動物醫(yī)學畢業(yè)論文鵝血清及卵黃中IgG的測定

1、河南農業(yè)職業(yè)學院論文題目：鵝血清及卵黃中igg的測定學生姓名：xx學號：專業(yè)年級：xxll-52013年4月 22日鵝血清及卵黃中igg的測定學生：xx專業(yè)：畜禽生產教育2004級指導教師：xx摘要：免疫球蛋白g (immunoglobul ing,簡稱igg)指具有抗體活性的動物蛋白。在禽類，母代可以通過卵子將自身的免疫球蛋白傳遞給子代，對子代起到保護作用2°。 本試驗應用elisa對102枚吉林白鵝種蛋進行檢測，檢測項目為鵝胚發(fā)育過程卵黃中igg 和鵝胚血清中igg的含量。結果表明，鵝胚血清中和卵黃中igg含量是，14.5日齡為 0. 1717ug/ml 和 3967.62ug/

2、ml, 34. 5 日齡(出殼 3. 5 天)日齡為 1495. 6413 u g/ml 和 2821.363 ug/mlo關鍵詞：鵝；免疫球蛋白g;elisa1 前言卵黃抗體即卵黃免疫球蛋白就是卵黃中的y卵黃球蛋白，由于其蛋白質的物理化 學性質、免疫學性質等方面與哺乳動物免疫球蛋白存在一定差異12，所以在免疫學領 域把由禽卵黃中獲得的抗體稱為卵黃免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk，簡稱igy)3。 igy的用途是非常廣泛、多樣的，其中最重要的功能是由母體傳遞igy給新生兒提供被動 地免疫保護力。igy普遍存在于鳥類、爬行動物和兩棲類，在功能上等價于哺乳動物igg, 但其

3、許多生物學性質仍未被發(fā)現。免疫球蛋白(immunoglobulin, ig)是指免疫系統(tǒng)受抗原刺激后,b細胞轉化為漿細胞 而產生的具有抗體活性，能與相應的抗原發(fā)生特異性結合的球蛋白，或指化學結構與抗 體相似的球蛋白。它廣泛存在于機體的血清、體液及粘膜分泌液中，是構成機體體液免 疫的主要物質，免疫球蛋白分為igg、iga、igm、igd和ige45。禽類已確證的免疫球蛋 白有三種：即igg (tgy)、tgm和tgal6。其中igg是最主要的免疫球蛋白，約占動物血漿 丙種球蛋白的70%,分子量約15萬，含糖23%。igg具有提高免疫力、增強機體抵抗力 等作用。目前國內尚沒有定量檢測鵝igg的相關

4、報道。本文應用酶聯接免疫吸附劑測定 法（enzyme-linkcd immunosorbnent assay,簡稱elisa）對鵝血清及卵黃中的igg含量進 行了測定，現將結果報告如下。2材料與方法2. 1試驗材料2.1.1試驗動物吉林白鵝種蛋購于吉林省某種鵝場2.1.2主要試劑磷酸氫二鈉分析純北京化工廠磷酸二氫鈉分析純北京化工廠牛白蛋白（生化試劑）分析純上海新興生物有限公司氯化鈉分析純北京化工廠飽和硫酸氨sephadex一g2oo分析純北京鼎國生物有限公司辣根過氧化物酶分析純北京鼎國生物有限公司鵝igg、鼠抗鵝igg抗體、兔抗鵝igg酶標抗體為本實驗室自制2.1.3儀器與設備恒溫箱、電子天平

5、；40孔聚苯乙烯酶標反應板；xyj80-1臺式離心機；ld4-2a 低速離心機；北京醫(yī)用離心機廠；磁力攪拌器（78 1型磁力加熱攪拌器）分光光度計 751c型；酶聯免疫檢測儀dg3022型；孵化器；冰箱；酸度計phs_3c ; elisa板。2.2實驗方法2.2. 1鵝血清igg的提取取健康吉林白鵝的混合血清20ml，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（nh.,） 2s0,飽和溶 液10ml，使成為20% （風）2s04溶液，充分混合后，靜置30min; 3000rpm離心20min,棄 沉淀；在上清液中再加（nh.,） 2s04飽和溶液30ml，使成50% （nh,） 2s0,溶液，充分混合，

