基因工程期末復(fù)習(xí)

1、一、名詞解釋：共10題，每題2分，共20分。1. 基因: 是DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。2. 定位克隆: 獲取基因在染色體上的位置信息，然后采用各種方法對(duì)該基因進(jìn)行定位和克隆3. 融合基因: 是指應(yīng)用DNA體外重組技術(shù)構(gòu)建的一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。4. 轉(zhuǎn)化子: 導(dǎo)入外源DNA后獲得了新遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞，又稱重組體。5. 人工接頭：是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA短序列。6. RT-PCR: 是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的PCR。7

2、. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的連續(xù)的密碼子區(qū)域，是潛在的編碼區(qū)。8. MCS: 指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的DNA片段。9. gene targeting : 基因工程中利用活細(xì)胞染色體DNA可與外源DNA的同源性DNA序列發(fā)生重組的性質(zhì)，來進(jìn)行定點(diǎn)修飾改造染色體上某一目的基因的技術(shù)10. 5RACE: 是一種通過PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到5端之間未知序列的方法。 四、簡(jiǎn)答題：共4題，共20分。1簡(jiǎn)述獲得目的基因常用的幾種方法。

3、（5分）答：（1）直接從染色體DNA中分離：（1分）僅適用于原核生物、葉綠體和線粒體基因的分離，較少采用。（2）人工合成：（1分）根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。（3）從mRNA合成cDNA：（1分）采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通?？傻玫娇杀磉_(dá)的完整基因。（4）利用PCR合成：（1分）如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR

4、)技術(shù)，在體外合成目的基因。（5）從基因文庫中篩選：（1分）首先建立基因組或cDNA文庫，利用探針從文庫中篩選目的克隆。 2. 分子克隆載體應(yīng)具備哪些特點(diǎn)？（4分）答：(1) 在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（1分）(2) 必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制（1分）(3) 有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選（1分）(4) 具有較高的拷貝數(shù)，便于載體的制備（1分） 3. cDNA文庫和基因組文庫的主要差別有哪些？（5分）答：（1）基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。（2分）（2）基因

5、組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。（1分）（3）基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子，而cDNA文庫克隆的是不含內(nèi)含子的功能基因。（2分） 4. 某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I的切點(diǎn)?，F(xiàn)用Bgl I切割該載體進(jìn)行基因克隆，問：(1)轉(zhuǎn)化后涂皿時(shí)應(yīng)加什么樣的抗生素? (2)培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落具有什么樣的抗性基因型? (3)如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體? （6分）答：(1)加四環(huán)素；(2)TetrKans和TetrKanr；(3)重新點(diǎn)種

6、在含Tet、Kan和只加Tet的 平板上，選擇只在Tet平板上生長(zhǎng)的菌落，即為所需的重組體。 五分析題  10分 科學(xué)家將人的生長(zhǎng)素基因與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。過程如右圖所示，據(jù)圖回答：(1)人的基因之所以能與大腸桿菌的DNA分子進(jìn)行重組，原因是什么？                     

7、0;                   (2)過程表示的是采取什么的方法來獲取目的基因？(3)檢測(cè)大腸桿菌B是否導(dǎo)入了質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒，可采用的方法和理由？(4)如果把已經(jīng)導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的大腸桿菌，放在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生什么現(xiàn)象？分析原因？ 答:（1）人的基因與大腸桿菌DNA的組成成分相同，結(jié)構(gòu)相同 (2分)(2) 反轉(zhuǎn)錄法(逆轉(zhuǎn)錄法) (2分)(3)將得到的大腸桿菌B涂布

