移，曲線向酸性方向偏移，亦即最適亦即最適pHpH向酸性方向偏移；反之，離子載體將向堿性向酸性方向偏移；反之，離子載體將向堿性方向偏移，如圖所示。方向偏移

10、，如圖所示。1. 載體帶正電荷，載體帶正電荷， 最適最適pH向偏酸性偏移；向偏酸性偏移；2. 游離酶的最適游離酶的最適pH3.3.載體帶負(fù)電荷，載體帶負(fù)電荷， 最適最適pH向偏堿方向偏移；向偏堿方向偏移； V 上述效應(yīng)，通過(guò)提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度，上述效應(yīng)，通過(guò)提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度，可以減弱或消除。當(dāng)離子強(qiáng)度等于載體電荷基團(tuán)可以減弱或消除。當(dāng)離子強(qiáng)度等于載體電荷基團(tuán)濃度一半時(shí)，濃度一半時(shí)，K Km mKmKm2 2，當(dāng)離子強(qiáng)度遠(yuǎn)大于，當(dāng)離子強(qiáng)度遠(yuǎn)大于載體電荷基團(tuán)濃度時(shí)，載體電荷基團(tuán)濃度時(shí)，K Km mKmKm。 采用疏水性載體時(shí)，如底物為極性物質(zhì)或電采用疏水性載體時(shí)，如底物為極性物質(zhì)或電荷性

11、物質(zhì)，則荷性物質(zhì)，則Si小，小，KmKm；如底物為疏水；如底物為疏水性物性物 CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)2. 固定化的酶性質(zhì)固定化的酶性質(zhì) 擴(kuò)散限制效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng) 酶固定化之后，由于擴(kuò)散限制，使得酶往往不能酶固定化之后，由于擴(kuò)散限制，使得酶往往不能得到宏觀體系相同水平的底物，因而觀測(cè)到的實(shí)效反得到宏觀體系相同水平的底物，因而觀測(cè)到的實(shí)效反應(yīng)速度，常低于理論預(yù)測(cè)的水平。對(duì)于這種影響，通應(yīng)速度，常低于理論預(yù)測(cè)的水平。對(duì)于這種影響，通常引用實(shí)效系數(shù)常引用實(shí)效系數(shù)O O進(jìn)行定量討論。進(jìn)行定量討論。 v=v=O Ov vp p O O = v /v = v /vp p （1 1）式中式中

12、v v為實(shí)效反應(yīng)速度，為實(shí)效反應(yīng)速度，v vp p為理論預(yù)期反應(yīng)速度，即由溶液酶的為理論預(yù)期反應(yīng)速度，即由溶液酶的米米孟氏方程確定的速度。孟氏方程確定的速度。 VmaxVmaxSS VmaxS 由由 v= v= O （2 2） Km+S Km+S Km+S 如前所述，擴(kuò)散包括外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散兩方面。如前所述，擴(kuò)散包括外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散兩方面。 外擴(kuò)散實(shí)際上包括分子擴(kuò)散和對(duì)流擴(kuò)散兩部外擴(kuò)散實(shí)際上包括分子擴(kuò)散和對(duì)流擴(kuò)散兩部分。在固定化酶反應(yīng)操作中，可以通過(guò)攪拌混和分。在固定化酶反應(yīng)操作中，可以通過(guò)攪拌混和而消除或削弱其限制作用。動(dòng)力學(xué)分析指出，外而消除或削弱其限制作用。動(dòng)力學(xué)分析指出，外擴(kuò)散限制效應(yīng)影響

