中藥色譜06-色譜聯(lián)用技術(shù)2

1、2質(zhì)量過濾器質(zhì)量過濾器345ProStar Binary 210Solvent DeliverySystemProStar 430AutoSamplerModule1200LLC/MS6SprayChamberDiverterCapillary Plug& Hexapole Ion GuideQ1Q2Curved185 mmPathQ3Multiplier+/- 5kV postaccelerationDual StageTurbo7？LC與與MS聯(lián)用面臨的問題？聯(lián)用面臨的問題？ 將常規(guī)將常規(guī)LC每分鐘約每分鐘約1ml或數(shù)或數(shù)ml流速的液體流動(dòng)流速的液體流動(dòng)相引入要求高真空操作的相引入

2、要求高真空操作的MS儀，引起流速不協(xié)調(diào)儀，引起流速不協(xié)調(diào); 經(jīng)典離子化方法的高溫高電壓不適合經(jīng)典離子化方法的高溫高電壓不適合LC分析分析的熱不穩(wěn)定性或難揮發(fā)性樣品的離子化的熱不穩(wěn)定性或難揮發(fā)性樣品的離子化; LC分析常用的難揮發(fā)性緩沖鹽系統(tǒng)易污染分析常用的難揮發(fā)性緩沖鹽系統(tǒng)易污染MS儀儀8LC/MS聯(lián)用的接口技術(shù)聯(lián)用的接口技術(shù)*直接液體導(dǎo)入接口直接液體導(dǎo)入接口(Direct Liquid Introduction)*傳送帶技術(shù)傳送帶技術(shù)(Moving Belt Interface)流出物滴落在傳送帶上，紅外線加熱去溶劑流出物滴落在傳送帶上，紅外線加熱去溶劑缺點(diǎn)：離子化效率低；記憶效應(yīng)缺點(diǎn)：離子

3、化效率低；記憶效應(yīng)*熱噴霧熱噴霧(Thermospray)流動(dòng)相經(jīng)過噴霧探針時(shí)被加熱，體積膨脹后以超聲速流動(dòng)相經(jīng)過噴霧探針時(shí)被加熱，體積膨脹后以超聲速噴出形成霧滴，離子蒸發(fā)；流速噴出形成霧滴，離子蒸發(fā)；流速1ml/min，水相多，水相多缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：MW200-1000u；熱分解；熱分解9LC/MS：ESI 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖10Finnigan ESI11Agilent ESI12AB ESI13Waters ESI14Varian ESISprayChamberCapillary Plug& Hexapole Ion Guide SampleSprayAssembly15Electrosp

4、rayIonization, desolvation, excess droplet removalN2GasHeaterN2 drying gasVacuum RestrictionDrying gas promotes rapid desolvation and blows large droplets away from capillary inletIonsDropletsDropletsDroplets16Electrospray Mechanism+DesolvationNeedleCharged DropletAnalyteIonization1718+Hot Drying Ga

5、s+solventsolventsolventsolvent1920LiquidNebulizingGasOptimum depends on liquid flowInner to outer needle position is critical to nebulization efficiency液滴分布狀態(tài)液滴分布狀態(tài)Large uncharged dropletsSmall highly charged dropletsIntermediate size dropletsSpray needleTaylor coneSpreading due to charge repulsion2

6、3ElectrosprayIonization, desolvation, excess droplet removalN2GasHeaterN2 drying gasVacuum RestrictionDrying gas promotes rapid desolvation and blows large droplets away from capillary inletIonsDropletsDropletsDroplets進(jìn)入四級(jí)桿質(zhì)量分析器進(jìn)入四級(jí)桿質(zhì)量分析器3.5 mTorr0.8 TorrDroplets IonsQ1Droplet desolvation occurs bef

7、ore entrance to the capillary. Ion/Solvent clusters are dissociated by collisions before the skimmer cone and in the ion guide.IonsSmall Ions Ion Guide分析物離子化分析物離子化JAnalyte forms an ion in the mobile phaseJPositive Ion ESIJCation attachment: H+ + M (M+H)+ also Na+, K+, NH4+JNegative Ion ESIJProton lo

