基因工程原理第123章講義

1、基因工程原理第一章 緒論（基因與基因工程概論）第一節(jié) 基因概念的發(fā)展1基因?qū)W說基因工程或稱基因操作，是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等學(xué)科綜合發(fā)展的基礎(chǔ)上、于本世紀(jì)70年代誕生的一門嶄新的生物技術(shù)學(xué)科。它的創(chuàng)立與發(fā)展，直接地依賴于基因分子生物學(xué)的進步，兩者之間有密切而不可分割的內(nèi)在聯(lián)系。根據(jù)不同歷史時期的水平和特點，基因研究大體上可分為三個不同的發(fā)展階段：在上個世紀(jì)50年代以前，主要是細(xì)胞染色體水平上進行研究，屬于基因的染色體遺傳學(xué)階段；50年代之后，則主要從DNA大分子水平上進行研究，屬于基因的分子生物學(xué)階段；最近30多年，由于重組DNA技術(shù)的完善和應(yīng)用，人們已經(jīng)改變了從表型到基因型的傳統(tǒng)研究基因

2、的途徑，而能夠直接從克隆目的基因出發(fā)，研究基因的功能及其表型間的關(guān)系，使基因的研究進入反向生物學(xué)階段?；蜃畛跏沁z傳學(xué)概念，隨著生物學(xué)科的不斷發(fā)展及生命科學(xué)理論與技術(shù)研究的不斷深入與完善，人們對基因本質(zhì)的認(rèn)識及其定義也在不斷深化。很多先驅(qū)科學(xué)家及其開創(chuàng)性的科學(xué)研究為基因研究的發(fā)展建立了功不可沒的豐功偉績。1866年，奧地利遺傳學(xué)家G. Mendel(孟德爾)根據(jù)豌豆雜交試驗，首次提示了遺傳學(xué)的基本規(guī)律，如分離定律和自由組合定律。闡明了遺傳不是性狀本身，而是決定性狀的遺傳因子。1909年，丹麥生物學(xué)家W. Johannsen根據(jù)希臘文“給予生命”之義，創(chuàng)造了基因(gene)一詞，這一術(shù)語卻一直沿

3、用至今，并發(fā)展為決定遺傳性狀的物質(zhì)基礎(chǔ)。1910年，美國著名遺傳學(xué)家T.H. Morgan(摩爾根)和他的助手們以國蠅為材料，確認(rèn)遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)存在于染色體中并提出基因連鎖和互換定律。第一次將代表某一特定性狀的基因同某一特定的染色體聯(lián)系起來，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論。2DNA是遺傳信息的載體1928年，F(xiàn). Griffith首先發(fā)現(xiàn)了肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化因子是什么？1944年，美國著名微生物學(xué)家O.T. Avery與他的合作者們重復(fù)了Griffith的轉(zhuǎn)化實驗，并進一步對無毒細(xì)菌變成有毒細(xì)菌的轉(zhuǎn)化物質(zhì)進行了分離和化學(xué)上的鑒定，證明使細(xì)菌性狀發(fā)生轉(zhuǎn)化的因子是DNA而不是蛋白質(zhì)或RNA分子。A

4、very等人的工作在遺傳學(xué)理論上樹起了全新的觀點，即DNA分子是遺傳信息的載體。1952年，美國冷泉港卡內(nèi)基遺傳學(xué)實驗室的科學(xué)家A.D. Hershey和他的學(xué)生用他們的噬菌體感染實驗進一步肯定了Avery的結(jié)論。他們用放射性同位素35S和32P分別標(biāo)記噬菌體的外殼蛋白質(zhì)和核心DNA，用雙標(biāo)記的噬菌體感染大腸桿菌，結(jié)果表明噬菌體的蛋白外殼沒有進入細(xì)菌體內(nèi)，只有DNA進入到了細(xì)菌細(xì)胞中，進一步證實了遺傳物質(zhì)是DNA，而不是蛋白質(zhì)。證明了DNA是遺傳物質(zhì)和基因的載體之后，遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家進而著手研究維系生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)DNA分子的自我復(fù)制的過程，以揭示遺傳信息是如何從親代準(zhǔn)確地傳遞到子代的本質(zhì)

5、。1953年，J. Watson和F. Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型成為解密DNA分子的復(fù)制過程的鑰匙，特別是DNA半保留復(fù)制規(guī)律的揭示使遺傳學(xué)家長期感到困惑的基因自我復(fù)制問題得到了最后的解決，也為基因存在于DNA，遺傳信息可以通過DNA的半保留復(fù)制而傳代下去的認(rèn)識提供了基礎(chǔ)。至此，基因以一種真正的分子物質(zhì)呈現(xiàn)在人們面前，科學(xué)家能夠像研究其它大分子一樣，客觀地探索基因的結(jié)構(gòu)及功能，從分子層次上研究基因的遺傳現(xiàn)象，進入了基因的分子生物學(xué)新時代。基因在DNA順序上的多樣性：（1）基因的不連續(xù)性；（2）基因的重疊性；（3）重復(fù)序列(repeated sequence)。3基因及其產(chǎn)物最初基因的功

6、能是如何同蛋白質(zhì)聯(lián)系在一起的呢？早在1902年，A. Garrod在研究人類黑尿病(alkaptonurea)時指出：這種病是由于缺乏某種酶催化代謝反應(yīng)所致。這是最早把基因的功能同蛋白質(zhì)的作用聯(lián)系在一起。但是，第一次明確提出“一個基因一種酶”假說的學(xué)者則是G.W. Beadle和E.L. Tatum。直到1957年，英國劍橋的科學(xué)家V.M. Ingram對鐮形細(xì)胞貧血癥(sickle cell anemia)的血紅蛋白和正常的血紅蛋白的氨基酸序列作了對比研究，才第一次用實驗證實了基因同蛋白質(zhì)之間的直接聯(lián)系。1958年，F(xiàn). Crick在綜合分析了50年代末期關(guān)于遺傳信息流向的各種研究結(jié)果的基礎(chǔ)

