瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)方法

1、瘤胃體外發(fā)酵方法絞股藍(lán)皂甙對(duì)山羊瘤胃菌群及微生物發(fā)酵特性和甲烷產(chǎn)量的影響_王新峰1.2瘤胃液的采集和培養(yǎng)基制備瘤胃液來自4頭裝有永久性瘤胃屢管的波爾山羊與本地山羊的雜交成年公山羊,日糧以羊草為主,每日補(bǔ)飼1509精料(精料組成,玉米:豆粕=2:1),自由飲用清潔水。于晨飼前采集瘤胃液,用4層紗布過濾,與培養(yǎng)基按1:2混合,在39培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘,并充分通入CO2,進(jìn)行厭氧分裝,每瓶60mL。每升培養(yǎng)基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6

2、H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g鹽酸半肌胺(Menke等,1979)1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)根據(jù)絞股藍(lán)皂試添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分為5組,對(duì)照組不加皂試,實(shí)驗(yàn)組分別加入5,10,20和40mg皂試。取60mL瘤胃液與培養(yǎng)基混合液(瘤胃液:培養(yǎng)基二1:2)分裝于160mL的發(fā)酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗飼料組成(3:7),精料為玉米和

3、豆粕,分別為0.126和0.054g,粗飼料為0.42g羊草草粉(過1mm篩)。發(fā)酵瓶封蓋!氣壓平衡后置于39培養(yǎng)箱中培養(yǎng),并定時(shí)搖勻,培養(yǎng)24h。第二次發(fā)酵培養(yǎng)120h,分別在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 計(jì)算出累積產(chǎn)氣量;測(cè)定120h后干物質(zhì)消失率。1.4指標(biāo)測(cè)定1.4.1產(chǎn)氣量的測(cè)定根據(jù)Theodorou等(1994)的方法,使用氣壓轉(zhuǎn)換器(IGER,UK)定時(shí)測(cè)定厭氧瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)氣量。根據(jù)各產(chǎn)氣量和氣壓進(jìn)行校正,除去空白發(fā)酵瓶產(chǎn)氣量,計(jì)算出累積產(chǎn)氣量。4.3揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定取發(fā)酵液樣品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(內(nèi)標(biāo)法,100mL溶液中含巴

4、豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20冰箱保存。測(cè)定前解凍,12,000rpm離心lomin,取上清液0.6uL測(cè)定。優(yōu)化胡偉蓮方法測(cè)定VFA(胡偉蓮,2005),柱溫130,進(jìn)樣器溫度為180,檢測(cè)器溫度為180)。高純氮總流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氫氣流量40mL/min,空氣流量4O0mL/min。4.4氨態(tài)氮濃度測(cè)定將樣品與0.2N鹽酸等體積混合,于-20保存。測(cè)定前解凍,于4條件下,10,000rpm離心l0min,取上清液采用比色法進(jìn)行測(cè)定分析(weatherburn,1967)"4.5微生物蛋白濃度測(cè)定取瘤胃內(nèi)容物7ml保存在-20冰箱&q

5、uot;測(cè)定前解凍,取3ml混勻樣品在1,000rpm/min,離心8分鐘去除原蟲和飼料殘?jiān)?。?ml上清液在25,000Xg離心20分鐘(Makkar等,1982)。取10ul上清液加入到5ml考馬斯亮藍(lán)溶液中,在595nm波長(zhǎng)下讀取吸光度值,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算樣品微生物蛋白含量。1.4.6原蟲計(jì)數(shù)將混勻發(fā)酵液4層紗布過濾后與9%甲醛等比例混合避光保存,用改裝的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。改裝后計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室高度為0.25mm,以確保較大體積原蟲也能被計(jì)數(shù)(Newbold等,1987。4.7氫的還原力根據(jù)Demeyer(1991)揮發(fā)性脂肪酸和CH4產(chǎn)量計(jì)算,計(jì)算公式:2Hr(%)=(4M+2

6、P+2B)*100/(1A+P+4B)其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C執(zhí)(以上均為凈摩爾產(chǎn)量)。對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵參數(shù)的影響1材料與方法1.1試驗(yàn)動(dòng)物、日糧組成與試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)動(dòng)物為4只1歲左右、體重在30士2.3kg波爾山羊與本地山羊雜交的一歲閹公羊采用4x4拉丁方設(shè)計(jì),日糧組成為70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代謝能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纖維,22.33%)。每期為16天,適應(yīng)期H天,采樣時(shí)間為5天,共4期。兩次于8:00和17:00點(diǎn)等量瘤胃灌注。對(duì)照組以與試驗(yàn)組相同體積生理鹽水灌注,自由飲用清潔水。2樣品采集與分析飼料采食量分別在每期的1