6、靜置30 min；離心20 min,棄去上清；于沉淀中加入20 ml生理鹽水，使之溶解，再加 （nh,） 2s04飽和溶液10 ml，使成33% （nh4） 2s04溶液,充分混合后，靜置30 min; 3000 叩01離心20 11棄去上清，以除去白蛋白，重復3次；用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入 透析袋；透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4°c透析24h，中間換液數次， 直至完全除去so,或nh/離心去沉淀；離心去沉淀（去除雜質蛋白）上清液即為粗提的 igg；將g2。凝膠活化、浮選、裝柱，以o.olmol/l ph 7.4 pbs液洗脫、平衡。并向其中加入上一步中所提取

7、的粗提的igg樣本，以pbs液洗脫，收集第二蛋白洗脫峰，濃縮即為 精提igg。2.2.2鵝血清及卵黃參考陰性與參考陽性的選擇及制備2.2.2. 1鵝血清參考陰性的制備取吉林白鵝血清5份充分混合（4ml/份），取此混合液20ml,加生理鹽水20ml，充 分混合，逐滴加入35%飽和硫酸銨，邊加邊攪拌，混合均勻后靜置30分鐘，然后3000 轉/分鐘離心20分鐘，棄去沉淀，上清裝入透析袋，常水流水透析12小時，然后生理 鹽水透析24小時，其間換液數次。最后將提取液濃縮至原體積，重復3次。分裝凍存 于一20°c冰箱。2. 2. 2. 2鵝血清參考陽性的制備取吉林白鵝血清5分，混合（該血清取自制

8、備參考陰性血清的吉林白鵝），分裝凍 存于一 20°c冰箱。2. 2.2.3鵝卵黃參考陰性的制備無菌取卵黃5份，充分混合，取此混合液20ml,蒸餾水10倍稀釋，用稀酸調節(jié)至 ph5.2, 8 000轉/分鐘離心。蒸餾水稀釋沉淀至卵黃原體積，將卵黃、生理鹽水、氯仿 按1:2:2混合，混勻后置室溫2h, 2 000克離心力離心20min，分成三相，油相、水相、 固相，棄去水相，然后將油相與固相充分混合，室溫下揮發(fā)掉氯仿，蒸餾水稀釋至原體 積。蒸餾水稀釋7倍，分裝凍存與-20°c冰箱中8。2. 2. 2. 4鵝卵黃參考陽性的制備無菌取卵黃5份，充分混合，蒸餾水7倍稀釋（該卵黃取自制

9、備參考陰性卵黃的種 蛋），分裝凍存于一20°c冰箱中。2.2.3雙抗體夾心elisa試驗各反應條件的確定2.2.3. 1包被抗體工作濃度確定用0. 01mol/l ph9. 5的碳酸鹽緩沖液將小鼠抗鵝igg稀釋成5pg/ml、10pg/ml、 20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、60pg/ml、70pg/ml、80pg/ml分別包被酶標反 應板，對鵝血清100倍稀釋進行eltsa檢測。2. 2. 3. 2被檢鵝血清的最佳稀釋倍數的確定按包被抗原的工作濃度將抗原稀釋，包被酶標板，然后將混合鵝血清，分別用0.1°/。牛血清白蛋白的pbst液作40、5

10、0、60、70、80、90、100、200、400倍稀釋，每個稀釋度加五孔，進行elisa檢測并計算出每個稀釋度的平均0d值(490nm)o選擇0d值最接近 于1時被檢鵝血清的稀釋倍數作為被檢鵝血清的最佳稀釋倍數。2. 2. 3. 3待檢鵝卵黃最佳稀釋倍數的確定按包被抗原的工作濃度將抗原稀釋，包被酶標板，然后將混合鵝卵黃，分別用0.1% 牛血清白蛋白的pbst液作4、8、10、16、20、32、64、100倍稀釋，每個稀釋度加五孔， 進行el1sa檢測并計算出每個稀釋度的平均0d值(490nm)o選擇0d值最接近于1時被檢鵝 卵黃的稀釋倍數作為被檢鵝血清的最佳稀釋倍數。2. 2. 3. 4按包