13、下，酶反應(yīng)實(shí)效速度一般低于擴(kuò)散限制效應(yīng)影響下，酶反應(yīng)實(shí)效速度一般低于酶促轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)規(guī)定的速度。因此，這種擴(kuò)散限酶促轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)規(guī)定的速度。因此，這種擴(kuò)散限制可以看作是一種抑制效應(yīng)，可稱為擴(kuò)散抑制。制可以看作是一種抑制效應(yīng)，可稱為擴(kuò)散抑制。 內(nèi)擴(kuò)散限制對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，在某種程度上比外擴(kuò)散限制更內(nèi)擴(kuò)散限制對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，在某種程度上比外擴(kuò)散限制更突出，更重要。動(dòng)力學(xué)理論分析所得出的一些主要結(jié)論有以下三點(diǎn)，突出，更重要。動(dòng)力學(xué)理論分析所得出的一些主要結(jié)論有以下三點(diǎn)，可以用定性的語(yǔ)言來(lái)描述?？梢杂枚ㄐ缘恼Z(yǔ)言來(lái)描述。 底物和其它效應(yīng)物分子量對(duì)擴(kuò)散速率的影響分析表明，一般情底物和其它效應(yīng)物分子量

14、對(duì)擴(kuò)散速率的影響分析表明，一般情況下，固定化酶作用于高分子量底物比低分子量底物的實(shí)效反應(yīng)速度況下，固定化酶作用于高分子量底物比低分子量底物的實(shí)效反應(yīng)速度下降程度比溶液酶更大。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此理論分析是一致的。下降程度比溶液酶更大。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此理論分析是一致的。 載體結(jié)構(gòu)的影響分析表明，內(nèi)擴(kuò)散限制取決于載體的孔隙率、孔載體結(jié)構(gòu)的影響分析表明，內(nèi)擴(kuò)散限制取決于載體的孔隙率、孔隙半徑、孔隙曲折程度。即：底物的內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)與載體孔隙率成正比，隙半徑、孔隙曲折程度。即：底物的內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)與載體孔隙率成正比，與底物在宏觀體系中固有的擴(kuò)散系數(shù)成正比，與載體孔隙的曲折系數(shù)與底物在宏觀體系中固有的擴(kuò)散系數(shù)成正比

15、，與載體孔隙的曲折系數(shù)成反比，與載體膜厚度或載體顆粒半徑的平方成反比。實(shí)驗(yàn)支持了這成反比，與載體膜厚度或載體顆粒半徑的平方成反比。實(shí)驗(yàn)支持了這一理論分析。一理論分析。 內(nèi)擴(kuò)散限制與酶反應(yīng)固有速度有關(guān)。即是說(shuō)固有反應(yīng)速度內(nèi)擴(kuò)散限制與酶反應(yīng)固有速度有關(guān)。即是說(shuō)固有反應(yīng)速度v vp p 大，大，酶反應(yīng)的底物轉(zhuǎn)移系數(shù)也大，當(dāng)酶反應(yīng)的底物轉(zhuǎn)移系數(shù)也大，當(dāng)SS小于小于0.1 Km0.1 Km時(shí)，時(shí)，O O大，則固定化大，則固定化酶反應(yīng)速度也相對(duì)大。酶反應(yīng)速度也相對(duì)大。CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)3. 固定化的酶催化條件固定化的酶催化條件 酶活力回收率酶活力回收率 游離酶經(jīng)過(guò)固定化以后，酶活力往

16、往下降。游離酶經(jīng)過(guò)固定化以后，酶活力往往下降。固定化酶所保固定化酶所保留下來(lái)的酶活力與游離酶在固定化之前的酶活力之比，稱為該酶留下來(lái)的酶活力與游離酶在固定化之前的酶活力之比，稱為該酶活力回收率，也叫固定化效率、殘存活力等。活力回收率，也叫固定化效率、殘存活力等。在不考慮擴(kuò)散限制在不考慮擴(kuò)散限制影響的情況下，固定化酶的酶活力回收率可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得影響的情況下，固定化酶的酶活力回收率可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得由下式求得：由下式求得： V Vm m .B .Bimim F Fimim 100% 100% V Vm m .B .B式中式中F Fimim為活力回收率為活力回收率( () )，B B為固定化前所用的