8、在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的，說明已導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒，反之則沒有導(dǎo)入。   因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒A和重組質(zhì)粒上都有抗氨芐青霉素基因 (2分)(4)有的能生長(zhǎng)，有的不能生長(zhǎng)   導(dǎo)入普通質(zhì)粒A的細(xì)菌能生長(zhǎng)，因?yàn)槠胀ㄙ|(zhì)粒A上有四環(huán)素抗性基因；導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌不能生長(zhǎng)，因?yàn)槟康幕蛘逶谒沫h(huán)素抗性基因中，破壞了其結(jié)構(gòu)和功能。(4分) 六、論述題：共1題，15分。1在基因工程操作過程中，使用的克隆載體需要具備哪些條件？選擇受體細(xì)胞時(shí)需要具備哪些基本原則？答：克隆載體需要具備條件：（7分）載體都能攜帶外源DNA片段(基因

9、)進(jìn)入受體細(xì)胞，或停留在細(xì)胞質(zhì)中自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上，隨著染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。(1分)載體都具有合適的篩選遺傳標(biāo)記。(1分)載體都具有供外源基因插入的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)。(1分)載體都必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以外的其他生物細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。(1分)載體本身的分子量都比較小，可容納較大的外源基因片段。(1分)載體在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)要高，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。(1分)載體在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性要高，保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。(0.5分)載體的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。(0.5分) 

10、受體細(xì)胞的選擇應(yīng)具備的基本原則：（8分）便于重組DNA分子的導(dǎo)入。(1分)便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對(duì)重組體進(jìn)行篩選。(1分)遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對(duì)培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(1分)受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。(1分)安全性高，無致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。

11、(1分)能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對(duì)其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑?，如選用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可以避免其對(duì)重組DNA分子的降解破壞作用。(1分)受體細(xì)胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性。(1分)具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制等，便于真核目的基因的高效表達(dá)。(0.5分)在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。(0.5分)    基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題基因工程緒論1、基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細(xì)胞

12、內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達(dá)繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。特征：1、具跨越天然物種屏障的能力。      2、 強(qiáng)調(diào)了確定的DNA片段在新寄主細(xì)胞中的擴(kuò)增。2、試述基因工程的主要研究?jī)?nèi)容。1）、目的基因的分離2）、DNA的體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞及其篩選4）、基因在受體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增、表達(dá)、檢測(cè)及其分析。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？主要是通過基因重組，使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、調(diào)味劑、酒類和油類等有機(jī)物的產(chǎn)率；或者改良這些有機(jī)物組成成分，提高利用價(jià)

13、值。4、轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請(qǐng)客觀談?wù)剬?duì)轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認(rèn)識(shí)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進(jìn)步和發(fā)展中起到了積極作用。首先，通過該項(xiàng)技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；第二，延長(zhǎng)食品保存時(shí)間或增加營(yíng)養(yǎng)成分；第三，將抗蟲防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲害侵襲的能力， 減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護(hù)；第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。人們對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔(dān)憂在于環(huán)境方面。外源基因的導(dǎo)入可能會(huì)造就某種強(qiáng)勢(shì)生物， 產(chǎn)生新物種或超級(jí)雜草、損害非目標(biāo)生物、破壞原有生物種群的動(dòng)態(tài)平衡和生物多樣性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問

14、題。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年， 食用轉(zhuǎn)基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉(zhuǎn)基因食品對(duì)生命造成危害的實(shí)例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經(jīng)過國(guó)家法律認(rèn)可， 食品衛(wèi)生部門和環(huán)境部門的嚴(yán)格檢測(cè)。只有測(cè)試合格了，才能投放市場(chǎng)。因此公眾完全可以安全地消費(fèi)、大膽地食用轉(zhuǎn)基因食品。 第一章    DNA的分子特性與利用1、 原核生物和真核生物的基因表達(dá)調(diào)控有何差別？1）原核基因表達(dá)調(diào)控的三個(gè)水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控原核基因表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。2）真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)：l

15、60;       1基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l        2真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行；l        3基因表達(dá)具有細(xì)胞特異性或組織特異性；l        4真核基因表達(dá)的調(diào)控在多個(gè)水平上進(jìn)行：DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)