7、上，提出了描述DNA、RNA和蛋白質(zhì)三者關(guān)系的中心法則(central dogma)。1970年，H.M. Temin和D. Baltimore發(fā)現(xiàn)一些RNA病毒在寄主細(xì)胞中的復(fù)制過程是先以病毒的RNA分子為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA互補鏈，然后以DNA鏈為模板合成新的病毒RNA。這說明遺傳信息可以從RNA反向傳遞到DNA。為此，1971年，F(xiàn). Crick修改了中心法則。當(dāng)我們思考轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯這兩個過程時會發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)錄不同，它不是簡單的核苷酸順序的抄寫，而是將RNA分子上的核苷酸語言翻譯成蛋白質(zhì)分子上的氨基酸語言的復(fù)雜過程，是涉及到兩種不同語言信號之間的更換問題。在轉(zhuǎn)譯過程中，必定

8、存在著一種特殊的遺傳密碼系統(tǒng)，才可以將RNA分子上的核苷酸順序，同蛋白質(zhì)分子上的氨基酸順序聯(lián)系起來。在50年代末和60年代初，關(guān)于遺傳密碼的研究是基因分子生物學(xué)中最活躍的課題。到1961年底，有關(guān)遺傳密碼的若干主要問題都得到了解決。第一個問題是密碼比，證實是由3個堿基編碼一種氨基酸，我們稱這種堿基三聯(lián)體為密碼子。第二個問題是密碼是否重疊，結(jié)論是不重疊。第三個問題是相鄰的2個三聯(lián)體之間是否存在著“逗號”之類的分割符，堿基的缺失和增加突變研究表明，這種想法不符合事實。在解決了上述問題之后，剩下的就是要設(shè)法弄清每一種氨基酸到底是由哪一種三聯(lián)密碼子編碼的。至1966年，所有64種密碼子便全部破譯出來了

9、。除了線粒體和葉綠體存在的個別特例外，所有生物，包括病毒、原核的和真核的，它們的密碼子同氨基酸之間的關(guān)系都是同樣的，因此說遺傳密碼是通用的。遺傳密碼的通用性是我們賴以開展基因工程的最重要的理論基礎(chǔ)之一。第二節(jié) 基因工程1基因工程的誕生人們公認(rèn)基因工程誕生于1973年。從40年代到70年代初基因工程的誕生，其中現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明起了決定性的作用。（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)第一，40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。第二，在50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞

10、問題。第三，在50年代末期和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。（2）技術(shù)上的三大發(fā)明第一，DNA分子的體外切割與連接技術(shù)是基因工程誕生的第一個技術(shù)發(fā)明。應(yīng)用核酸內(nèi)切限制酶和DNA連接酶對DNA分子進行體外是切割和連接，這是在60年代末期和70年代初期發(fā)展起來的一項重要的基因操作技術(shù)，有人甚至說它是重組DNA的核心技術(shù)。1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox, T.J. Kelley從流感嗜血桿菌中分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶Hind II，使DNA分子的切割成為可能。1972年，H. Boyer實驗室發(fā)現(xiàn)

11、了核酸內(nèi)切酶EcoR I，識別GAATTC序列，切割DNA分子后形成具有粘性末端的片段，具有相同粘性末端的任何不同來源的DNA片段，都可以通過末端之間的堿基互補作用而彼此“粘合”起來。以后，又相繼發(fā)現(xiàn)了大量類似于EcoR I這樣的核酸內(nèi)切酶，這就使研究者可以獲得所需的DNA特殊片段，為基因工程提供了技術(shù)基礎(chǔ)。對基因工程技術(shù)突破的另一發(fā)現(xiàn)是DNA連接酶。1967年，世界上有5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，這種酶能夠參與DNA裂口的修復(fù)，而在一定條件下還能連接DNA分子的自由末端。連接的功能是通過合成相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而修復(fù)缺口(nick)或單鏈的裂口(gap)。1970年，美國

12、威斯康星大學(xué)的H.G. Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)了一種具有更高連接活性的DNA連接酶T4DNA連接酶，有時甚至能夠催化完全分離的兩段DNA分子進行平末端的連接。第二，基因工程載體的使用是基因工程誕生的第二項技術(shù)發(fā)明。大多數(shù)DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，為了能夠在寄主細(xì)胞中進行繁殖，就必須將DNA片段連接到具備自我復(fù)制能力的DNA分子上。這種DNA分子就是所謂的基因克隆載體。根據(jù)當(dāng)時（1972年前后）微生物遺傳學(xué)的研究成果，有可能作基因克隆載體的有病毒、噬菌體和質(zhì)粒等不同的小分子量的復(fù)制子。鑒于多年以來，分子生物學(xué)家一直把注意力集中在病毒同其寄主細(xì)菌之間的相互關(guān)系上，因此很自然地在一開始就選定

13、噬菌體作基因克隆最有希望的載體。其中研究得最為深入，而且業(yè)已被改建成實用克隆載體的是大腸桿菌l噬菌體載體。然而第一個將外源基因?qū)爰闹鞯膮s不是l噬菌體，而是質(zhì)粒載體。將外源DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化，早在肺炎鏈球菌中發(fā)現(xiàn)，但對大腸桿菌卻遲至1970年才獲得成功。當(dāng)時M. Mandel和A. Higa發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過氯化鈣的適當(dāng)處理，便能夠吸收l噬菌體的DNA。兩年后（1972年），斯坦福大學(xué)的S. Cohen等人報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣也能夠攝取質(zhì)粒的DNA。從此，大腸桿菌便成了分子克隆的良好的轉(zhuǎn)化受體。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對基因工程的創(chuàng)立具有特別重要的意義，因為