17、游離酶溶液體積；為固定化前所用的游離酶溶液體積；B Bimim為制得的固定化酶濕體積；為制得的固定化酶濕體積；V Vm m 為固定化前的酶的最大反應(yīng)速為固定化前的酶的最大反應(yīng)速度；度；V Vm m 固定化酶測(cè)得的表觀最大反應(yīng)速度。固定化酶測(cè)得的表觀最大反應(yīng)速度。關(guān)于固定化酶收率問(wèn)題，有不同得報(bào)道，上述方法考慮了在固定化處關(guān)于固定化酶收率問(wèn)題，有不同得報(bào)道，上述方法考慮了在固定化處理過(guò)程中，有未被固定化的酶蛋白、在固定化過(guò)程中失活的酶蛋白以理過(guò)程中，有未被固定化的酶蛋白、在固定化過(guò)程中失活的酶蛋白以及在固定化后及在固定化后KcatKcat的變化（降低或升高）；的變化（降低或升高）；而另一種方法是

18、：而另一種方法是： V Vm m .B.Bimim F Fimim 100% 100% V Vm m . .（B BB B）式中符號(hào)與上式相同，式中符號(hào)與上式相同，B B為固定化處理后，回收的未固定的酶蛋白為固定化處理后，回收的未固定的酶蛋白的量。實(shí)際上這種方法，只考慮了在固定化處理過(guò)程中，固定化方法的量。實(shí)際上這種方法，只考慮了在固定化處理過(guò)程中，固定化方法對(duì)酶蛋白構(gòu)型、活性中心等的影響，把未被固定化的酶蛋白作為回收對(duì)酶蛋白構(gòu)型、活性中心等的影響，把未被固定化的酶蛋白作為回收考慮。考慮。 固定化酶的話力回收率因所采用的固定化方法而異。一般固定化酶的話力回收率因所采用的固定化方法而異。一般來(lái)說(shuō)

19、，來(lái)說(shuō)，F(xiàn) Fimim 值按下列固定化方法順序遞減：值按下列固定化方法順序遞減： 吸附法凝膠包埋法微型膠囊包埋法交聯(lián)法吸附法凝膠包埋法微型膠囊包埋法交聯(lián)法 例如，李增吉等例如，李增吉等(1993(1993年年) )報(bào)道，用報(bào)道，用DEAEDEAE纖維素直接纖維素直接吸附天冬氨酸酶，酶活力回收達(dá)吸附天冬氨酸酶，酶活力回收達(dá)9090；以聚乙烯基吡啶與；以聚乙烯基吡啶與聚甲基丙烯酸復(fù)合物包埋同一酶，當(dāng)加酶量為每聚甲基丙烯酸復(fù)合物包埋同一酶，當(dāng)加酶量為每1 1克復(fù)合物克復(fù)合物8.40mg8.40mg和和16.8mg16.8mg時(shí)，酶活力回收分別可達(dá)時(shí)，酶活力回收分別可達(dá)8787和和9494。姜。姜涌明

20、等涌明等(1993(1993年年) )用殼聚糖作載體，戊二醛作交聯(lián)劑，分別用殼聚糖作載體，戊二醛作交聯(lián)劑，分別對(duì)木瓜蛋白酶、對(duì)木瓜蛋白酶、AS1.398AS1.398中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行固定化，在最佳條件下，固定化酶的活力回收率分別進(jìn)行固定化，在最佳條件下，固定化酶的活力回收率分別為為4747、7474、5050和和5555。 底物專(zhuān)一性變化底物專(zhuān)一性變化 對(duì)于作用于大分子底物的酶，當(dāng)其固定于水不溶性載體之對(duì)于作用于大分子底物的酶，當(dāng)其固定于水不溶性載體之后，往往由于空間障礙，而使酶對(duì)分子量大的底物的催化后，往往由于空間障礙，而使酶對(duì)分子量大的底物的