7、1-13天測(cè)定。記錄每日飼料添加量和剩余料量,以干物質(zhì)為基礎(chǔ)計(jì)算采食量"飼喂后第14天,分別在采食前0h和采食后2,4和8h利用負(fù)壓通過瘤胃痰管采集瘤胃內(nèi)容物,用四層紗布過濾去除大的飼料殘?jiān)?迅速測(cè)定瘤胃內(nèi)容物的pH值,將過濾后瘤胃液分成4份。取上述過濾的瘤胃液一份,將瘤胃液與25%偏磷酸溶液按5:1比例進(jìn)行混合-20冷凍保存,以備vFA測(cè)定(Jouany,1982),其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸(內(nèi)標(biāo)測(cè)定vFA)(Cottyn和Boucque,1968).冷凍瘤胃液解凍后于12,ooo×g/min在4條件下離心l0min,取上清液0.6u上氣相測(cè)定v

8、FA含量。氣相色譜儀(島津,GC-14B,日本)具有氫離子火焰檢測(cè)器,毛細(xì)柱為No.34292-07B,30m×0.32rnm×0.25四膜(Supelco,美國(guó))。汽化室溫度為180,柱溫135,檢測(cè)室溫度180，高純氮總流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氫氣流量40mL/ min,空氣流量400mL/ min。根據(jù)Demeyer(1991)的方程計(jì)算CH4產(chǎn)量和氫利用率。方程如下:瘤胃可發(fā)酵有機(jī)物(FOM)gmol-1 vFA=162(0.5A+0.5P+B) vCH4產(chǎn)量(Lkg-1FOM)=(1.8A一l.1P+l.61B)×l000

9、15;22.4(4×v)2Hr(%)=(4M+2P+2B)×100/(2A+P+4B),其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。.以上均為凈摩爾數(shù)。第二份取4ml瘤胃液樣品加入等量的0.2mol/L的鹽酸-20冷凍,用比色法測(cè)定氨態(tài)氮濃度,波長(zhǎng)為625nm。樣品解凍后在4條件下15,000×g離心15min,上清液用來測(cè)定氨態(tài)氮濃度(Chaney,1962)"第三份取7ml樣品-20保存用于微生物蛋白的測(cè)定"室溫解凍,取3ml混勻樣品,1,000r/min離心8min除去原蟲和飼料殘?jiān)?取上清液2ml在25,000×g離心20m

10、in,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氫氧化鈉溶液,100煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml考馬斯亮藍(lán)溶液中,在595nm條件下比色讀取吸光度值。以結(jié)晶牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品微生物蛋白含量。對(duì)原蟲、產(chǎn)甲烷菌及細(xì)菌區(qū)系的影響1材料與方法1.1動(dòng)物、試驗(yàn)設(shè)計(jì)及采樣同本章第一節(jié)。1.2用于原蟲PCR/DGGE分析的樣品保存及引物比較比較-20冷凍保存和液氮保存PCR/DGGE的樣品效果及兩對(duì)常用瘤胃原蟲PCR/ DGGE 引物的篩選.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤胃內(nèi)容物的收集隨機(jī)選取4只(A、B、C和D)裝有永久性瘤胃瘩管的波爾山羊與本地山羊雜交后代,自由采食全粗料。實(shí)驗(yàn)

11、期間分別于飼喂前0h和飼喂后1、2、4和8h從山羊瘤胃采集瘤胃內(nèi)容物,4層紗布過濾,迅速投入液氮和-20保存以備瘤胃微生物基因組DNA的提取。1.2.2瘤胃內(nèi)容物總DNA的提取參照Zoetendal等(1998)方法,將液氮和-20保存樣品室溫解凍,取解凍后混勻的瘤胃內(nèi)容物樣品1.smL,珠磨法機(jī)械破碎內(nèi)容物后,用酚和氯仿/異戊醇提取瘤胃內(nèi)容物總DNA。1.2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)以瘤胃內(nèi)容物總DNA為模板,兩對(duì)原蟲特異性引物進(jìn)行比較,對(duì)原蟲的185rRNA進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增擴(kuò)增"引物序列見表2-2。1.3山羊瘤胃微生物基因組DNA提取本章第一節(jié)所采集瘤胃液樣品迅速保存在液氮中以備基因組

12、DNA提?。―NA提取效果優(yōu)于冷凍,見原蟲DGGE方法優(yōu)化部分)(Zoetendal等,1998)。所提取基因組DNA用于原蟲、細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌區(qū)系及微生物的定量分析。1.4瘤胃微生物的DGGE引物表2-2試驗(yàn)中使用的PCR引物Table 2-2 The primers used in the experiment使用特異的原蟲、細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌DGGE引物(表2-2)擴(kuò)增原蟲18srDNA、細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌16srDNA。使用Bio-Rad Dcode系統(tǒng)進(jìn)行DGGE電泳,8%的丙烯酸胺溶液制成30-50%的梯度凝膠對(duì)原蟲區(qū)系分析,8%的丙烯酞胺溶液制成38-53%的梯度凝膠對(duì)細(xì)菌區(qū)系分析,6%的