14、早期使用的克隆載體都是在大腸桿菌細(xì)胞中增殖的復(fù)制子。第三，DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移雜交等技術(shù)對基因工程的開展起到了促進的作用。1972年，美國斯坦福大學(xué)的P. Berg領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，在世界上第一次成功地實現(xiàn)了DNA體外重組，并因此與W. Gilbert, F. Sanger分享了1980年度的諾貝爾化學(xué)獎。他們用核酸內(nèi)切限制酶EcoR I，在體外對猿猴病毒SV40的DNA和l噬菌體的DNA分別進行酶切，然后再用T4DNA連接酶將兩種消化片段連接起來，結(jié)果獲得了包括SV40和l噬菌體DNA的重組的雜種DNA分子。1973年，斯坦福大學(xué)的S. Cohe

15、n等人也成功地進行了另一個體外DNA重組實驗并實現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。他們將大腸桿菌的抗四環(huán)素質(zhì)粒pSC101和抗卡那霉素質(zhì)粒R6-5，在體外用EcoR I酶切后，用T4DNA連接酶將它們連接成重組的DNA分子。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果在含四環(huán)素和卡那霉素的平板中，選出了雙抗的重組菌落。這種雙抗性的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中分離出來的重組質(zhì)粒DNA帶有完整的pSC101分子和來自R6-5質(zhì)粒編碼卡那霉素抗性基因的DNA片段。這是基因工程發(fā)展史上第一次實現(xiàn)重組轉(zhuǎn)化成功的例子?；蚬こ虖拇苏Q生，這年被定為基因工程誕生的元年。S. Cohen與H. Boyer合作，用類似的方法把非洲爪蟾的編碼核糖體基

16、因的DNA片段同pSC101重組后導(dǎo)入大腸桿菌。轉(zhuǎn)化子分析結(jié)果表明，動物的基因的確進入了大腸桿菌，并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA產(chǎn)物。Cohen的工作，是第一次成功的基因克隆實驗，其重要意義在于：說明了像pSC101這樣的質(zhì)粒分子是可以作為基因克隆的載體，能夠?qū)⑼庠吹腄NA導(dǎo)入寄主細(xì)胞；說明了像非洲爪蟾這樣的真核動物的基因是可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細(xì)胞中去，并實現(xiàn)其功能表達的；說明了質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞是一種成功的基因克隆體系，可以作為基因克隆的模式系統(tǒng)進行深入的研究。2基因工程的定義和主要研究內(nèi)容基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入到原先沒有這類分子的

17、寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖的技術(shù)。供體、受體和載體稱為基因工程的三大要素?；蚬こ逃袃蓚€特征，第一個是它將外源DNA的新組合引入到一種新的寄主生物中進行繁殖。這種DNA的新組合就可以按照工程學(xué)的方法進行設(shè)計和操作，可以跨越天然物種的屏障，為定向創(chuàng)造新生物提供了可能性。第二個是，一種確定的DNA小片段能夠在新寄主細(xì)胞中進行擴增。正是具備了這種特征，我們才能制備到大量純化的DNA片段，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域。基因工程包括如下幾個主要的內(nèi)容或步驟（簡稱六字方針）：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩和表。（1）分：從復(fù)雜的生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。（2）切：在體外，用限制性內(nèi)切核

18、酸酶切割目的基因和基因載體，以利于將兩者連接形成重組體。（3）接：在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。（4）轉(zhuǎn)：將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞），并與之一起增殖。（5）篩：從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。進一步提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究使用。（6）表：將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類想要的物質(zhì)。從基因工程定義上來講，以上6個步驟已包括了這項技術(shù)的完整過程，但是，從基因工程的最終目的來講，以上6個步驟還

19、不是它的全部內(nèi)容，因為一個基因工程產(chǎn)品的完成至少還涉及到表達產(chǎn)物的純化、復(fù)性、規(guī)?；a(chǎn)工藝等內(nèi)容的探索。因此，人們習(xí)慣把以上6個步驟稱作是基因工程的上游研究。而下游技術(shù)則涉及到含有重組外源基因的生物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因表達產(chǎn)物的分離純化過程。上游DNA重組的設(shè)計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導(dǎo)思想，而下游過程則是上游基因重組藍(lán)圖的體現(xiàn)與保證，這是基因工程產(chǎn)業(yè)化的基本原則?；蚬こ痰睦碚撘罁?jù)：（1）不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。（2）基因是可切割的。（3）基因是可以轉(zhuǎn)移的。（4）多肽和基因之間存在對應(yīng)關(guān)系。（5）遺傳密碼是通用的。（6）基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代。3基因工程

20、的應(yīng)用與發(fā)展關(guān)于基因組核苷酸全序列的測定和分析，是重組DNA技術(shù)促進基礎(chǔ)生物學(xué)研究的一個很好的范例。1977年，英國分子生物學(xué)家F. Sanger領(lǐng)導(dǎo)的研究小組首先完成了全長5387bp的fX174噬菌體基因組全序列測定工作，揭開了大規(guī)?；蚪M測序工作的序幕。80年代末期，日本科學(xué)家先后于1987年完成了全長155.844bp的煙草葉綠體，1988年完成了全長121.024bp的地錢葉綠體，1989年又完成了全長134.525bp的水稻葉綠體基因組全序列的測定。然而這些細(xì)胞器無論在大小上還是在復(fù)雜性方面，都無法同人類基因組相比擬。人類染色體基因組（在單倍體的情況下）全長3*109bp，編碼近1