16、加工水平的調(diào)控；2、 什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類？基因是具有生物學(xué)功能的、在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類：l       轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因:  包括結(jié)構(gòu)蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因l       轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因:   包括tRNA、rRNAl    

17、0;  不轉(zhuǎn)錄但有功能的DNA區(qū)段:   如啟動(dòng)子、操縱基因3、 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？引起核酸變性的因素：-溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效應(yīng)）, 粘度降低等，如DNA增加2540%. RNA約增加1.1%。4、 DNA復(fù)性及其影響因素。變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)：分子量越大復(fù)性越難。濃

18、度越大，復(fù)性越容易。（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴(kuò)增） 第二章    基因工程操作的基本技術(shù)1.         DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機(jī)理。    在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負(fù)極向正極泳動(dòng)，其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達(dá)到分離不同大小核酸分子的目

19、的。2.         DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響   Ø分子的大?。盒t快   Ø帶電荷數(shù)：多則快   Ø分子構(gòu)型：超螺旋>解螺旋2）電場(chǎng)：直流電場(chǎng)    Ø電壓高則快    Ø電壓太高則結(jié)果不準(zhǔn)確常用35V/CM3）支持物介質(zhì) 

20、  Ø種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠   Ø凝膠濃度: 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液   Ü pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷   Ü 離子濃度：離子濃度高_(dá) 電流大_發(fā)熱快_膠溶解   Ü種類：TAE、TBE、TPE、TNE3.         PCR的原理和主要反應(yīng)過程，并

21、分析影響PCR擴(kuò)增的影響因素。PCR原理：變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補(bǔ)的新鏈，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。影響PCR擴(kuò)增的影響因素：§(1)Taq酶：常用1U/25µL            ³濃度低，擴(kuò)增產(chǎn)物不夠；   &

22、#160;        ³濃度高，非特異性擴(kuò)增增加；            ³酶的活性；§(2)dNTP的濃度：常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，特異性、保真性；§(3)模板：主要考慮純度及使用量，對(duì)純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。使用量從幾個(gè)ng到100ng.§(4)引物濃度：0.1-0

23、.5µmol/L之間，過多則非特異擴(kuò)增增加，形成引物二聚體；§(5)Mg2 濃度：常用 0.5-2.5mmol/L；      影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性§(6)PCR反應(yīng)程序設(shè)定：變性溫度和時(shí)間、引物退火溫度Tm與時(shí)間、引物延伸溫度與時(shí)間和循環(huán)數(shù)4.         PCR引物設(shè)計(jì)的原則，若給一指定DNA序列并需要通過PCR擴(kuò)增此序列，如何設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物？（關(guān)于如何設(shè)計(jì)這個(gè)問題，靠自己了）引物設(shè)計(jì)原則：&

24、#160;         1、G C含量45-55%；          2、Tm值高于55；          3、引物特異性；          4、引物擴(kuò)增跨度；   &#

25、160;      5、是否形成引物二聚體5.         定量PCR的原理？Ct值的含義。原理：通過實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。初始模板量X0的對(duì)數(shù)值與C(T) 值之間呈線性關(guān)系：log X0= - log(1 Ex) *Ct log N            &

26、#160;  Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段時(shí)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示，圖僅供參考）  Threshold lineC(t) value     C(t) value 18.12 /-0.04  閾值線Ct值           Ct值    6.  

27、60;      分子雜交的類型主要有哪些？探針的標(biāo)記方法與標(biāo)記類型？常用的雙鏈DNA的標(biāo)記方法是哪兩種？探針的標(biāo)記方法：切口平移法、隨機(jī)引物合成法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標(biāo)記物的不同：放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。標(biāo)記類型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據(jù)標(biāo)記物的不同：可分放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針；雙鏈DNA探針標(biāo)記主要方法：切口平移法、隨機(jī)引物合成法； 7.      