11、被抗原的工作濃度將抗原稀釋，包被酶標板，然后分別將五份卵黃混合，分別用0.1%牛血清白蛋白 的pbst液作1、2、4、8、10、16、20、32、64、100倍稀釋，每個稀釋度加五孔，進行 el1sa檢測并計算出每個稀釋度的平均0d值(490nm)o選擇0d值最接近于1時被檢鵝卵黃 的稀釋倍數作為被檢卵黃的最佳稀釋倍數。2. 2. 3. 5最適抗原包被時間的確定分別將小鼠抗鵝tgg包被后于37qc 3h、4qc過夜、37°c 3h后4°c過夜，進行測定， 觀察結果。2. 2. 3. 6最適抗原抗體反應時間的確定將抗原抗體分別作用37°c 60min、90 min、

12、120min,進行測定。2. 2. 3. 7最適酶標抗體作用時間的確定酶標抗體作用時間分別為37°c 60min、90 min、120min,進行測定。2. 2. 3. 8最適底物作用時間的確定底物反應時間分別為37°c15min、30min、45min,進行測定，觀察結果。2.2.4陽性判定值的確定elisa檢測方法在結果判斷上是定性測定，對受檢標本分別用“陽性”、“陰性”表 示。根據國家流行病學調查要求，陽性0d值應為陰性4倍。2.2.5 elisa檢測方法的檢驗2.2.5. 1敏感性試驗將5份成年鵝血清的混合液以0.1%牛血清白蛋白的pbst液作50、60、70、80

13、、 90、100、200、400倍稀釋，按照已建立的elisa進行檢測，測定0d值，確定鵝血清的 敏感反應滴度。2. 2. 5. 2重復性試驗選取數份鵝血清及鵝卵黃，按建立的el1sa進行五次檢測，測定其0d值變化，觀 察結果。2. 2. 5. 3特異性試驗以小鼠抗鵝血清包被反應板，成年鵝血清20份，與未用鵝tgg免疫的小鼠血清包被 反應板對比，檢測其od值。3結果3.1鵝igg及其抗體制備結果鵝igg經飽和硫酸銨法粗提后，進行sophadc)x-g200層析，所獲得的收集液體，用751 分光光度計計算蛋白含量，根據所得的0d值(280nm)繪制曲線如下圖所示：sephodex-g200 純化

14、鵝 igg1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41管號圖 1 sephodex-g200 純化鵝 i ggfig 1. purification of gooses igg with sephodexg200 經scphadcxg200純化鵝igg所獲得的曲線圖可知，第一峰和第二峰出現的間隔很小，所以在收集洗脫液時，只從第二峰左側收集蛋白0d值大于0.25的洗脫液至第二峰右 側0d值大于0.2的洗脫液。然后將此收集液濃縮，并計算蛋白含量9*1()。用751分光光度計測得0d2s。和0d26。值并按下式計算蛋白濃度，蛋白濃

15、度 (mg/ml) = (0d28。x 1. 45-0d26。x 0. 74) x稀釋倍數。計算鵝igg蛋白蛋白含量為 10.7318mg/mlo3.2雙抗體夾心elisa檢測方法的建立3.2.1被檢鵝血清參考陽性與鵝卵黃參考陰性的最佳稀釋倍數的確定表4被檢血清的最佳稀釋倍數的確定 table 4 determination of serum dilution孔號12345678稀釋倍數481016203264100血清平均0d值1.311.261.271.261.241. 161. 100.98血清參考陰性平均0d值0.310. 290.290.280. 240. 240.210. 19由以

16、上表可知，將血清100倍稀釋時，其0d值最接近1.0,參考陰性為0.19,符合p/n>4,因此，在檢測時將血清100倍稀釋。3.2.2被檢鵝卵黃參考陽性與鵝卵黃參考陰性的最佳稀釋倍數的確定表5被檢卵黃的最佳稀釋倍數的確定table 5 determination of yolk dilution孔號12345678稀釋倍數481016203264100卵黃平均0d值1.21.091.060. 10. 970. 730.670.44卵黃參考陰性平均0d值0. 360.310.250. 240.210. 150. 120.09由以上表可知，將卵黃進行20倍稀釋時，其0d值最接近1.0,參考陰