21、05個基因。如果考慮到經(jīng)過千百萬年的分化與繁衍，今天全世界已有50多億人口，人類基因之正常和異常的突變形式更是千百倍于基因的基本數(shù)目。由此可見，人類基因組的全序列測定工作是一項何等艱巨而龐大的工程。1984年美國科學(xué)家首先提出研究人類基因組的設(shè)想，在經(jīng)過長達4年的廣泛調(diào)查和反復(fù)論證的基礎(chǔ)上，1988年美國國會終于批準(zhǔn)了人類基因組作圖和測序計劃（簡稱人類基因組計劃），開始了令全世界矚目的人類基因組研究。這一項被新聞界喻為“基因圣戰(zhàn)”的規(guī)?？涨暗目蒲杏媱?，預(yù)計投資30億美元，將歷時15年才可以完成。我國于1999年9月也獲準(zhǔn)參與這一國際性計劃，在北京和上海分別成立了人類基因組研究中心，承擔(dān)人類基因

22、組1%的測序任務(wù)。直到2000年6月，才宣告人類基因組計劃DNA測序草圖完成，同時已破譯了近萬個基因。一般認(rèn)為人類基因組含有數(shù)萬個基因，各司其職，控制著人的生長、發(fā)育、繁殖，一旦人類基因組全部被破譯，就可以了解人類幾千種遺傳性疾病的病因，為基因治療提供可靠的依據(jù)，并且將保證人類的優(yōu)生優(yōu)育，提高人類的生活質(zhì)量。在人類基因組計劃的影響下，以稻米為主食的我國自1992年開始執(zhí)行的水稻基因組作圖和測序計劃也已取得良好的進展。1997年成功地構(gòu)建了高分辨率的水稻基因組物理圖譜，使我國的水稻基因組研究工作繼續(xù)保持世界領(lǐng)先的水平。并于2001年10月12日，中國科學(xué)院、國家計委、科技部聯(lián)合召開新聞發(fā)布會，宣

23、布具有國際領(lǐng)先水平的中國水稻（秈稻）基因組“工作框架圖”和數(shù)據(jù)庫在我國已經(jīng)完成。這一成果標(biāo)志著我國已成為繼美國之后，世界上第二個能夠獨立完成大規(guī)模全基因組測序和組裝分析能力的國家。秈稻全基因組“工作框架圖”的完成，將帶動小麥、玉米等所有糧食作物的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。早在基因工程發(fā)展的初期，人們就開始探討將該技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)與人類健康水平密切相關(guān)的生物大分子，這些物質(zhì)在人體內(nèi)含量極小，但卻具有非常重要的生理功能。1977年，加州大學(xué)（Keiichi Itakura和Herber Boyer）首次在大腸桿菌中表達了人的生長激素釋放抑制素基因，1978年，克隆表達了人的胰島素基因，同年美國Genen

24、tech公司開發(fā)出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進工藝，從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。利用基因工程技術(shù)開發(fā)新型治療藥物是當(dāng)前最活躍和發(fā)展最快的領(lǐng)域?；蚬こ趟幬镏饕富蚬こ袒钚远嚯?、基因工程疫苗和DNA藥物等。一些人體活性多肽（如激素、神經(jīng)多肽、淋巴因子、凝血因子等）在疾病診斷、預(yù)防和治療中具有重要的價值，但是以往只能用傳統(tǒng)的技術(shù)從動物中提取，由于原料來源有限，不同批次質(zhì)量不一，有的還有較大的毒副作用，所以臨床應(yīng)用受到很大限制?；蚬こ虇柺篮螅紫扔么思夹g(shù)在生產(chǎn)人體活性多肽方面顯示了威力，編碼人體活性多肽的基因通過重組轉(zhuǎn)化，獲得了能高效表達的工程菌株，可大批量生產(chǎn)人們需要的人體活性多肽。

25、至2000年統(tǒng)計，應(yīng)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)和上市的人體活性多肽有：人生長激素、a-干擾素、白細(xì)胞介素-2、生長因子、腫瘤壞死因子、凝血因子、人粒細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、組織非蛋白纖溶酶原、胰島素和心鈉素等。原來使用的疫苗主要是由被殺死或減毒的病原微生物組成，或者由細(xì)菌毒素組成。由于在制備過程中因減毒不充分或培養(yǎng)病毒出現(xiàn)問題，有的疫苗具有不良反應(yīng)。利用基因工程技術(shù)，獲得了一系列無毒性作用的新疫苗。細(xì)菌方面有霍亂弧菌、百日咳桿菌、麻風(fēng)桿菌、淋球菌、綠膿桿菌、腦膜炎雙球菌、鏈球菌、志賀菌屬某些菌種等的疫苗；病毒方面有流感病毒、人免疫缺陷病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、帶狀皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒等的疫苗

26、；寄生蟲方面有瘧原蟲、絲蟲、血吸蟲、利值曼原蟲等疫苗。此外，不少科技工作者正在開展癌癥和愛滋病等頑癥疫苗的研制工作。近年來在基因工程疫苗研究領(lǐng)域，轉(zhuǎn)基因植物疫苗異軍突起，將抗原基因?qū)胫参?，讓其在植物中表達，人或動物攝入這種植物或其中的抗原蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生對某抗原的免疫應(yīng)答。乙肝病毒表面抗原基因和大腸桿菌腸毒素基因等已導(dǎo)入馬鈴薯中表達，用這樣的薯快喂小鼠，均產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。為了獲得人可以生吃的能產(chǎn)生疫苗的植物，1995年以來，開展了以番茄和香蕉生產(chǎn)口服食品疫苗的研究，番茄中已表達了狂犬病毒糖蛋白和天花病毒表面抗原。有些抗原基因在香蕉中也表達成功。由于口服食品疫苗具有成本低、保持自然狀態(tài)免疫原性和