13、丙烯酞胺溶液制成30-70%的梯度凝膠對(duì)產(chǎn)甲烷菌區(qū)系分析。先200V預(yù)電泳10min,然后85V電泳16h。對(duì)DGGE膠進(jìn)行銀染(Muyzer,1993)。DGGE膠上主要的和特異的條帶用潔凈的刀片和槍頭切下移入。1.5ml離心管中,37或室溫過夜再進(jìn)行PCR擴(kuò)增,純化PCR產(chǎn)物后測(cè)序,在GenBank上比對(duì)尋找最相似菌。對(duì)山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響1材料與方法1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)本章第一節(jié)山羊在體試驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)的DNA樣品進(jìn)行分析研究,以山羊瘤胃總細(xì)菌為參照,對(duì)瘤胃中methanogens,fungi,R.flavefaciens和F.succinogenes的相對(duì)數(shù)量進(jìn)行定量分析。1.2儀器設(shè)備!

14、試劑與耗材實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI7300,美國(guó))如圖2-12。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用SYBR Green染料法,熒光染料預(yù)混試劑為SYBR Green Realtime PCR master Mix with ROX(TOYOBO,Japan)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在八聯(lián)管上進(jìn)行(Axgen,USA)表2-4 定量PCR引物Table 2-4 PCR Primers for qPCR assay1.3原蟲計(jì)數(shù)取瘤胃液與等量9%的甲醛溶液混合,于4保存用于原蟲計(jì)數(shù)。樣品需進(jìn)一步稀釋以便于計(jì)數(shù),原蟲總數(shù)和五種原蟲在顯微鏡下計(jì)數(shù)(Newbold,1987)。為保證所有個(gè)體大小不同原蟲都能被準(zhǔn)確計(jì)數(shù),

15、對(duì)計(jì)數(shù)板進(jìn)行了改裝,使計(jì)數(shù)室高度增加為0.25mm。1.4定量PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增條件使用上述DNA樣品對(duì)瘤胃微生物進(jìn)行了定量分析(如總菌,真菌,產(chǎn)甲烷菌,黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌),以上微生物的特異性引物見表2-4(Denman等,2006)。使用熒光染料SYBR Green進(jìn)行標(biāo)記,使用瘤胃微生物特異性引物,對(duì)微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)定量PCR的循環(huán)數(shù)對(duì)微生物進(jìn)行相對(duì)定量分析(ABI 7300,USA)(Denman等,2006;Chen等,2008)。使用ABI 7300 SDS version 2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,根據(jù)方程2-ct計(jì)算瘤胃產(chǎn)甲烷菌、真菌、黃化瘤胃球菌和產(chǎn)唬

16、泊酸絲狀桿菌相對(duì)于總菌的數(shù)量變化(Livak等,2001;Chen等,2008)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為20ul,反應(yīng)體系組成見表2-5。反應(yīng)體系的配制在無菌超凈臺(tái)上進(jìn)行,使用2ml滅菌的PCR管先配制反應(yīng)體系母液。而后使用清潔的移液器將母液分裝到八聯(lián)管中,每孔巧川,再加入己稀釋5倍的DNA模板,設(shè)三個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)定量PCR的擴(kuò)增條件見圖2-13:(l)95,10秒;(2)95,30秒;60,1分鐘;共40個(gè)循環(huán);(3)熔解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,溫度以l/30s的速度從60上升到95。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的熔解曲線見圖2-14。熔解曲線分析發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線具有明顯的尖峰。產(chǎn)甲烷菌的熔

17、解曲線有雙峰存在(圖2-14A),因?yàn)楫a(chǎn)甲烷菌有產(chǎn)甲烷桿菌和產(chǎn)甲烷球菌存在,使熔解曲線出現(xiàn)雙峰,兩個(gè)熔解曲線出現(xiàn)在84.5和88.8。產(chǎn)玻拍酸絲狀桿菌(圖2-14B)、黃化瘤胃球菌(圖2-14C)和瘤胃真菌(圖2-14D)的熔解曲線為單峰,且位置單一,熔鏈溫度分別出現(xiàn)在87.8、84.5和81.0附近,說明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高,不存在引物二聚體與非特異性擴(kuò)增。米曲霉培養(yǎng)物與蛋氨酸羥基類似物對(duì)奶牛瘤胃發(fā)酵和泌乳性能的影響_孫華米曲霉培養(yǎng)物與蛋氧酸經(jīng)基類似物對(duì)不同粗料底物瘤胃產(chǎn)氣及發(fā)酵特性的影響1材料與方法1.1試驗(yàn)材料米曲霉培養(yǎng)物(AOC)由BioZyme公司提供,產(chǎn)品名為Amaferm, A