8、ss: M (M-H)- + H+JAnion attachment: A- + M (M+A)- 示例：穩(wěn)定母離子的確認(rèn)示例：穩(wěn)定母離子的確認(rèn)定量離子對(duì)：定量離子對(duì)： 多烯紫杉醇多烯紫杉醇m/z 830549.0（TNa+，圖，圖A） 紫杉醇紫杉醇 m/z 876 591.0（TNa+，圖，圖B） 不同甲酸濃度下多西他賽母離子的穩(wěn)定性不同甲酸濃度下多西他賽母離子的穩(wěn)定性與靈敏度考察與靈敏度考察1. 加鈉離子（加鈉離子（m/z 830）2. 加鉀離子（加鉀離子（m/z 846 ）3. 加氫離子（加氫離子（m/z 808 ） 0 formic acid 0.05 formic acid 0.1

9、formic acid 0.2 formic acid 不同甲酸濃度下多西他賽子離子的穩(wěn)定性不同甲酸濃度下多西他賽子離子的穩(wěn)定性與靈敏度考察與靈敏度考察0 formic acid 0.05 formic acid 0.1 formic acid 0.2 formic acid 1. 加鈉離子（加鈉離子（m/z 549）2. 加鉀離子（加鉀離子（m/z 565）3. 加氫離子（加氫離子（m/z 527） 29LC/MS：APCI 結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖30APCI is a gas phase reactionAnalyte must be available as a stable, gas phase

10、 moleculeMatrix components may or may not undergo non-destructive evaporationEvaporation driven by a very hot auxiliary gasliquidgasQuartzTubeQuartzTubeVortex flowof hot gasgas31Corona NeedleCI reactions occur between the corona needle and the spray plateNebulizer and auxiliary gas plus gas phase mo

11、lecules of mobile phase, analyte and matrix flood into the APCI chamber32APCI 基本原理基本原理從液相色譜流出的樣品溶液進(jìn)入一具有霧化氣套從液相色譜流出的樣品溶液進(jìn)入一具有霧化氣套管的毛細(xì)管，經(jīng)氮?dú)饬黛F化，通過加熱管時(shí)被氣管的毛細(xì)管，經(jīng)氮?dú)饬黛F化，通過加熱管時(shí)被氣化。在加熱管端進(jìn)行化。在加熱管端進(jìn)行電暈尖端放電電暈尖端放電溶劑分子被溶劑分子被電離，充當(dāng)反應(yīng)氣，與樣品氣態(tài)分子碰撞，經(jīng)過電離，充當(dāng)反應(yīng)氣，與樣品氣態(tài)分子碰撞，經(jīng)過復(fù)雜的反應(yīng)過程，樣品分子生成準(zhǔn)分子離子：復(fù)雜的反應(yīng)過程，樣品分子生成準(zhǔn)分子離子： R + e R

12、+ + 2eRH+ + M MH+ + R33 ESI APCI對(duì)象對(duì)象 中等至強(qiáng)極性分子中等至強(qiáng)極性分子 非極性非極性/中等極性中等極性不適宜不適宜 極端非極性樣品極端非極性樣品 熱穩(wěn)定性差熱穩(wěn)定性差/非揮發(fā)性非揮發(fā)性流動(dòng)相流動(dòng)相 pH對(duì)離子化效率影響較大對(duì)離子化效率影響較大 緩沖鹽濃度低緩沖鹽濃度低 緩沖鹽濃度可高些緩沖鹽濃度可高些 有機(jī)相比例不能太低有機(jī)相比例不能太低 水相比例可高些水相比例可高些流速流速 低流速較好低流速較好 高流速比高流速比ESI好好 34LC LC/MS：*多數(shù)色譜柱與多數(shù)色譜柱與LC/MS匹配，離子交換柱除外匹配，離子交換柱除外*使用有機(jī)溶劑比例較高的系統(tǒng)使用有機(jī)

13、溶劑比例較高的系統(tǒng)*避免使用難揮發(fā)性緩沖鹽，可用醋酸銨、甲避免使用難揮發(fā)性緩沖鹽，可用醋酸銨、甲酸銨、三氟乙酸；酸銨、三氟乙酸；*使用揮發(fā)性離子對(duì)試劑：氫氧化四丁基銨使用揮發(fā)性離子對(duì)試劑：氫氧化四丁基銨（TBAH），七氟丁酸（），七氟丁酸（HFBA）*流量匹配：流量匹配：兼顧色譜分離效果和兼顧色譜分離效果和ESI離子化效離子化效率；用率；用1-2mm內(nèi)徑色譜柱，內(nèi)徑色譜柱，300-500ul/min；柱后分流柱后分流Scan Modes Full Scan全掃描全掃描MS ModeQ1Q2Q3Full scan (Q1)Full scan (Q3)= scanned;= selected m/