21、催化活性大大下降。例如，糖化酶用活性大大下降。例如，糖化酶用CM一纖維素經(jīng)化學(xué)法共一纖維素經(jīng)化學(xué)法共價(jià)固定化后，對(duì)分子量為價(jià)固定化后，對(duì)分子量為8000的直鏈淀粉的催化活性下降的直鏈淀粉的催化活性下降23，而對(duì)分子量為，而對(duì)分子量為500000的直鏈淀粉的催化活性下降的直鏈淀粉的催化活性下降85一一87。 反應(yīng)的最適反應(yīng)的最適pH值變化值變化許多實(shí)驗(yàn)證明，酶固定化后的反應(yīng)最適許多實(shí)驗(yàn)證明，酶固定化后的反應(yīng)最適pH值會(huì)發(fā)生不同程值會(huì)發(fā)生不同程度的變化。例如，天冬氨酸酶固定于疏水載體度的變化。例如，天冬氨酸酶固定于疏水載體N烷基瓊脂烷基瓊脂糖珠之后，酶的最適反應(yīng)糖珠之后，酶的最適反應(yīng)pH與液酶相比

22、，向堿性區(qū)移動(dòng)了與液酶相比，向堿性區(qū)移動(dòng)了04個(gè)個(gè)pH單位，（為單位，（為pH89馬林等，馬林等，1991)。 胰蛋白酶用胰蛋白酶用戊二醛固定于脫乙酰殼聚糖載體后，最適戊二醛固定于脫乙酰殼聚糖載體后，最適pH范圍加寬，由范圍加寬，由液相酶的液相酶的pH8.0變?yōu)樽優(yōu)閜H7.09.0(隋德新等，隋德新等，1991)。另外也。另外也有實(shí)驗(yàn)證明固定化酶最適有實(shí)驗(yàn)證明固定化酶最適pH移向酸側(cè)的。移向酸側(cè)的。 反應(yīng)最適溫度的變化反應(yīng)最適溫度的變化固定化酶的最適反應(yīng)溫度，在很多情況下是高于游離酶的。固定化酶的最適反應(yīng)溫度，在很多情況下是高于游離酶的。同上實(shí)驗(yàn)的固定化天冬氨酸酶最適反應(yīng)溫度提高了同上實(shí)驗(yàn)的固

23、定化天冬氨酸酶最適反應(yīng)溫度提高了5，為為50；胰蛋白酶也提高了；胰蛋白酶也提高了5，為，為60，而且即使在，而且即使在70仍有較高的活性。用仍有較高的活性。用CM纖維素疊氮衍生物固定化的纖維素疊氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度則比游離酶高胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度則比游離酶高515。也有固定化酶的最適溫度不變的，例如殼聚糖固定化胃蛋也有固定化酶的最適溫度不變的，例如殼聚糖固定化胃蛋白酶。白酶。CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)3. 固定化的酶催化條件固定化的酶催化條件 米氏常數(shù)變化米氏常數(shù)變化 酶被固定化后，米氏常數(shù)的變化前已推導(dǎo)，下表所列固酶被固定化后，米氏常數(shù)的變化前已

24、推導(dǎo)，下表所列固定化酶的定化酶的Km值與游離酶的值與游離酶的Km值之比值：值之比值：酶載 體固定化方法底 物Km/ Km無(wú)花果酶肌酸激酶天冬酰胺酶木瓜蛋白酶 CM-纖維素CM-纖維素尼龍火棉膠 肽鍵結(jié)合法 肽鍵結(jié)合法微囊吸附 苯甲酰精氨酸乙酯ATP、肌酸Asn苯甲酰精氨 0.9 101021.8 一般來(lái)說(shuō)，酶在固定化以后，一般都表現(xiàn)為一般來(lái)說(shuō)，酶在固定化以后，一般都表現(xiàn)為Km值增值增大，即大，即Km/Km大于大于l。 CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)3. 固定化的酶催化條件固定化的酶催化條件 最大反應(yīng)速度的變化最大反應(yīng)速度的變化固定化酶的最大反應(yīng)速度固定化酶的最大反應(yīng)速度( (V Vm