18、maferm為黃色固體,含有的成分包括(DM為基礎(chǔ)):DM為93.5%,CP為19.5%,NDF為52.4%, ADF為16.1%,灰分為7.8%,粗脂肪為3%;蛋氨酸經(jīng)基類似物(HMB)為固態(tài)形式的蛋氧酸經(jīng)基類似物錢鹽,由NOVUS公司(諾偉司國(guó)際有限公司)提供,產(chǎn)品名為MFP, DM含量為99%,CP占85%,含有84%的蛋氛酸。1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)體外試驗(yàn)底物的精粗比為50:50,其中精料為玉米,粗料分別為羊草(CWR)、苜蓿 (AH)、青貯玉米(CS)和玉米梧(CST)之一,其營(yíng)養(yǎng)成分組成見表2-1。每一培養(yǎng)底物均按照2×3因子設(shè)計(jì)分配試驗(yàn)處理,生產(chǎn)中AOC每頭牛每天的添加量為5-

19、l0g,而HMB的添加量為25g,瘤胃體積按照50L計(jì)算,因此對(duì)應(yīng)30 mL的痛胃培養(yǎng)液,因此體外分別添加AOC (0、3、6 mg)和HMB (0、15 mg),每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)。1.3瘤胃液供體動(dòng)物及飼養(yǎng)4頭裝有永久性瘤胃瘦管的奶牛(泌禮天數(shù)為213土6. 5)作為瘤胃液供體動(dòng)物,詞囑日糧精粗比為55:45,詞料配方見表2-2,日詞囑3次,自由飲水。1.4產(chǎn)氣試驗(yàn)程序采用Menke和Steigass ( 1988)的Syringe系統(tǒng)(100 mL注射器),進(jìn)行人工瘤胃體外產(chǎn)氣試驗(yàn),如圖2-1所示。人工唾液的配制按Menke和Steingass等(1988)方法進(jìn)行,配方如下:在520.

20、2 mL蒸餾水中依次加入208.1 mL緩沖落液(B)、208.1 mL常量元素溶液(C)、0.1 mL微量元素溶液(A)、l.0mL刃天青指示劑_ (D),62.4mL還原刻溶液(E),通入CO:厭氧使其飽和,直至溶液由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色。每個(gè)體外裝置中底物添加量為200mgDM (精粗比為50:50,精料為玉米,粗料分別為羊草、苜著、青貯玉米和玉米秸之一),同時(shí)分別設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照組(不添加底物、AOC和HMB)和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)羊草組。試驗(yàn)當(dāng)天在奶牛晨飼前抽取3只瘺管牛的瘤胃液,4層紗布過濾到提前預(yù)熱的收集瓶中,于39°C水浴中保溫,并同時(shí)通入CO2保持厭氧狀態(tài),待用。人工唾液按Menk

21、e方法(1988)配置,將人工唾液與瘤胃液按照2: 1的體積比例混合均勻,然后用三通管準(zhǔn)確吸取CO2飽和的瘤胃混合培養(yǎng)液30 mL移入每個(gè)培養(yǎng)管中,搖晃培養(yǎng)管使底物和瘤胃液混合后,排出氣泡,加上夾子,讀數(shù),然后將其置于39°C的水浴搖床中進(jìn)行體外發(fā)酵培養(yǎng)。在同樣條件下重復(fù)上述體外產(chǎn)氣試驗(yàn)1次,兩次標(biāo)準(zhǔn)羊草產(chǎn)氣量相對(duì)偏差小于10%即可,若相差太大,應(yīng)考慮重做。培養(yǎng)的3、6、9、12和24h記錄產(chǎn)氣管的刻度讀數(shù)(讀數(shù)時(shí)輕搖產(chǎn)氣管,旋動(dòng)管塞后讀數(shù),以管塞刻度的中部為準(zhǔn))。1.5測(cè)定指標(biāo)及方法讀取培養(yǎng)管的刻度,以計(jì)算產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣速率和有機(jī)物消化率。培養(yǎng)24 h終止后,立即測(cè)定發(fā)酵

22、液pH;取體外發(fā)酵瘤胃液上清液1 mL,加入0.2 ml 8.2%偏碟酸,4°C保存測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的濃度;取瘤胃混合液,采用比色法測(cè)定氨態(tài)氮(NH3-N)濃度、嚷呤法測(cè)定微生物蛋白(MCP)產(chǎn)量。1.5.1產(chǎn)氣量GPt=200× (Vt-Vo) /W式中,GPt為樣品在t時(shí)刻的產(chǎn)氣量(mL); Vt為樣品發(fā)酵th后,培養(yǎng)管刻度讀數(shù);Vg為樣品在開始培養(yǎng)時(shí),培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的刻度讀數(shù);W為樣品干物質(zhì)重量(mg)。1.5.2產(chǎn)氣參數(shù)利用 fit curve 軟件(MLP; Lawes Agricultural Trust, 1991 ),根據(jù)Orskov和McDonald