17、性為0.21，符 合p/n4，因此，在檢測時將卵黃20倍稀釋。3.2.3最適底物作用時間的確定表6最適底物作用時間table 6 results of various incubated time of substrate孔號123處理方法20 min30 min45 min平均0d值0.831.021.22底物反應時間分別為37 °c15min、30 min、45 min,進行測定后，試驗結果表明，當底物的作用時間30 min時，初孚l的0d值為1。因此將底物作用時間確定為30 min。3.2.4 igg敏感性試驗結果在血清中，當已知含量的鵝tgg稀釋至0.0683594 pg/m

18、l時，0d值不再有變化。 表7血清敏感性試驗結果table 7 results of sensitivity experiment for serum平均 od 值0.760.680.620.450.410.40.390.230.20.21在血清中，當已知含量的鵝igg稀釋至0.0341767 pg/ml時，0d值不再有變化，即該檢測方法檢測的靈敏度為0. 0341767 u g/ml。表8卵黃敏感性試驗結果 table 8 results of sensitivity experiment for egg yolkigg含量(u g/ml)70605040302010510.5平均od值0.

19、 37010. 340.330. 2950.280.260.250.230.2350.23在卵黃中，當已知含量的卵黃稀釋至5ug/ml時，od值不再有變化，即該方法的靈 敏性為5 u g/ml。3.2.5重復性試驗結果取參照igg進行elisa檢測，3次不同時間的結果基本一致，說明本研究建立的雙抗 體夾心elisa方法具有相對較好的穩(wěn)定性和重復性。3.2.6包被特異性試驗結果將正常小鼠血清1:100倍稀釋，免疫過鵝tgg的小鼠血清按1:100倍稀釋，進行比 較，結果表明正常小鼠血清與免疫的小鼠血清0d值差異顯著。表9包被抗體特異性實驗結果 table 9 results of coating

20、antibody specificity test孔號小鼠血清免疫鵝igg的小鼠血清稀釋倍數1： 1001: 100平均01)值0. 130. 983.3蛋白標準含量曲線檢測結果3.3.1雙抗體夾心elisa 0d值與卵黃igg含量的標準曲線雙抗體夾心elisa od值與卵黃igg含量通過做閣看出它們之間成冪函數關系，故 求得回歸方程為y= 145.421n(x) +214.77表10雙抗體夾心elisa od值與鵝卵黃igg含fttable 10 double antibody sandwich elisa od and content of igg in egg yolk11()0.485

21、900.425600.0.345()().334()0.2953()0.28200.261()0.2550.2310.235().50.23鵝卵貨tgg含s標準曲線160140120100806040y = 145.42ln(x) + 214.77r2 = 0. 9976200系列1 一對數（系列1）0.20.40.6od伉(490nm)0.8圖2雙抗體夾心elisa od值與鵝卵黃igg含3fig.2 double antibody sandwich elisa od and content of igg in egg yolk3.3.2雙抗體夾心el isa od值與血清i gg含量的標準

22、曲線雙抗體夾心elisa od值與血清igg含量通過做圖看出它們之間成冪函數關系，故求得回歸方程為y=23.865x5 6726表丨丨雙抗體夾心elisa od值與血淸igg含景70table 11 double antibody sandwich elisa od and content of igg in serum1.1717.50.988.750.824.3750.742.18750.681.093750.560.5468750.480.27343750.490.06835940.36血清含雖t小準曲線(tu/sn)蜘舡川|招0.511.50d值(490)系列1乘冪（系列1）y = 2

23、3. 865x5 6726r2 = 0. 9908180160140120100806040200閣3雙抗體夾心elisa od值與igg含雖fig.3 double antibody sandwich elisa od and content of igg3.4鵝血清中igg含量與鵝卵黃中igg含量變化的比較表14 14.5天和34.5天鵝胚血清中igg含fi與鵝卵黃igg含量的比較table 14 comparison of igg in serum and egg yolk (有錯誤)日齡卵黃igg含it (ug/ml) 血清igg含i (ug/ml)14.5d3967.62+23.86

24、640.1717±3.362e-0234.5d2821.363+41.50721495.6413+80.91864400035003000250020001500100050003967.620. 17172821.3631495-641鵝血清中tgg含量與鵝卵黃中tgg含量變化的比較由圖4可見，鵝胚血清中igg抗體從14. 5日齡0.1717 ug/ml升高到34.5日齡(出 殼3. 5天)1495. 6413 u g/ml，差異顯著(p<0. 05)；鵝卵黃中igg抗體從14. 5日齡3967.62 u g/ml到34. 5日齡(出殼后3d)降至2821. 363 u g/