14、z;blank = complete transmissionScan Modes SIM選擇離子監(jiān)測(cè)選擇離子監(jiān)測(cè)MS ModeQ1Q2Q3Selected ion monitoring (SIM) (Q1)Selected ion monitoring (SIM) (Q3)= scanned;= selected m/z;blank = complete transmissionSelected Ion MonitoringScan Modes SRM選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)MS ModeQ1Q2Q3Selected reaction monitoring (SRM)Selected rea

15、ction monitoring (SRM)= scanned;= selected m/z;= CIDCollision induced dissociation Selected Reaction MonitoringScan Modes MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MS ModeQ1Q2Q3Multiple reaction monitoring (MRM)Multiple reaction monitoring (MRM)= scanned;= selected m/z;= CIDMultiple Reaction MonitoringScan Modes Precursor Scan母

16、離子掃描母離子掃描MS ModeQ1Q2Q3Precursor Scan MS/MS= scanned;= selected m/z;= CIDScan Modes Product Scan子離子掃描子離子掃描MS ModeQ1Q2Q3 ProductScan MS/MS= scanned;= selected m/z;= CIDScan Modes Neutral Loss Scan中性丟失掃描中性丟失掃描MS ModeQ1Q2Q3Precursor Scan MS/MS= scanned;= scanned with offset;= CID多種掃描模式設(shè)定多種掃描模式設(shè)定All mode

17、s are time programmable, with numerous time segments available for each methodFull ScanSIMSRMMRMPrecursor ScanNeutral LossScan:250-500521ESI(-)523ESI(+)XIC 521XIC 523pProduct ScanProduct Scan:523100523361Neutral Loss Scan: 400550238388OOHOCH3OCH3GlcOH3COOOH野鳶尾苷野鳶尾苷49中藥化學(xué)成分的快速篩選及成分分析中藥化學(xué)成分的快速篩選及成分分析質(zhì)

18、譜檢測(cè)器可以給出大量的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類質(zhì)譜檢測(cè)器可以給出大量的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，或結(jié)合其它檢測(cè)方已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，或結(jié)合其它檢測(cè)方法，即可對(duì)未知成分進(jìn)行直接分析，因此在以生法，即可對(duì)未知成分進(jìn)行直接分析，因此在以生物活性為指導(dǎo)的化學(xué)篩選中，可以對(duì)目標(biāo)化合物物活性為指導(dǎo)的化學(xué)篩選中，可以對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行靶分析進(jìn)行靶分析中藥質(zhì)量控制中藥質(zhì)量控制-中藥指紋圖譜研究中藥指紋圖譜研究LC-MS聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)的不足，聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用彌補(bǔ)了紫外檢測(cè)的不足，還提供了大量的化學(xué)成分信息，可實(shí)現(xiàn)對(duì)各主要還提供了大量的化學(xué)成分信息，可實(shí)現(xiàn)對(duì)各主要流出組分的定性，從而為

19、藥材及其制劑的鑒別及流出組分的定性，從而為藥材及其制劑的鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更加全面、可靠的依據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供更加全面、可靠的依據(jù)Identification of multiple components in Guanxinning injection using hydrophilic interaction liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and reverse phase liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometryRapid Communicati

20、ons in Mass SpectrometryXiaofei Chen, Ziyang Lou, Hai Zhang, Guangguo Tan, Zhirui Liu , Wuhong Li, Zhenyu Zhu and Yifeng Chai*示例：應(yīng)用親水作用色譜示例：應(yīng)用親水作用色譜- -反相色譜互補(bǔ)策略聯(lián)用反相色譜互補(bǔ)策略聯(lián)用飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器鑒別冠心寧注射液的主要成分飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器鑒別冠心寧注射液的主要成分512009年年7月，月，SFDA針對(duì)近年來中藥注射劑頻發(fā)針對(duì)近年來中藥注射劑頻發(fā)質(zhì)量安全事故這一問題，下發(fā)了質(zhì)量安全事故這一問題，下發(fā)了關(guān)于開展中藥關(guān)于開展中藥注射劑安