23、(1979)的產(chǎn)氣模型公式將各樣品在3、6、9、12、24h時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量代入,計(jì)算消化動(dòng)力參數(shù)。模型公式為:GP = a + b (l-exp-ct),其中GP是t時(shí)間的產(chǎn)氣量,a為快速產(chǎn)氣部分,b為緩慢產(chǎn)氣部分,C為b的產(chǎn)氣速度常數(shù),a+b為潛在產(chǎn)氣量。1.5.3體外有機(jī)物消化率(IVOMD)根據(jù)Menke和Steingass (1988)提出的公式計(jì)算體外有機(jī)物消化率,IVOMD (%) = 0.986GP + 0.0606CP + 11.03 其中 GP 為 24 h 產(chǎn)氣量(mL/200mg), CP 為粗蛋白含量(g/kg)。1.5.4 pH 值使用S40 Mutimin型pH計(jì)測(cè)

24、定樣品pH值。1.5.5揮發(fā)性脂肪酸取混合好的瘤胃液樣品,于4、20 000g離心l0min,取離心后的上清液加入專用的氣相小瓶,用氣象色譜儀測(cè)定瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的含量。測(cè)定條件:柱溫180,氣化室溫度200,檢測(cè)室溫度220 ,載氣使用高純氮?dú)?總壓力90kpa,總流量37.2mL/min,柱流量0.67mL/min,線速度23.4cm/sec,分流比50,吹掃流量3mL/min,循環(huán)流量8mL/min,氧氣流量 40mL/min,空氣流量 400mL/min。1.5.6氛態(tài)氣濃度采用比色法測(cè)定瘤胃液樣品的氨態(tài)氮濃度(胡偉蓮,2005),并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)男薷?。?

25、.2M鹽酸溶解0.382g氯化銨,定容至l00mL,作為保存液,4°C保存。用蒸餾水將l0mL保存液稀釋定容至l00mL,為工作液,含氮量l0mg/l00mL。取工作液0、1、2、4、6rnL分別置于50mL容量瓶?jī)?nèi),依次加入蒸餾水10、9、8、6、4mL,再用0.2M鹽酸定容。成為每l00mL含氮量0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.lmL分置于2mL離心管內(nèi),各管中依次加入亞硝基鐵氰化納水楊酸納溶液0.5mL和次氯酸納氫氧化納溶液0.5mL,搖勻、靜置l0min后,用Eppendorf槍吸取200ul混合液用SpectraMax M5酶標(biāo)儀比色

26、。波長(zhǎng)700nm,用不含氮的0號(hào)管液作空白對(duì)照。記錄各吸光值。用吸光值作自變量,溶液含氮量作從變量導(dǎo)出回歸方程式。樣品測(cè)定:取ImL瘤胃液在4000rpm離心l0min,量取0.lmL上清液和0.5mL蒸飽水置于5mL離心管內(nèi),再加入2.4mL 0.2M鹽酸,稀釋上清液30倍,搖勻。比色操作同。把測(cè)得的吸光值代入回歸方程式,計(jì)算樣品中的氨氮含量。1.5.7微生物蛋白產(chǎn)量采用噪呤法測(cè)定微生物蛋白產(chǎn)量(胡偉蓮,2005)。A.酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別稱取5、15、25、35、45和55mg酵母RNA于l0mL離心管中,加入 2mL0.6MHC104, 95°C水浴 1h,冷卻。分別

27、加入6mL28.5mM的NH4H2PO4溶液,95°C水浴15min,冷卻后在3000g, 4°C條件下離心l0min。取0.8mL上清夜,向上清夜中加入3mL0.2M的NH4H2PO4溶液,并用12.5ul的85%磷酸調(diào)整溶液pH至2-3。取調(diào)整pH值后的溶液3.8mL,向其中加入0.2mL0.4M的AgNO3溶液,混合后于4避光過夜。過夜后于3000g,4條件下離心l0min,棄上清液;用4.5mLpH=2的蒸德水沖洗沉淀;再于3000g,4條件下離心l0min,棄上清液。向沉淀中加入5mL0.5M的HC1溶液,混勻,95°C水浴30min后,以3000g離心

28、1 0min ;上清液用0.5MHC1稀釋40倍后,以0.5M HC1溶液作參比,在260nm下用DU800分光光度計(jì)比色,根據(jù)光密度值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.樣品微生物蛋白濃度的測(cè)定。取8mL瘤胃液于3個(gè)l0mL離心管中,在20000g,4條件下離心20min;棄上清液后加入2.104niL0.6MHC104,于95°C水浴1h,冷卻。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟-操作。以0.5M HC1溶液作參比,在260nm下比色,根據(jù)光密度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出RNA測(cè)定值。根據(jù)以下公式計(jì)算微生物蛋白氮產(chǎn)量:微生物蛋白氮(mg/mL) =RNA測(cè)定值(mg/mL) ×RNA含気量/細(xì)菌氮中RNA含氣