25、)m)與游離酶的與游離酶的VmVm值大值大多基本相同，多基本相同，事實(shí)上，對(duì)于最大反應(yīng)速度的比較是很難進(jìn)行的，事實(shí)上，對(duì)于最大反應(yīng)速度的比較是很難進(jìn)行的，因?yàn)橐驗(yàn)閂mVm與反應(yīng)體系中的加酶量有關(guān)，單純與反應(yīng)體系中的加酶量有關(guān)，單純VmVm的比較，的比較，也難以說(shuō)明什么問(wèn)題，最客觀的比較參數(shù)應(yīng)該是也難以說(shuō)明什么問(wèn)題，最客觀的比較參數(shù)應(yīng)該是KcatKcat但到目前筆者尚未收到有關(guān)研究資料報(bào)道。但到目前筆者尚未收到有關(guān)研究資料報(bào)道。CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)4. 固定化酶的穩(wěn)定性固定化酶的穩(wěn)定性 固定化酶的熱穩(wěn)定性固定化酶的熱穩(wěn)定性大多數(shù)酶經(jīng)固定化以后，熱穩(wěn)定性提高。大多數(shù)酶經(jīng)固定化以

26、后，熱穩(wěn)定性提高。例如，乳酸脫氫酶、脲酶、氨基酰化酶、胰蛋白酶等，例如，乳酸脫氫酶、脲酶、氨基?；?、胰蛋白酶等，固定化后，熱穩(wěn)定性都比游離酶高；固定化后，熱穩(wěn)定性都比游離酶高；也有固定化之后耐熱性反而下降的例子。也有固定化之后耐熱性反而下降的例子。DEAEDEAE纖維素離子交換吸附的轉(zhuǎn)化酶，纖維素離子交換吸附的轉(zhuǎn)化酶，4040加熱加熱3030分鐘，分鐘，其剩余活力為其剩余活力為4 4，而游離酶，在相同條件下其活力為，而游離酶，在相同條件下其活力為100100。 固定化酶對(duì)化學(xué)試劑的穩(wěn)定性固定化酶對(duì)化學(xué)試劑的穩(wěn)定性大多數(shù)情況下，酶固定化之后，增強(qiáng)了對(duì)化學(xué)試劑的耐受大多數(shù)情況下，酶固定化之后，增

27、強(qiáng)了對(duì)化學(xué)試劑的耐受力。例如氨基酰化酶，用力。例如氨基?；?，用DEAEDEAE葡聚糖交換吸附法制成固葡聚糖交換吸附法制成固定化酶后，在定化酶后，在6 6molmolL Ll l尿素、尿素、2 2molmolL Ll l中，保存活力分中，保存活力分別為別為146146和和117117；而游離酶在相應(yīng)條件下，保存活力僅；而游離酶在相應(yīng)條件下，保存活力僅9 9和和4949。CMCCMC偶聯(lián)的胰蛋白酶，在偶聯(lián)的胰蛋白酶，在3 3molmolL Ll l 脲中的保脲中的保存活力為存活力為120120，游離酶只，游離酶只6060。尿素、鹽酸脲這樣的蛋。尿素、鹽酸脲這樣的蛋白質(zhì)變性劑，不僅沒(méi)有損失固定化酶