21、全性再評(píng)價(jià)工作的通知注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作的通知，要求在全國(guó)，要求在全國(guó)范圍內(nèi)開展范圍內(nèi)開展中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作，并提，并提出了如下要求：出了如下要求：全面開展生產(chǎn)及質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)排查，全面開展生產(chǎn)及質(zhì)量控制環(huán)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)排查，切實(shí)控制中藥注射劑安全隱患切實(shí)控制中藥注射劑安全隱患因此，將注射液中因此，將注射液中絕大多數(shù)甚至全部成分絕大多數(shù)甚至全部成分搞搞清楚是，并進(jìn)行針對(duì)性的質(zhì)量控制，是保證中藥清楚是，并進(jìn)行針對(duì)性的質(zhì)量控制，是保證中藥注射液安全穩(wěn)定的基礎(chǔ)注射液安全穩(wěn)定的基礎(chǔ)。52冠心寧注射液：收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)（冠心寧注射液：收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)（1998）

22、由丹參和川芎兩味傳統(tǒng)中藥組成；由丹參和川芎兩味傳統(tǒng)中藥組成；臨床上主要用于冠心病、心絞痛、腦栓塞等心、腦血管疾病的臨床上主要用于冠心病、心絞痛、腦栓塞等心、腦血管疾病的治療；治療；具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)，加速缺血心肌的修復(fù)具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)，加速缺血心肌的修復(fù)等作用；等作用；p 注射液中主要成分為注射液中主要成分為酚酸類、苯酞類等酚酸類、苯酞類等水溶性成分，水溶性成分，這是通常認(rèn)為這是通常認(rèn)為的起作用成分的起作用成分53糖、氨基酸、有機(jī)酸糖、氨基酸、有機(jī)酸等成分同樣也起到一定的作等成分同樣也起到一定的作用，用，輔料輔料的含量也應(yīng)得到控制，但由于這些物質(zhì)的含量也應(yīng)得到

23、控制，但由于這些物質(zhì)極性均較強(qiáng)，很難在常規(guī)的極性均較強(qiáng)，很難在常規(guī)的C18柱上表征。柱上表征。54色譜條件：色譜條件：RPLC分離使用分離使用Agilent Zorbax SB-C18柱柱(100 mm 3.0 mm I.D., 3.5 m)，柱溫，柱溫30，流動(dòng)相使用流動(dòng)相使用0.4%乙酸乙酸水溶液水溶液(A)和乙腈和乙腈(B)，梯度洗脫，梯度洗脫0-19 min，2-23 % B；19-27 min，23-30 % B；27-35 min，30-90 % B；35-45 min，90%B。流速流速0.5mL/min，為了獲得更好的電噴，為了獲得更好的電噴霧效率，柱后分流保持霧效率，柱后分流

24、保持0.2mL/min進(jìn)入質(zhì)譜分析，進(jìn)樣進(jìn)入質(zhì)譜分析，進(jìn)樣量為量為5L。HILIC分離使用分離使用SHISEIDO PC HILIC柱柱(150mm 2.0 mm I.D., 5 m)，柱溫，柱溫40，流動(dòng)相使用流動(dòng)相使用5mmoL/L醋酸醋酸銨水溶液（銨水溶液（A）和乙腈（）和乙腈（B），梯度洗脫），梯度洗脫0-10，90% B；10-20min，90-70% B；20-25min，70% B。流速流速0.2mL/min，直接進(jìn)入質(zhì)譜分析，進(jìn)樣量為，直接進(jìn)入質(zhì)譜分析，進(jìn)樣量為2L。55質(zhì)譜條件：質(zhì)譜條件：檢測(cè)器為檢測(cè)器為Agilent 6200 TOF/MS裝配裝配ESI離子離子源。源。TO

25、F/MS分析使用全掃描模式，質(zhì)核比范圍分析使用全掃描模式，質(zhì)核比范圍100-1100，負(fù)離子模式。，負(fù)離子模式。ESI離子源條件如下：干離子源條件如下：干燥氣流速，燥氣流速，8 L/min；干燥氣溫度，；干燥氣溫度，350；霧化；霧化器壓力，器壓力，35 psig；毛細(xì)管壓力，；毛細(xì)管壓力，4000V；碎片電；碎片電壓，壓，130-325V動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)；動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)；skimmer voltage, 60 V; octopole RF, 250 V。56樣品處理1、與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間、碎片信息與已知碎片骨架信息比對(duì)LC-TOF/MS分析,獲得色譜峰精確分子量2、在化合物數(shù)據(jù)庫中搜索匹配化合物數(shù)據(jù)庫建