29、量×稀釋倍數(shù)其中,RNA含氮量為17.83%,細(xì)菌氮中RNA含氮量為10%。微生物蛋白(MCP,mg/mL)=微生物蛋白氮(mg/mL)× 6.25米曲霉培養(yǎng)物與蛋氨酸幾基類似物對(duì)不同粗料底物瘤胃微生物及其酶活的影響1材料與方法1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)材料為本章第一節(jié)體外培養(yǎng)24 h后終止發(fā)酵的混合培養(yǎng)物。1.2測(cè)定項(xiàng)目及方法1.2.1微生物酶活1.2.1.1 試劑(1 ) 0.2mol/L碟酸緩沖溶液(pH=6)a,稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H20)71.64g,用蒸飽水溶解,并定容至1 000ml; b.稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H20)

30、31.21g,用蒸餾水溶解,并定容至1 000ml。取a液123ml,加b液877ml混合均勻,配制成1000ml 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液,用pH計(jì)校正至pH為6.0備用。(2)0.5%羧甲基纖維素納(CMC) (Sigma-C9481)溶液0.5g的CMC懸浮于80ml緩沖液中,且在微熱(60度)和攬拌的情況下,直至完全溶解,最終用緩沖液定容至l00ml。(3)0.5%微晶纖維素(Sigma-MKBB4236)準(zhǔn)確稱取0. 5g微晶纖維素加至100ml緩沖液中,60水浴攬拌溶解后,4°C保存?zhèn)溆谩?4)0.5%木聚糖(Sigma-X4252)加熱攬拌器上加熱大約60ml緩沖

31、液到60度;慢慢加入0.5g木聚糖,加熱煮沸同時(shí)攬拌,不斷攪拌下過夜冷卻,添加蒸飽水定容至100ml。(5)0.5%可溶淀粉(Sigma-S4126)稱取0.5g淀粉,用水調(diào)成漿狀物,在拔動(dòng)下緩緩加入70ml緩沖液中,然后,以30ml緩沖液分幾次沖洗裝淀粉的燒杯,洗液并入其中,加熱至完全透明,冷卻,定容至l00ml。此溶液需要當(dāng)天配制。(6)3,5-二銷基水楊酸(DNS)試劑稱取DNS3.15g,加水500ml,拔拌5s,水浴至45°C,然后逐步加入100ml氫氧化納溶液,同時(shí)不斷攬拌,直到溶液清澈透明(注意:在加入氫氧化鈉過程中,溶液溫度不要超過48°C)。再逐步加入四水

32、酒石酸鉀納91.0g、苯酸2.50g和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45°C水浴加熱,同時(shí)補(bǔ)充加水300ml,不斷攬拌,直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱,冷卻至室溫后,用水定容至1 000ml。用燒結(jié)玻璃功率器過濾,取濾液,於存在棕色瓶中,避光保存。室溫下存放7d后可以使用,有效期為6個(gè)月(張順英,2007)。(7)葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取1g無水葡萄糖(105°C),用緩沖液溶解并定容至l00ml,4°C避光保存3天內(nèi)使用,或在-20°C長(zhǎng)期保存。1.2.2.2測(cè)定步驟(1)葡萄糖(Sigma-G6152)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將葡萄糖原液(l0mg/ml)配制成

33、0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 和 0.7mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取24個(gè)2ml的離心管,其中21支試驗(yàn)管3支空白對(duì)照管,編號(hào)后依次加入0.4ml對(duì)應(yīng)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,向各管中加入0.2rnl磷酸緩沖液,然后各管加入0.8rnlDNS溶液,搖勻后沸水浴5min,取出后用流水沖洗冷卻,540nm波長(zhǎng)下比色,以空白為基礎(chǔ),以凈吸光度為橫坐標(biāo),葡萄糖量(mg)為縱坐標(biāo),制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程。(2)木糖(Sigma-X3877)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作,只是將葡萄糖換成木糖。(3)瘤胃液的處理將瘤胃液在冰上進(jìn)行超聲波處理(Giri等,2005),得到的樣品進(jìn)行離

34、心,28000xg, 4°C, 20min,澄清上清液作為粗酶液用于瘤胃液各種酵活的測(cè)定,采用DNS法進(jìn)行羧甲基纖維素酶(CarboxyHMBhyl celluse,CMCase)、木聚糖酶、a-淀粉酶活性的測(cè)定(孫宏遠(yuǎn),2006)。(4)羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定取4個(gè)2ml離心管編號(hào),一支空白管,三支樣品管;分別向4支離心管中準(zhǔn)確加入0.4ml0.5%羧甲基纖維素鈉底物溶液,同時(shí)放入39水浴中預(yù)熱5分鐘,空白管暫時(shí)不加酶液,其余樣品管加入0.2ml稀釋的酶液;將4支離心管同時(shí)放入39°C水浴恒溫培養(yǎng)30min(精確),培養(yǎng)結(jié)束后迅速取出,立即加入0.8mLDNS溶液終止反