28、的活性，反而提高酶白質(zhì)變性劑，不僅沒(méi)有損失固定化酶的活性，反而提高酶活性的現(xiàn)象，據(jù)認(rèn)為可能與酶的柔順性增加有關(guān)。個(gè)別酶活性的現(xiàn)象，據(jù)認(rèn)為可能與酶的柔順性增加有關(guān)。個(gè)別酶如葡萄糖淀粉酶，固定化以后，對(duì)某些抑制劑更為敏感。如葡萄糖淀粉酶，固定化以后，對(duì)某些抑制劑更為敏感。 固定化酶對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性固定化酶對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性一般來(lái)說(shuō)，酶固定化以后，增強(qiáng)了對(duì)蛋白一般來(lái)說(shuō)，酶固定化以后，增強(qiáng)了對(duì)蛋白酶的抵抗力。例如用尼龍或聚服膜包埋，酶的抵抗力。例如用尼龍或聚服膜包埋，或用聚丙烯酰胺包埋的天冬酰胺酶，對(duì)蛋或用聚丙烯酰胺包埋的天冬酰胺酶，對(duì)蛋白酶極為穩(wěn)定，而游離酶在同樣條件下，白酶極為穩(wěn)定，而游離酶在同樣條

29、件下，幾乎全部失活。據(jù)認(rèn)為，這可能與固定化幾乎全部失活。據(jù)認(rèn)為，這可能與固定化酶的載體不允許大分子酶蛋白透過(guò)有關(guān)。酶的載體不允許大分子酶蛋白透過(guò)有關(guān)。 固定化酶的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性固定化酶的操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性大多數(shù)酶固定化以后，操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性都明顯提大多數(shù)酶固定化以后，操作穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性都明顯提高。這對(duì)工業(yè)生產(chǎn)是很重要的有利性質(zhì)。例如三酯酸纖維高。這對(duì)工業(yè)生產(chǎn)是很重要的有利性質(zhì)。例如三酯酸纖維素包埋的轉(zhuǎn)化酶，在素包埋的轉(zhuǎn)化酶，在2525操作操作530530日，活力僅喪失一半。日，活力僅喪失一半。重氮化結(jié)合于多孔玻璃的葡萄糖異構(gòu)酶，重氮化結(jié)合于多孔玻璃的葡萄糖異構(gòu)酶，6060

30、下的半壽期下的半壽期為為1414天。一般說(shuō)來(lái)，操作穩(wěn)定性要有一個(gè)月以上的半壽期，天。一般說(shuō)來(lái)，操作穩(wěn)定性要有一個(gè)月以上的半壽期，才有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。才有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 貯藏穩(wěn)定性下降的例子也存在。游離核酸酶貯藏穩(wěn)定性下降的例子也存在。游離核酸酶44下保下保存一周，活力不減；而共價(jià)固定化酶存一周，活力不減；而共價(jià)固定化酶( (載體苯乙烯馬來(lái)酐載體苯乙烯馬來(lái)酐) )則喪失則喪失5050的活力。的活力。CH5-2 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)5. 固定化酶穩(wěn)定性的途徑固定化酶穩(wěn)定性的途徑探討固定化過(guò)程增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的機(jī)制，從中尋求提高探討固定化過(guò)程增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的機(jī)制，從中尋求提高固定化酶穩(wěn)定性途徑，是值

31、得重視的課題，不少研究固定化酶穩(wěn)定性途徑，是值得重視的課題，不少研究者已在這方面作了有益探索。初步歸納有以下幾點(diǎn)者已在這方面作了有益探索。初步歸納有以下幾點(diǎn)。 用化學(xué)修飾增加與載體相反的電荷用化學(xué)修飾增加與載體相反的電荷 例如用乙酰酐例如用乙酰酐和琥珀酰酐作為酶的酰化劑，酶經(jīng)?；笈c陰離子交和琥珀酰酐作為酶的?；瘎?，酶經(jīng)酰化后與陰離子交換劑換劑DEAE纖維素結(jié)合。如此制備的固定化葡萄糖纖維素結(jié)合。如此制備的固定化葡萄糖淀粉酶，淀粉酶，55糖化可溶性淀粉，經(jīng)糖化可溶性淀粉，經(jīng)7.5小時(shí)，酶活力保小時(shí)，酶活力保留留71，而未經(jīng)?；墓潭ɑ福槐Ａ?，而未經(jīng)酰化的固定化酶，只保留17的活力。的活力。