27、使用方便安全等優(yōu)點，將會迅速發(fā)展起來。用作DNA藥物有腺苷脫氨酶基因、白介素基因和淋巴細(xì)胞因子基因以及反義寡核苷酸藥物等。隨著人類基因組研究的深入，由于提供大量的遺傳信息，必將大大加速DNA藥物的迅速發(fā)展。生產(chǎn)基因工程藥物，早期采用轉(zhuǎn)基因微生物發(fā)酵或轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞培養(yǎng)，從中提取有效成分，近年來發(fā)展了用轉(zhuǎn)基因動物的乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)基因工程藥物。至今在以下轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中獲得了一些人類活性多肽：牛奶中有抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清蛋白、膠原蛋白、生育激素、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)C等，山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶生育激素、血清白蛋白、組織型溶纖維原激活因子、單克隆抗體，綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝

28、血因子IX、纖維蛋白原、蛋白質(zhì)C，豬奶中有蛋白質(zhì)C、凝血因子IX、纖維蛋白原、血紅蛋白。此外，正在研究含基因工程藥物的綠藻和藍(lán)藻，不必提取就可服用。從80年代以來，基因工程已開始朝著高等動植物物種的遺傳特征改良以及人體基因治療等方向發(fā)展。轉(zhuǎn)基因植物研究方面，1983年利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草。如今，利用基因工程技術(shù)，將一些具有實用價值的外源基因分別導(dǎo)入多種作物，獲得了一批轉(zhuǎn)基因植物。如培育成功了一批分別具有抗病（包括病毒?。簾煵莼ㄈ~病毒、細(xì)菌和真菌?。盒←湹陌追鄄　⒊嗝共?、黃矮?。?、抗蟲（應(yīng)用最廣的是蘇云金芽孢桿菌的Bt殺蟲晶體蛋白基因和豇豆等作物的胰蛋白酶抑制基

29、因：轉(zhuǎn)基因棉花：抗田菜夜蛾、棉鈴蟲，轉(zhuǎn)基因煙草對煙草文蛾的抗性可達死亡率100%；轉(zhuǎn)基因玉米對玉米螟也具有明顯抗性）和抗除草劑性狀的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。另外在作物抗旱、抗寒、抗熱和抗鹽方面都有研究進展。在改善作物品質(zhì)方面，嘗試改變植物中氨基酸組成和含量，提高作物的營養(yǎng)價值。如將豆科植物的貯藏蛋白基因轉(zhuǎn)入牧草，奶牛吃了以后，牛奶中含有較多的人體必須氨基酸，轉(zhuǎn)入谷類作物，獲得了氨基酸組成更適合人體需要的轉(zhuǎn)基因作物。此外還有抗腐爛的番茄和柿子等。轉(zhuǎn)基因動物研究方面，早在1980年首次通過顯微注射培育出世界上第一個轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因小鼠，由于動物不像植物那樣容易通過體細(xì)胞培養(yǎng)再生新的個體，所以對轉(zhuǎn)基因動物的研

30、究遠(yuǎn)不如轉(zhuǎn)基因植物那樣廣泛，主要集中在改良家畜、家禽和魚的經(jīng)濟性狀，以及生產(chǎn)某些藥物和蛋白質(zhì)。如將牛的基因?qū)胴i體內(nèi)，豬不僅生長快，個體大，而且瘦肉率高，飼料的利用率高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來豐厚的經(jīng)濟效益。近年來，成功地將人的基因?qū)胴i體內(nèi)，可望能解決動物器官移植到人體后的異體排斥問題。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)活性多肽和藥物等上面已經(jīng)介紹?？寺⊙颉岸嗬颉钡膯柺?，證實高等動物體細(xì)胞同植物細(xì)胞一樣具有全能性，在合適的培養(yǎng)條件下，一個體細(xì)胞同樣可以再生成新的個體?；蚬こ桃灿辛Φ卮龠M了醫(yī)學(xué)科學(xué)的研究，這方面的重要突破是發(fā)現(xiàn)了致癌基因，弄清了腫瘤的起因。隨著醫(yī)學(xué)和分子遺傳學(xué)研究的不斷進步，人們逐漸認(rèn)識到，遺傳病其實只是

31、基因突變綜合癥（分子?。┲械囊活?，目前一些嚴(yán)重威脅人類健康的所謂“文明病”或“富貴病”，如心腦血管病、糖尿病、癌癥、過度肥胖綜合癥、老年性癡呆癥、骨質(zhì)疏松癥等等，都屬分子病范疇，分子病治療有兩種：一是定期向患者體內(nèi)輸入病變基因的原始產(chǎn)物，以對抗病變基因造成的危害；二是利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)更換病變基因，達到標(biāo)本兼治的目的?；虔煼▽嵤┑那疤釛l件是對人類病變基因的精確認(rèn)識，隨著人類基因組測序草圖的完成，揭示人體125000個基因的全部奧秘具有極大的誘惑力?；蛐酒谂R床的應(yīng)用對于遺傳病等診斷和早期防治方面都顯示了巨大的價值?；蚬こ踢€在酶制劑工業(yè)、食品工業(yè)、化學(xué)和能源工業(yè)及環(huán)境保護等方面也有其用武之地