35、應(yīng),再在空白管中加入0.2mL酶液,加塞搖勻后在沸水浴中煮沸5min,取出后用循環(huán)水冷卻5min至室溫,以空白管為對(duì)照,在分光光度計(jì)540nrn波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。(5)微晶纖維素酶活性的測(cè)定同羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定,只是將底物換成0.5%微晶纖維素溶液。(6)木聚糖酶活性的測(cè)定同羧曱基纖維素酶活性的測(cè)定,只是將底物換成0.5%木聚糖溶液。(7)淀粉酶活性的測(cè)定同羧甲基纖維素酶活性的測(cè)定,只是將底物換成0.5%淀粉溶液。1.2.2.3酶活力單位定義:每分鐘每毫升瘤胃液釋放還原糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。羧甲基纖維素酶和淀粉酶對(duì)應(yīng)的是還原糖為葡萄糖,木聚糖酶對(duì)應(yīng)的還原糖為木糖。計(jì)算公式:酶活性(IU

36、) = (C×l000×D) / (V×T×M)C:由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的葡萄糖(或木糖)濃度mg;D:酶液的稀釋倍數(shù);V:加入的原酶液體積(0.2mL);T:反應(yīng)時(shí)間;M:葡萄糖或木糖的分子量。1.2.3微生物定量方法1.2.3.1 DNA的提取及濃度檢測(cè)參照 Yu 等(2004)的 Repeat Bead Beating Plus Column (RBB+C)法提取DNA;(1)取 1.5mL 瘤胃混合液至 beadbeater 管中,16000g, l0min, 4,棄上清。加入 ImL 裂解液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl, pH

37、8.0, 50 mM EDTA, 和4%SDS (十六烷基硫酸鈉)和0.4 g滅菌的銀粉(0.1 mm的0.3 g和0.5 mm的 0.1 g);(2)用Mini-Beadbeate (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA)最大振幅,勻質(zhì)化3min; (3)70°C 15min,每隔5min輕輕顛倒搖晃管子;(4)16000g,室溫離心5min,取上清轉(zhuǎn)移至2mL離心管中;(5)往beadbeater管中再次加入0.3mL裂解液,重復(fù)步驟2-4,將2次的上清液混合;(6)往每管上清液中加入0.26mL10M的醋酸銨,顛倒數(shù)次混合均勻,冰浴 5

38、min;(7)16000g, 4 離心 l0min;(8)將上清轉(zhuǎn)移到2個(gè)1.5mL的離心管中,再加入等體積異丙醇,混合均勻,冰浴30min;(9)16000g, 4°C離心15min,小心倒掉上清,加入0.7mL的70%的乙醇,16000g, 4°C離心l0min,棄乙醇,風(fēng)干沉波(不要太干,乙醇揮發(fā)完即可)。(10)然后每管加入50?lOOnLTE 緩沖液(lOmMTris-HCl, ImMEDTA,pH8.0)溶解DNA,再將2管合并。(11)加入2uL 的 RNase (lOmg/mL), 37,15min;（12)加入7uL的蛋白酶K和200uL的AL緩沖液(th

39、e QIAamp DNA Stool Mini Kit),混合均勾,70°C, l0min;(13)加入200uL的乙醇并混合均勻,再轉(zhuǎn)移至QIAamp柱子中,16000g,離心1min;(14)棄流動(dòng)相,加入500uL的AW1緩沖液(Qiagen),室溫離心Imin;(15)棄流動(dòng)相,加入500uL的AW2緩沖液(Qiagen),室溫離心Imin;(16)將柱子于室溫下離心Imin,使柱子晾干;(17)加入l00uL的緩沖液AE(Qiagen)(可先65°C預(yù)熱,以加大DNA洗脫效率),室溫下放置2min;(18)取一新1.5mL離心管,放于每個(gè)柱子下,室溫離心1min。

40、(19)將DNA分裝至4個(gè)管中,-20°C保存,用Nanodrop測(cè)定提取的DNA濃度及260/280nm OD比值。1.2.3.2 PCR引物設(shè)計(jì)參照 Tajima 等(2001 )報(bào)道的S. ruminantium 的引物,Denman 和 McSweeney(2006)報(bào)道的瘤胃總菌、真菌、flavefaciem、F. succinogenes 的引物,Denman等(2007)報(bào)道的原蟲引物和Koike和Kobayashi (2006)報(bào)道的R.albus引物,引物序列見表2-7,由上海英俊公司合成。表2-7實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 2-7 PCR primers f