32、 固定化酶與底物形成復(fù)合物固定化酶與底物形成復(fù)合物 研究固定化多核苷酸研究固定化多核苷酸磷酸化酶微環(huán)境對(duì)酶穩(wěn)定性的作用時(shí)，證明固定化酶磷酸化酶微環(huán)境對(duì)酶穩(wěn)定性的作用時(shí)，證明固定化酶與其反應(yīng)產(chǎn)物大分子核酸形成的復(fù)合物，對(duì)酶的穩(wěn)定與其反應(yīng)產(chǎn)物大分子核酸形成的復(fù)合物，對(duì)酶的穩(wěn)定性起很大的作用。性起很大的作用。 在實(shí)際工作中，經(jīng)常在固定化處理時(shí)，先將酶和在實(shí)際工作中，經(jīng)常在固定化處理時(shí)，先將酶和底物結(jié)合，以酶底物復(fù)合物的形式進(jìn)行，獲得的固底物結(jié)合，以酶底物復(fù)合物的形式進(jìn)行，獲得的固定化酶的收率和穩(wěn)定性都有明顯改善。定化酶的收率和穩(wěn)定性都有明顯改善。 添加隋性蛋白質(zhì)添加隋性蛋白質(zhì) 研究固定化葡萄糖氧化酶

33、的穩(wěn)定研究固定化葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性指出，在固定化過(guò)程中，以性指出，在固定化過(guò)程中，以1 1：10(10(酶：酶：HbHb) )的比例添的比例添加血紅蛋白，提高酶活性效果最為明顯，這可能是惰加血紅蛋白，提高酶活性效果最為明顯，這可能是惰性蛋白質(zhì)提供了對(duì)酶更為有利的微環(huán)境之故。性蛋白質(zhì)提供了對(duì)酶更為有利的微環(huán)境之故。 增強(qiáng)載體凝膠多孔性和結(jié)構(gòu)有序性增強(qiáng)載體凝膠多孔性和結(jié)構(gòu)有序性 研究卡拉膠的研究卡拉膠的結(jié)構(gòu)與其包埋的異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)含硫結(jié)構(gòu)與其包埋的異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)含硫酸根多的卡拉膠，具有較好的孔隙性和結(jié)構(gòu)上的有序酸根多的卡拉膠，具有較好的孔隙性和結(jié)構(gòu)上的有序性。而這種有

34、序性與酶對(duì)底物的親和力呈正相關(guān)。在性。而這種有序性與酶對(duì)底物的親和力呈正相關(guān)。在制備固定化酶時(shí)，添加氨基葡萄糖，可提高膠的結(jié)構(gòu)制備固定化酶時(shí)，添加氨基葡萄糖，可提高膠的結(jié)構(gòu)有序性，同時(shí)得到了理想的酶穩(wěn)定性。有序性，同時(shí)得到了理想的酶穩(wěn)定性。 同時(shí)固定化能消除產(chǎn)物抑制的酶同時(shí)固定化能消除產(chǎn)物抑制的酶 葡萄糖氧化酶氧葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖的產(chǎn)物之一為化葡萄糖的產(chǎn)物之一為H202，易使該酶鈍化，若同時(shí)，易使該酶鈍化，若同時(shí)固定化葡萄糖氧化酶固定化葡萄糖氧化酶(GOD)和過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化氫酶(Cat)，當(dāng)，當(dāng)CatGOD為為27時(shí)，固定化雙酶，使葡萄糖氧化酶半壽期時(shí)，固定化雙酶，使葡萄糖氧化酶半壽期

