蛋白質(zhì)測定實驗報告

1、蛋白質(zhì)測定方法化學(xué)報告蛋白質(zhì)的檢測酚試劑法靈敏度較咼費時蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與酚類、檸檬酸、硫酸銨、20250mgCu2+螯合，形成tris 緩沖液、蛋白質(zhì)一銅復(fù)合甘氨酸、糖物，此復(fù)合物使類、甘油等均酚試劑的磷鉬酸有干擾作用還原，產(chǎn)生藍色化合物由上表可大致了解五種檢測蛋白質(zhì)的方法，下面以實驗的形式進行詳細闡述：1材料與方法1.1 儀器材料(1) 儀器：凱氏定氮儀、紫外分光光度計、可見光分光光度計、工作離心機、布氏漏斗、抽濾泵。 試劑及原材料：牛奶、酸奶、豆?jié){、0.12mol/LpH=4. 7醋酸-醋酸鈉緩沖液、乙醇-乙醚等體積混合液、濃H2SO4、40涼氧化鈉、30%S氧化氫、2%硼酸溶液

2、、0. 050molPL標準鹽酸溶液、硫酸鉀-硫酸銅接觸劑、混合指示劑、標準蛋白溶液、雙縮脲試劑、考馬斯 亮藍G- 250試劑1.2 實驗方法(1) 凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量 將待測樣品與濃硫酸共熱 ,含氮有機物即分解產(chǎn)生氨 (消化) , 氨又與硫酸作用 , 變成硫酸銨。為了加速消化,可以加入CuS04作催化劑和加入K2SO4以提高溶液的沸點，而加入 30%過氧化氫有利于消化溶液的澄清。消化好的樣品在凱氏定氮儀內(nèi)經(jīng)強堿堿化使之分解 放出氨 , 借蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中 , 然后用標準鹽酸溶液進行滴定 , 記錄, 計算出樣品 含氮量。每個樣品做三次重復(fù)測定 , 取平均值。(2) 紫外吸收法測

3、定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)分子中 , 酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵 , 使蛋白質(zhì)具有吸收紫 外光的性質(zhì)，吸收峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白 質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下 ,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值 與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系 ,可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速 , 不消耗樣品 , 測定后仍能回收使用。低濃度的鹽 , 例如,生化制備中常用的 (NH4)2SO4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定 , 特別適用于柱層析洗脫液的 快速連續(xù)檢測 ,因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化 ,而不需知道其絕對值。此法的特點是測

4、定蛋白質(zhì)含量的準確度較差 ,干擾物質(zhì)較多,在用標準曲線法測定蛋 白質(zhì)含量時,對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)有一定的誤差 ,故 該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸 等吸收紫外光的物質(zhì) , 會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表 , 再進行計算的方 法加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的 ,雖然經(jīng)過校正, 測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外,進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶 液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標準曲線的pH相一致。取待測樣品制成蛋白濃度大

5、約在0. 11. OmgPmL的蛋白質(zhì)溶液，用紫外分光光度計進行比色，對照標準曲線得出樣品 含氮量。每個樣品做 3 次重復(fù)測定 , 取平均值。(3) 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量雙縮脲(NH3CONHCONH3兩個分子脲經(jīng)180C左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基 或兩個直接連接的肽鍵 , 或能夠以一個中間碳原子相連的肽鍵 , 這類化合物都有雙縮脲反 應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比 ,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān) ,故 可用來測定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點是測定較快速 ,不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近

6、,以及干擾物質(zhì)少 ;主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速 ,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測 定。取待測樣品制成蛋白濃度大約在 11OmgPm的蛋白質(zhì)溶液，加雙縮脲試劑染色30min,用 可見光分光光度計進行比色 , 對照標準曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個樣品做 3次重復(fù)測 定, 取平均值。(4) 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量由于雙縮脲法 (Biuret 法)存在明顯的缺點和許多限制 , 因此 1976年由 Bradford 建立的考 馬斯亮藍法 (Bradford 法) , 這是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測 定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點 ,因而正在得到廣泛的應(yīng)用