25、ml,差異顯著(p<0. 05)。整個階段鵝 血清中igg抗體含量總體呈現上升的趨勢；而鵝卵黃igg抗體含量總體呈現下降的趨勢; 但是血清中抗體含量濃度的最高值(1495. 6413 u g/ml)也未超過卵黃抗體濃度的最低值 (2821. 363 p g/ml)，卵黃中抗體濃度遠高于血清中抗體濃度。4討論4.1雙抗體夾心elisa法近二十幾年來，免疫學分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標記了的抗原和抗體的分 析技術以后，使原來許多經典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年 代的免疫熒光(ifa)和60年代的放射免疫(ria)分析技術之后，1971年engvall和 perlma

26、nn 發(fā)表了 酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay, elisa) 用于igg定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發(fā)展成液體 標本中微量物質的測定方法，建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術。它是繼免疫熒 光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術，是一種用酶標記抗原或抗體的方 法。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數分鐘內可以催化幾十幾百個鹿物分子 發(fā)生反應，產生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數分鐘后就可被識 別出來。elisa試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。將抗原、抗體 免疫

27、反應的特異性和酶的高效催化作用原理有機地結合起來，可敏感地檢測體液中微量 的特異性抗體或抗原。此項技術自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，由于其試劑穩(wěn) 定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學 的許多領域。4.2鵝血清抗體及卵黃抗體變化在卵黃抗體與血清抗體的比較結果中，可以發(fā)現卵黃抗體與血清抗體的消長規(guī)律在 濃度上并不對應。似乎卵黃抗體濃度并未減少，而且血清中抗體含量濃度的最高值也未 超過卵黃抗體濃度的最低值，但是總體上趨于上升的趨勢。這一現象試驗者有如下解釋: 第一，雖然卵黃抗體的濃度變化不大，但是卵黃抗體的體積卻發(fā)生了很大的變化，在14.5 日齡以后變化

28、較明顯，而在34. 5日齡以后卵黃抗體的體積為0,據此，雖然卵黃抗體的 含量無明顯變化，但是，由于體積的改變，卵黃抗體(總量上)也在被動的向鵝胚血清 轉移；第二，試驗者認為卵黃抗體在整個孵化過程中，除了被動轉移給鵝胚血清外，還 有其他功能，如提供能量、提供形成組織的原料等，因此，鵝胚血清中的抗體在總量上 也少于卵黃中的抗體總量，也成了血清中抗體濃度小于卵黃中抗體濃度的可能原因之o5結論5.1鵝血清中和鵝卵黃中igg含量鵝胚血清中igg抗體從14.5日齡0. 1717ug/nil升高到34.5日齡(出殼3.5天) 1495. 6413 ug/ml，差異顯著(p<0. 05)；鵝卵黃中 ig

29、g 抗體從 14. 5 曰齡 3967.62 u g/ml 到34.5日齡(出殼后3d)降至2821.363 /11±，差異顯著(？<0.05)。目前在國內尚未見 到有關測定鵝igg含量的相關報道。5.2鵝血清中和鵝卵黃中igg含量變化趨勢從14. 5日齡和34. 5日齡(出殼3. 5天)檢測結果可知：鵝胚血清中igg抗體含量總體呈現上升的趨勢(0. 1717 u g/ml-1495. 6413 u g/ml)；而鵝卵黃igg抗體含量總體 呈現下降的趦勢(3967.62 ug/ml 2821.363 ug/ml);但是血清中抗體含量濃度的最高值 (1495. 6413 u g/

30、ml)也未超過卵黃抗體濃度的最低值(2821. 363 p g/ml)，可見，卵黃中抗 體濃度遠高于血清中抗體濃度。參考文獻1 陳雪嵐，許楊，熊勇華.中國大耳白兔與羅曼母雞對赭曲霉素a抗原免疫應答性的研 究jl衛(wèi)生研究,2003,1.2 jensenius j c,andersen i，hau j,et al. eggs: conveniently packaged antibodies. mehtods for purification of yolk iggj. jimmunol methods, 1981,46(1)： 63 6831rose，m.e.orlans，e.immunoglo

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