41、or real-time quantitative PCR assayTarget Species Forward Primer sequenceTotal bacterial F CGGCAACGAGCGCAACCCR CCATTGTAGCACGTGTGTAGCCFungi 1 F GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCR CAAATTCACAAAGGGTAGGATGATTProtozoa2 F GCTTTCGWTGGTAGTGTATTR CTTGCCCTCYAATCGTWCTR. flavefaciensl FCGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAGGRC

42、GGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACCF. succinogenes 1 FGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAR CGCCTGCCCCTGAACTATCR. albus3 F CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCGR CCTCCTTGCGGTTAGAACAS. ruminaniium4 F TGCTAATACCGAATGTTGR TCCTGCACTCAAGAAAGA1 Cited from Denman and McSweeney (2006);2 Cited from Sylvester et al. (2004);3 Cited from Koike and

43、 Kobayashi (2001)4 Cited from Tajima et al. (2001).1.2.3.3 RT-PCR反應(yīng)體系和條件稀釋DNA模板至0.5或1 ng/iL,采用RT-PCR方法測(cè)定瘤胃原蟲、真菌、R flavefaciem和R. albus相對(duì)于瘤胃總細(xì)菌16S rDNA的量。儀器為美國(guó) ABI 公司的 7500 real-time PCR systems。以 SYBR Premix Ex TaqTM試劑建立20 反應(yīng)體系,qRT-PCR反應(yīng)體系見表2-8。按表2-8配置PCRmixture (19|_U反應(yīng)體系,先不加入模板),每孔分裝19ul混合體系加入到96孔

44、板中,再加入1ul模板,組成20ul反應(yīng)體系,每個(gè)模板的不同引物設(shè)置三個(gè)平行樣。用熱封膜將96孔板密封,將96孔板低速離心l0min,然后將96孔板置于RT-PCR儀器中,按反應(yīng)條件圖2-2的程序進(jìn)行。表2-8 qRT-PCR反應(yīng)體系Table 2-8 Reaction system of qRT-PCRn:所有樣品數(shù)。不同品質(zhì)粗飼料日糧中添加異位酸對(duì)_省略_指標(biāo)和生產(chǎn)性能的影響及其機(jī)理研究_照日格2.1.1 不同品質(zhì)單一粗飼料對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響研究2.1.1.1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與體外培養(yǎng)底物日糧試驗(yàn)選用品質(zhì)不同的四種粗飼料，并進(jìn)行體外批次培養(yǎng)試驗(yàn)。體外培養(yǎng)四種粗飼料分別為：（1）玉米青貯（G

45、I9.05MJ）；（2）苜蓿干草（GI48.71MJ）；（3）羊草（GI9.41MJ）；（4）玉米秸稈（GI1.81MJ）。試驗(yàn)共設(shè) 4 個(gè)處理組，每組設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。四種粗飼料分別取樣 0.4g（DM）進(jìn)行體外 3h、6h、9h、12h 和 24h 培養(yǎng)，以確定四種粗飼料各項(xiàng)體外發(fā)酵指標(biāo)。四種粗飼料 GI 指數(shù)計(jì)算：GI=ME（Mcal/kg）×DMI（kg/d）×CP（%DM）/NDF（或 ADL）（%DM）ME粗飼料代謝能；DMI粗飼料干物質(zhì)隨意采食量；CP粗蛋白，占干物質(zhì)百分比；NDF中性洗滌纖維，占干物質(zhì)百分比；ADL酸性洗滌木質(zhì)素，占干物質(zhì)百分比。粗飼料代謝能的

46、測(cè)定 參照張吉鹍（2004）博士論文用 CP 預(yù)測(cè) IVDMD（干物質(zhì)體外消化率）的模型，即ME = DE×0.815 = GE×IVDMD×0.815IVDMD=36.3561+1.9727CP-0.0302（CP）2（R2=0.9087，n=8，P0.0025）粗飼料干物質(zhì)采食量（DMI）預(yù)測(cè)公式：參照張吉鹍（2004）94博士論文。苜蓿 DMI（g/d· w0.75）=51.26/ NDF（%DM）羊草 DMI（g/d· w0.75）=45.00/ NDF（%DM）玉米秸稈 DMI（g/d· w0.75）=29.75/ NDF（%DM）玉米青貯 DMI（g/d· w0.75）=29.00/ NDF（%DM）2.1.1.1.4 測(cè)定指標(biāo)樣品在水浴搖床上進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)3h、6h、9h、12h和24h，分別測(cè)定氣體產(chǎn)量，采集培養(yǎng)液直接測(cè)定pH值，用雙層紗布濾去大塊飼料殘?jiān)偃V液，濾液經(jīng)4000rpm離心15min，用移液管移取上清液0.5m1置于預(yù)先裝有4.5