35、延長(zhǎng)了延長(zhǎng)了12倍。倍。25連續(xù)使用連續(xù)使用36小時(shí)活力不變，半壽期小時(shí)活力不變，半壽期達(dá)達(dá)1155小時(shí)小時(shí)(約：，約：，48天天)。 CH5-3固定化酶反應(yīng)器固定化酶反應(yīng)器1 1. .固定化酶反應(yīng)器類(lèi)型固定化酶反應(yīng)器類(lèi)型 酶反應(yīng)器是以酶作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備。性酶反應(yīng)器是以酶作為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需的設(shè)備。性能優(yōu)良的反應(yīng)器，可大大提高生產(chǎn)效率。能優(yōu)良的反應(yīng)器，可大大提高生產(chǎn)效率。酶反應(yīng)器的形式很多，根據(jù)進(jìn)料和出料方式，可概括酶反應(yīng)器的形式很多，根據(jù)進(jìn)料和出料方式，可概括為兩種類(lèi)型：為兩種類(lèi)型：分批攪拌式反應(yīng)器分批攪拌式反應(yīng)器(BR)(BR)與連續(xù)流式反應(yīng)器與連續(xù)流式反應(yīng)器( (CFR)C

36、FR)。后者又有兩種基本形式：連續(xù)流攪拌桶后者又有兩種基本形式：連續(xù)流攪拌桶( (罐罐) )反應(yīng)器反應(yīng)器(CST)(CST)、復(fù)合攪拌反應(yīng)器（、復(fù)合攪拌反應(yīng)器（CSRCSR）、填充床反應(yīng)器）、填充床反應(yīng)器(PR) (PR) 和流化床反應(yīng)器（和流化床反應(yīng)器（FBRFBR）。）。CH5-3固定化酶反應(yīng)器固定化酶反應(yīng)器 1 1. .固定化酶反應(yīng)器類(lèi)型固定化酶反應(yīng)器類(lèi)型 CH5-3固定化酶反應(yīng)器固定化酶反應(yīng)器 1 1. .固定化酶反應(yīng)器類(lèi)型固定化酶反應(yīng)器類(lèi)型 分批攪拌反應(yīng)器分批攪拌反應(yīng)器 這類(lèi)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需特殊裝置，適于小規(guī)這類(lèi)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不需特殊裝置，適于小規(guī)模試驗(yàn)。目前我國(guó)酶反應(yīng)器主要用

37、這種形式的反應(yīng)器。模試驗(yàn)。目前我國(guó)酶反應(yīng)器主要用這種形式的反應(yīng)器。用溶液酶或粗酶制劑催化時(shí)，酶一般不回收，待反應(yīng)用溶液酶或粗酶制劑催化時(shí)，酶一般不回收，待反應(yīng)轉(zhuǎn)化為一定程度后，直接加熱或用其它方法使酶失效轉(zhuǎn)化為一定程度后，直接加熱或用其它方法使酶失效除去。這種反應(yīng)器在工業(yè)生產(chǎn)中，很少采用固定化酶，除去。這種反應(yīng)器在工業(yè)生產(chǎn)中，很少采用固定化酶，因?yàn)樵诜磸?fù)過(guò)濾或離心回收過(guò)程中，容易造成酶失效因?yàn)樵诜磸?fù)過(guò)濾或離心回收過(guò)程中，容易造成酶失效損失。損失。 填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器 這是當(dāng)前采用最多的一種反應(yīng)器形式。這是當(dāng)前采用最多的一種反應(yīng)器形式。床內(nèi)通常用顆粒狀或片狀固定化酶填充，也可平行地填充床內(nèi)通常用顆粒狀或片狀固定化酶填充，也可平行地填充各向異性的半透性中空纖維；或者作成管狀，內(nèi)部填充酶各向異性的半透性中空纖維；或者作成管狀，內(nèi)部填充酶膜、酶片等。運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，底物按照一定方向以恒定流速通過(guò)膜、酶片等。運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，底物按照一定方