26、立對(duì)照品處理3、根據(jù)碎片信息推導(dǎo)可能的結(jié)構(gòu)比對(duì)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，嘗試鑒別非目標(biāo)化合物，個(gè)別購買對(duì)照品確證誤差5 ppm，利用MH-、2MH- M2H+Na-等分子離子峰信息匹配最有可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)式通過查詢注射液藥材相關(guān)的植物化學(xué)和藥理學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)獲得，數(shù)據(jù)庫包括化合物的化學(xué)式、精確分子量、名稱、中文名、來源植物，CAS號(hào)，紫外信息，質(zhì)譜信息，參考文獻(xiàn)和注釋。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，明確鑒別目標(biāo)化合物目標(biāo)化合物非目標(biāo)化合物56C18柱TOFMS總離子流圖HILIC柱TOFMS總離子流圖34個(gè)化合物， 4組同分異構(gòu)體17個(gè)化合物， 1組同分異構(gòu)體57非目標(biāo)化合物的鑒別和確證非目標(biāo)化合物的鑒別和確證EIC:m/

27、z=130.0609碎片電壓130V128.0351的同位素分布離子12&1、異亮氨酸2、亮氨酸58C6H13NO2C12H22O11非目標(biāo)化合物的鑒別和確證非目標(biāo)化合物的鑒別和確證2M-HM+HCOOM-HM-H2M-H-162Glucose -H蔗糖59非目標(biāo)化合物的鑒別和確證非目標(biāo)化合物的鑒別和確證2M-2H+NaM-HM-H-NH2L-苯丙氨酸C9H11NO260示例：示例：LC-DAD-MS/MS分離鑒定中藥蓮子心中三種分離鑒定中藥蓮子心中三種生物堿生物堿p蓮子心中主要有效成分雙芐基異喹啉類生物堿的藥蓮子心中主要有效成分雙芐基異喹啉類生物堿的藥用價(jià)值日趨重視。其中，蓮心堿（用

28、價(jià)值日趨重視。其中，蓮心堿（）、異蓮心堿）、異蓮心堿（）、甲基蓮心堿（）、甲基蓮心堿（）為蓮子心中）為蓮子心中雙芐基異喹啉雙芐基異喹啉類生物堿的主要成分類生物堿的主要成分J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.761pDried and powdered embryo of the seed of N. nucifera GAERTN. (10 kg) was soaked in 1% HCl for 1 week. The filtrate was then precipitated with 10% aqua ammonia unti

29、l the pH of the solution reached 8.5 and 593 g of crude extract were collected as brown precipitates.p The crude extract was extracted three times with chloroform, and then the organic phase was extracted two times with 3% NaOH. Finally, the extract solution was precipitated with diluted HCl and off

30、-white precipitates were filtered and dried to obtain phenolic alkaloid sample (38.5 g). p The primary stock solutions of crude extract (1 mg/ml) and phenolic alkaloid sample(1 mg/ml) were prepared by dissolving appropriate amount of substance in methanol. Working solutions were obtained by diluting

31、 the stock solutions with distilled water and 10l acetic acid per ml solution was added. All the solutions were stored at 4 C.282nmHPLC圖圖J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.761LC-DAD-MS/MS分離鑒定中藥蓮子心中三種生物堿分離鑒定中藥蓮子心中三種生物堿1.蓮心堿蓮心堿2.異蓮心堿異蓮心堿3.甲基蓮心堿甲基蓮心堿制備液相制得化學(xué)對(duì)照品制備液相制得化學(xué)對(duì)照品采用采用ESI-MS/MS進(jìn)行流動(dòng)注射分析優(yōu)化進(jìn)行流動(dòng)注射分析優(yōu)化MRM條件條件母離子母離子m/zm/z 611 611碰撞能級(jí)圖碰撞能級(jí)圖 母離子母離子m/zm/z 625 625碰撞能級(jí)圖碰撞能級(jí)圖 m/z 192m/z 206 m/z 206 CID -24 eV J Pharm Biomed Anal. 43 (2007) 99-104. IF2007 2.761LC/MS/MS定量分析定量分析MRM參數(shù)設(shè)定及色譜圖參數(shù)設(shè)定及色譜圖AlkaloidRT (min)CE (eV)Precursor ion (