32、。4基因工程的安全性問題自基因工程誕生之日起，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關(guān)注。關(guān)于重組DNA潛在的危險性問題的討論，在基因工程還處于醞釀階段時就已經(jīng)開始了。爭論的焦點是擔(dān)心基因工程的雜種生物會從實驗室逸出，在自然界造成難以控制的危害。有趣的是，首先產(chǎn)生這種擔(dān)心的卻是直接從事DNA重組研究的科學(xué)工作者，1972年，美國斯坦福大學(xué)的P. Berg首次實現(xiàn)了在體外將猿猴病毒SV40的DNA和l噬菌體的DNA連接成功，就是出于安全性方面的考慮，他主動放棄了將重組基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞的想法。美國的公眾也公開表示，擔(dān)心重組DNA技術(shù)會培養(yǎng)出具有潛在危險性的新型微生物，而給人類帶來難以預(yù)料的后果。

33、而且?guī)缀跛械膱罂s志都在發(fā)表大量的爭論文章和政府及科學(xué)團體的報告，擔(dān)憂和反對開展重組DNA研究。在這種背景下，美國國家衛(wèi)生研究院舉行了一次有160名來自美國和16個國家有關(guān)專家學(xué)者參加的國際會議。對重組DNA的潛在危險性展開了針鋒相對的辯論，最后總算在如下三個重要問題上取得了一致的看法：第一，新發(fā)展的基因工程技術(shù)，為解決一些重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)問題，以及令人普遍關(guān)注的社會問題（如環(huán)境污染、食品和能源問題）展現(xiàn)了樂觀的前景；第二，新組成的重組DNA生物體的意外擴散，可能會出現(xiàn)不同程度的潛在危險，因此，開展這方面的研究要采取嚴(yán)格的防范措施，并建議在嚴(yán)格控制的條件下，進行必要的DNA重組實驗，來探討

34、這種潛在危險性的實際程度；第三，目前進行的實驗，即使采取最嚴(yán)格的控制措施，其潛在的危險性仍然極大。因此，會議要求制訂一份統(tǒng)一管理重組DNA研究的實驗準(zhǔn)則，并要求盡快發(fā)展出不會逃逸出實驗室的安全寄主細(xì)菌和質(zhì)粒載體。1976年6月23日，美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）在會議的基礎(chǔ)上制訂并正式公布了“重組DNA研究準(zhǔn)則”。除了規(guī)定禁止若干類型的重組DNA實驗以外，還制訂了許多具體的規(guī)定條文。如明確規(guī)定了物理防護和生物防護兩個方面的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。由于該準(zhǔn)則過于嚴(yán)格，甚至過于脫離實際，再加上一直沒有發(fā)生重組DNA危險事件，以后NIH對“安全準(zhǔn)則”作了多次修改，放寬了許多限制。就目前的情況看，只要重組DNA的實

35、驗規(guī)模不大，不向自然界傳播，實際上已經(jīng)不受任何法則限制了。當(dāng)然，這在任何意義上講，都不是說重組DNA研究已不具有潛在的危險性了。相反地，作為負(fù)責(zé)的科學(xué)工作者，堅持不懈地保持防護意識仍然是十分必要的，對此應(yīng)保持清醒的認(rèn)識。第二章 基因克隆載體基因克隆載體是指用來進行基因克隆、cDNA克隆或亞克隆的DNA分子，是將外源DNA攜帶進入宿主細(xì)胞并進行復(fù)制的工具。絕大多數(shù)分子克隆實驗所使用的載體是DNA雙鏈分子，其功能是： （1） 為外源基因提供進入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。（2） 外源基因提供在受體細(xì)胞中的復(fù)制能力或整合能力。（3）為外源基因提供在受體細(xì)胞中的擴增和表達能力。上述三大功能并非所有的載體分子都

36、必需具備，DNA重組克隆的目的不同，對載體分子的性能要求也不同。一個理想的載體至少應(yīng)具備以下幾個條件：（1）能自我復(fù)制并能帶動插入的外源基因一起復(fù)制。（2）具有合適的限制性內(nèi)切酶位點。在載體上單一的限制性內(nèi)切酶位點越多越好，這樣可以將不同限制性內(nèi)切酶切割后的外源DNA片段方便地插入載體。（3）具有合適的篩選標(biāo)記，如抗藥性基因等。（4）在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴增。（5）載體的相對分子質(zhì)量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段。載體的相對分子質(zhì)量太大將影響重組體或載體本身的轉(zhuǎn)化效率。（6）在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失。載體在基因工程中占有十分重要的

37、地位。目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持和高效表達，在很大程度上取決于載體。第一節(jié) 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體是以細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)組建而成的基因工程載體。細(xì)菌質(zhì)粒是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨立于染色體的自主復(fù)制的共價、閉合、環(huán)狀雙鏈DNA分子，其大小通常在1-500 kb范圍內(nèi)。質(zhì)粒并不是細(xì)菌生長所必需的，但賦予細(xì)菌某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力，如抗菌素的抗性、重金屬離子的抗性、細(xì)菌毒素的分泌以及復(fù)雜化合物的降解等。1 質(zhì)粒的基本特征野生型質(zhì)粒具有下列基本特征：1）自主復(fù)制性：質(zhì)粒DNA含有自己的復(fù)制起始位點（Origin，簡稱ori）以及控制復(fù)制頻率的調(diào)控基因，有些質(zhì)粒還攜帶特定的復(fù)