28、   Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內(nèi)切酶酶切DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段；(2) 轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3) 預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點(diǎn)；(4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5) 洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標(biāo)記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性 8.   &#

29、160;     基因組文庫的構(gòu)建過程？如何確定文庫的大??？基因組文庫的構(gòu)建過程：1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；2）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為4堿基識(shí)別位點(diǎn)）進(jìn)行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片斷（根據(jù)載體的要求）；4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子導(dǎo)入宿主細(xì)胞7）文庫的鑒定、收集、保存；確定文庫大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N（即文庫大?。┲g的關(guān)系可用下式表示

30、：       N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中： N：文庫所需的總克隆數(shù)； P：任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小。9.         基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點(diǎn)？10.     一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點(diǎn)？超螺旋質(zhì)粒D

31、NA、開環(huán)質(zhì)粒DNA、線狀質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點(diǎn)是：電泳的泳動(dòng)速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA>線狀質(zhì)粒DNA>開環(huán)質(zhì)粒DNA11.     堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，分析影響試驗(yàn)結(jié)果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來構(gòu)型，而線性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實(shí)大家可以根據(jù)那天師兄說的去寫）提取失?。?）洗去雙鏈時(shí)，將質(zhì)粒DNA洗去；   &

32、#160;  2）破壁失敗，質(zhì)粒沒析出；      3）加劑問題電泳失?。?）電壓太高          2）沒加染色劑          3）膠穿孔            4）電泳時(shí)間過長(zhǎng)12.&#

33、160;    電泳緩沖液使用一定時(shí)間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動(dòng)現(xiàn)象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液；      2.把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用13.     電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：預(yù)知電泳的速率及方向；使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；一些高濃

34、度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度，可以防止DNA的擴(kuò)散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對(duì)凝膠染色；（溴化已錠EB、硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。 第三章  基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)1、 限制性核酸內(nèi)切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？（常用II型）2、 什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識(shí)別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。產(chǎn)生Star活性的因素：（書上P46-P47答案）高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2 ，低離子強(qiáng)度，低鹽濃度，低pH3、 結(jié)

35、合已做的實(shí)驗(yàn)，分析影響酶切的因素。（這個(gè)答案是上屆的，僅供參考）1）DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。2）DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。3）溫度 ：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65 oC。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2 和離子強(qiáng)度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：

36、有助于酶的穩(wěn)定；巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活4、 限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個(gè)字母種名的前兩個(gè)字母菌株或菌型代號(hào)（大寫）空白發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoR(E：屬名；co：種名；R：株；：發(fā)現(xiàn)次序)5、 簡(jiǎn)單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同尾酶：來源不同，識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時(shí)切割。同裂酶：識(shí)別序列相同，切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。    

37、60; 不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。）6、 連接酶主要有哪些類型？有何異同點(diǎn)？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點(diǎn)：相同點(diǎn)：都能以DNA為模板，從5'向3'進(jìn)行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。不同點(diǎn)：DNA聚合酶識(shí)別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。影響因素：（影響因素就四個(gè)，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態(tài)：       ¹ 效率：粘性末端>

38、;平端(100倍)；       ¹ 5，突出>3，突出；       ¹平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI2）連接溫度       ¹連接效果最好在37 ，但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定;¹最佳連接溫度：12-16 ，較好的連接效果，互補(bǔ)又較穩(wěn)定;3）反應(yīng)液中的成分：    &

39、#160;  ¹ ATP：反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；       ¹單價(jià)離子：150-200mM NaCl，提高連接效果；       ¹ PEG：5%以下可以提高連接效率4）插入片段與載體的濃度比例          ¹載體DNA與外源DNA的分子摩爾

40、比通常為13左右，甚至110 或更高。       ¹目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。 7、 試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網(wǎng)上答案）1、低溫下長(zhǎng)時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好。2、在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。3、足夠多的載體和插入片段是最重要的 。4、平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感5、盡可能縮小連接反應(yīng)的體積6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比1