7、。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?！綛radford法的突出優(yōu)點是：a. 靈敏度高。據(jù)估計,比Lowry法約高4倍,其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大得多。b. 測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5min左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2min即可完成,其顏色可以在1h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在520min之間,顏色的穩(wěn)定性最好,因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。c. 干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的L、5 沁離子、Tri

8、s緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。此法的缺點是：a. 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 ,因此Bradford法用于不同蛋白 質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用丫 -球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方 面的偏差。b. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定,主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0. 1N的NaOH （如同0. 1N的酸干擾Lowry法一樣）。c. 標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定 未知蛋白質(zhì)的濃度?！咳〈郎y樣品加入考馬斯亮藍 G- 250試劑放置5m

9、in后,用可見光分光光度計比色,對照標準曲線得出樣品蛋白質(zhì)含量。每個樣品做 3次重復(fù)測定,取平均值。2 結(jié)果與分析2.1 實驗結(jié)果表 1 樣品蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果2.2 實驗結(jié)果分析(1) 凱氏定氮法可測出全部 3種樣品的蛋白含量 ,測試結(jié)果準確 ,只是蒸餾與吸收裝置 復(fù)雜,不便于操作,實驗過程所需時間較長 ,操作復(fù)雜。(2) 紫外吸收法無法測出牛奶、酸奶的蛋白含量 , 測出的豆?jié){蛋白含量也與實際值相差 較大, 不具實際使用價值。此方法實驗過程簡單 , 適用于測試無色樣品 , 對于有色樣品需進 行預(yù)處理 , 排除顏色干擾后才適用于此方法。(3) 雙縮脲法適用于被測的 3種樣品,實驗操作簡便迅速

10、 ,但其缺點是靈敏度較低 ,蛋白質(zhì)量須在120mgPm時測定結(jié)果較準確。因此實驗前要估測被測樣品的蛋白含量，把樣 品稀釋至蛋白濃度為120mgPmJL(4) 考馬斯亮藍染色法可以測出被測的全部 3種樣品,此方法快速、靈敏 ,但只有作微量蛋白測定時的結(jié)果才準確,因此在實驗前應(yīng)將樣品稀釋至蛋白濃度為0. 1ImgPmL而且實驗必須在1h內(nèi)完成,不然測試結(jié)果不準確。5)酚試劑法原理：?蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與 Cu2螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑 的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系 作標準曲線并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。優(yōu)點：操作簡便，靈敏度

11、高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5卩g即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。缺點：費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較 差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry 反應(yīng)。而且對后者的影響還要大 得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、 tris 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃 度較低的尿素（ 0.5%），硫酸納（ 1%），硝酸納（ 1%），三氯乙酸（ 0.5%），乙醇 （5%），乙醚（ 5%），丙酮（ 0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作 校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化

12、鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸 度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍。適用范圍：適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg通常測定范圍是 20250mg個人想法蛋白質(zhì)是我們生活中不可或缺的東西，無論是各種乳制品還是一些保健產(chǎn)品，蛋白質(zhì)的含 量無疑是一個受人矚目的指標。然而，縱觀我們現(xiàn)在使用的這些蛋白質(zhì)檢測方法，很明顯的都有一個“不適合大規(guī)模 檢測”的特點，這對于現(xiàn)在的大規(guī)模生產(chǎn)模式顯然不適用。而且，更為嚴重的是，所有的 檢測方法都會受到許多其它物質(zhì)的干擾作用，之前鬧得沸沸揚揚的三鹿奶粉事件就是利用 了凱式定氮法中的檢測漏洞（檢測時檢測的是氮元素的含量，那么，一些非來自于蛋白質(zhì) 的氮就會被當(dāng)成蛋白質(zhì)中的，從而