38、制因子編碼基因，形成一個獨立的復(fù)制子結(jié)構(gòu)。2）可擴增性：在革蘭氏陰性細(xì)菌中，質(zhì)粒的復(fù)制一般有兩種形式，即嚴(yán)緊型復(fù)制和松弛型復(fù)制。嚴(yán)緊型質(zhì)粒在宿主細(xì)菌的正常生長過程中，每個細(xì)胞通常只能復(fù)制少數(shù)幾個拷貝；而松弛型質(zhì)粒當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成減弱或完全中斷時，質(zhì)粒復(fù)制仍能持續(xù)進行，因此這類質(zhì)粒在每個宿主細(xì)胞中通常具有較高的拷貝數(shù)（3050）。作為一種極端的情況，當(dāng)宿主細(xì)胞進入生長后期，加入氯霉素（終濃度為10170ug/ml）抑制蛋白質(zhì)的生物合成，阻斷宿主菌的大部分代謝途徑，則松弛型質(zhì)粒利用豐富的原料及能量大量復(fù)制，最終每個細(xì)胞可以積累上千個DNA分子，這種操作稱為質(zhì)粒的氯霉素擴增。3）可轉(zhuǎn)移性：部分

39、質(zhì)粒含有tra基因，指令宿主細(xì)胞產(chǎn)生菌毛，合成細(xì)胞表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞接合，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一細(xì)胞中。含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。一般說來，這類質(zhì)粒的分子量比較大，拷貝數(shù)比較少，并且宿主廣，比較不安全。用于構(gòu)建克隆載體的質(zhì)粒一般是非接合質(zhì)粒，雖不含有tra基因，但是有bom位點（oriT位點）和mob基因，當(dāng)宿主細(xì)胞同時存在含有mob基因的質(zhì)粒和接合質(zhì)粒時，mob基因產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位點，借助于接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動遷移到受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用。4）不相容性：具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于

40、同一受體細(xì)胞內(nèi)，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。2構(gòu)建理想質(zhì)粒載體必須具備的條件1）質(zhì)?？截悢?shù)較高：質(zhì)粒拷貝數(shù)是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基條件下,每個細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。2）分子量較小：一般說來，分子量低的通常拷貝數(shù)較高，克隆時所預(yù)期的基因產(chǎn)物的數(shù)量較大，質(zhì)粒的限制性酶的切點相應(yīng)減少，有可能找到合適的單一限制性酶切位點，外源DNA容量較大，且轉(zhuǎn)化效率高，當(dāng)質(zhì)粒大于15 kb時，將成為轉(zhuǎn)化效率的制約因素。另外，小分子量質(zhì)粒在進行遺傳工程操作時容易掌握，容易分離，不易斷裂。3）帶有可供選擇的標(biāo)記：常采用的標(biāo)記是對某種抗生素的抗性，如氨芐青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四

41、環(huán)素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因內(nèi)有若干單一限制酶切點。在克隆時通過單一酶切點插入外源基因，使該抗性基因失活、宿主菌變?yōu)閷υ摽股孛舾械木辏@樣極易檢查到克隆是否成功。還可利用-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)來選擇。載體上帶有一個來自大腸桿菌的lac操縱子的DNA區(qū)段，這一區(qū)段編碼-半乳糖苷酶氨基端的一個蛋白片段。IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷)可以誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的-半乳糖苷酶羧基端的一個蛋白片段互補(互補)。故暴露于誘導(dǎo)物IPTG的細(xì)菌含有編碼lacZ基因的質(zhì)?？赏瑫r合成該酶的兩種片段，該菌在含生色底物X-ga1(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的培

42、養(yǎng)基上生長，將形成藍(lán)色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上利用乳糖產(chǎn)酸生成紅色菌落。將多克隆位點克隆入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插人質(zhì)粒的多克隆位點后可使-半乳糖苷酶氨基端片段滅活，從而破壞了互補作用。帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。利用這種篩選方法可方便地將含目的基因的重組子篩選出來。4）帶有盡可能多的單一限制性酶切位點：單一的限制性酶切位點可供外源DNA定點插人；較多不同的單一限制酶酶切位點可有選擇地供帶有不同末端的外源基因插入。目前常用載體上的多克隆位點(MCS)即具有該功能。5）具有復(fù)制起始點：這是質(zhì)粒自我增殖所必不可少的基本條件，也是決定質(zhì)?？截悢?shù)的重要元件，可使繁殖后的細(xì)胞維持一定

43、數(shù)量的質(zhì)粒拷貝數(shù)。一般情況下,一個質(zhì)粒只含有一個復(fù)制起始點，構(gòu)成一個獨立的復(fù)制子。但穿梭質(zhì)粒含有兩個復(fù)制子，以確保其在兩類細(xì)胞中均能得到擴增。3質(zhì)粒載體的改造與構(gòu)建外源基因克隆的目的不同，對質(zhì)粒載體的性能要求也不同。野生型質(zhì)粒存在著這樣或那樣的缺陷，不能滿足需要，必須對之進行修飾和改造，其指導(dǎo)思想是：1）刪除不必要的DNA區(qū)域，盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。2）滅活某些質(zhì)粒的編碼基因，如促進質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的mob基因，杜絕重組質(zhì)粒擴散污染環(huán)境，保證DNA重組實驗的安全，同時滅活那些對質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)的基因，提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。3）加入易于識別的選擇標(biāo)記基因，最好是

44、雙重或多重標(biāo)記，便于檢測含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。4）在選擇性標(biāo)記基因內(nèi)引入具有多種限制性內(nèi)切酶識別及切割位點的DNA序列，即多克隆接頭，便于多種外源基因的重組，同時刪除重復(fù)的酶切位點，使其單一化，以便環(huán)狀質(zhì)粒分子經(jīng)酶處理后，只在一處斷裂,保證外源基因的準(zhǔn)確插入。5）根據(jù)外源基因克隆的不同要求，分別加裝特殊的基因表達調(diào)控元件。載體質(zhì)粒的改造通常需要一系列體內(nèi)體外的重組程序，可參見質(zhì)粒pBR322及其衍生物的構(gòu)建過程。4質(zhì)粒的命名原則1976年提出了一種質(zhì)粒命名的原則，用小寫字母p代表質(zhì)粒，在p字母后面用兩個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒炇颐Q。如pUC19，UC是構(gòu)建該質(zhì)粒研究單位的名稱（