41、4度好8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修飾過的T7 DNA聚合酶6）逆轉(zhuǎn)錄酶7）Taq DNA聚合酶第四章      基因克隆的載體系統(tǒng)1、 作為基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件？! 具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；! 具有合適的篩選標(biāo)記；! 具有較高的外源DNA的載裝能力；! 具有多克隆位點(diǎn)（MCS）；! 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。2、 質(zhì)粒的不相容性及

42、其分子機(jī)理。 定義：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。 分子機(jī)理：兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制同時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。3、 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。4、 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，

43、影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？A、 化學(xué)法（CaCl2法)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2 與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。B、 電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)，在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素:1）載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱?，轉(zhuǎn)化效率越低；3）受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理；4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。5、重組體分子的選擇方

44、法主要有哪些？并簡(jiǎn)單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類型：                                      （1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)法在構(gòu)建基因工程載體

45、系統(tǒng)時(shí)，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。（2）基于克隆DNA序列檢測(cè)法Southern印跡雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測(cè)法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、用已學(xué)過的重組體分子的選擇與鑒定技術(shù)，試設(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)方案，假如一特異

46、PCR擴(kuò)出的基因或基因片斷重組進(jìn)T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如何鑒定并獲得真實(shí)轉(zhuǎn)化子？(自理)第五章  基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH，原因請(qǐng)看下題）？1）差減雜交（SH）通過DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫的方式來進(jìn)行目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共

47、同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。3）差異顯示PCR（DD RT-PCR）利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3端設(shè)計(jì)象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。4）DNA代表性差異分析（DNA RDA）代表性差別分析是通過突變型（驅(qū)趕DNA，driver DNA）與野生型（檢測(cè)DNA，tester DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多樣性（AFLP）基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使

48、用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識(shí)別粘性末端，互補(bǔ)連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：關(guān)德軍.AFLP技術(shù)原理及其在植物研究中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（15）：3625-3628）6）cDNA微陣列建立一套統(tǒng)一且具有高質(zhì)量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個(gè)cDNA克隆都有固定的位置和編號(hào)，這樣大大方便了數(shù)據(jù)的綜合比較分析，并可對(duì)每個(gè)cDNA克隆子進(jìn)行定量分析。在列陣雜交的基礎(chǔ)上，還可以進(jìn)行雜交測(cè)序，從而測(cè)定每個(gè)cDNA克隆子的序列。2、簡(jiǎn)單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)，有何應(yīng)用？主

49、要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3端設(shè)計(jì)象5-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：l       簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。l       所需的mRNA量少。l       各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行

50、比較。l       擴(kuò)出的cDNA可直接用于測(cè)序、文庫篩選等。缺點(diǎn)：l       假陽性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。l       工作量大。l       無法定量研究。l       擴(kuò)出的條帶往往是3端比較短的UTR區(qū)的一段序列，

51、提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）3、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。應(yīng)用：l 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；l 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；l 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技

52、術(shù)的原理。A酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分隔開的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是DNA特異結(jié)合域（DNA-binging domain,BD），一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的、具有激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達(dá)。B噬菌體表面展示技術(shù)原理：當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個(gè)外被蛋白基因中時(shí)，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個(gè)外源DNA片段所編碼

53、的產(chǎn)物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達(dá)，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴(kuò)增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。Ø       農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體。Ø       建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.Ø  

54、     用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。Ø       用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。Ø       把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測(cè)序分析。第七章  克隆基因的表達(dá)1、通過比較，分析大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：  ò全基因組測(cè)序

55、，共有4405個(gè)開放型閱讀框架；  ò基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟、完善；  ò繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；  ò被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：   ò缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；   ò缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；   ò內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；   ò周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：ü       具有強(qiáng)的受嚴(yán)格調(diào)控的AOX1啟動(dòng)子ü       表達(dá)蛋白的翻譯后的加工和修飾ü       營(yíng)養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低ü       可高密度發(fā)酵ü