45、University of California），19代表構(gòu)建的一系列質(zhì)粒的編號。5質(zhì)粒的分類及用途人工構(gòu)建的載體質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分為下列幾類。1）克隆質(zhì)粒。這類質(zhì)粒常用于克隆和擴增外源基因。2）測序質(zhì)粒。這類質(zhì)粒通常高拷貝復(fù)制，并含有多種酶切口的接頭片段，便于各種DNA 片段的克隆與擴增，在多酶切口接頭片段的兩端鄰近區(qū)域，設(shè)有兩個不同的引物序列，使得重組質(zhì)粒經(jīng)堿變性后，即可進行DNA測序反應(yīng)。3）整合質(zhì)粒。含有整合酶編碼基因以及整合特異性的位點序列，克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因進入受體細(xì)胞后，能準(zhǔn)確地重組整合在受體細(xì)胞染色體DNA的特定位點上。4）穿梭質(zhì)粒。這類質(zhì)粒分子上含有兩個親緣關(guān)

46、系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿棱質(zhì)粒等。5）探針質(zhì)粒。這類載體被設(shè)計用來篩選克隆基因的表達調(diào)控元件，如啟動子和終止子等。它通常裝有一個可以定量檢測其表達程度的報告基因(如抗生素的抗性基因)，但缺少相應(yīng)的啟動子或終止子，因此載體分子本身不能表達報告基因，只有當(dāng)含有啟動子或終止子的外源DNA片段插入到載體合適的位點上，報告基因才能表達，而且其表達量的大小直接反映了被克隆的基因表達控制元件的強弱。6）表達質(zhì)粒。這類載體在多克隆位點的上游和下游分別裝載轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子、合適的核糖體結(jié)合位點(SD-序

47、列)以及強有力的終止子結(jié)構(gòu)，使得克隆在合適位點上的任何外源基因均能在受體細(xì)胞中高效表達。6常用的質(zhì)粒載體（一）克隆載體1）pSC101質(zhì)粒pSC101質(zhì)粒是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細(xì)胞僅有l(wèi)一2個拷貝。其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因。現(xiàn)已知道，該質(zhì)粒對于EcoR、Hind III、BamH I、Sal、hol、Pvu II等幾種核酸內(nèi)切限制酶，都只具有單切割位點，其中在Hind III、BamH I和Sal等3個位點克隆外源DNA，都會導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活。pSC101質(zhì)粒具有可插入外源DNA的EcoR單克隆位點的優(yōu)越性，而且不影響四環(huán)

48、素抗性的選擇記號。它就被選用為第一個真核基因的克隆載體。但是這個質(zhì)粒載體也有其明顯的缺點，它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從寄主細(xì)胞中提取pSC101 DNA，其產(chǎn)量就要比通常使用的其它質(zhì)粒載體低得多。2）ColEl質(zhì)粒研究得最為詳盡的Col類質(zhì)粒是ColEl，ColEl質(zhì)粒是屬于松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，用它作基因克隆的載體，可以克服pSC101質(zhì)粒載體的低拷貝、低產(chǎn)量的缺點。在正常的生長條件下，加入氯霉素擴增，每個寄主細(xì)胞中所累積的ColEl質(zhì)粒拷貝數(shù)可達10003000個之多，此時質(zhì)粒DNA大約可占細(xì)胞總DNA的50%左右。3）pBR322質(zhì)粒載體 pBR322質(zhì)粒載體是人工構(gòu)建

49、的較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體。具有低分子量、高拷貝、兩種抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記以及外源DNA插入不影響復(fù)制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點等優(yōu)點。pBR322質(zhì)粒載體來源于3個親本質(zhì)粒：質(zhì)粒上的氨芐青霉素抗性基因來自于pSF2124，四環(huán)素抗性基因來自于pSC101，ColE松弛型復(fù)制子（ori）來自于pMB1。4）pUC系列多克隆位點(multiple cloning sites，MCS)技術(shù)的使用，極大地簡化了質(zhì)粒載體的改造過程。pUC載體就是以pBR322質(zhì)粒載體為基礎(chǔ)，在其5'-端加入了一段帶有多克隆位點的lacZ'基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載

50、體系列。一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括如下四個組成部分：（1）來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(ori)；（2）氨芐青霉素抗性基因，但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識別位點；（3）大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼該基因氨基端a-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因；（4）位于lacZ'基因中的靠近5端的一段多克隆位點(MCS)區(qū)段，內(nèi)含十幾個單一的限制性內(nèi)切酶識別切割位點，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入載體中。但它并不破壞該基因的功能。pUC質(zhì)粒載體系列是目前基因工程研究中最通用的克隆載體之一，與pB

51、R322載體相比pUC質(zhì)粒載體具有以下優(yōu)點：（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322載體基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時，僅保留其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點，使其分子大小相應(yīng)地縮小了許多。同時，pUC18質(zhì)粒的拷貝數(shù)比帶有pMBl或ColEl復(fù)制起點的質(zhì)粒載體都要高得多，不經(jīng)氯霉素擴增，平均每個細(xì)胞即可達500700個拷貝。（2）便于重組子的檢測。pUC18質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ'基因，所編碼的a-肽鏈可參與a-互補作用，用X-gal顯色法一步實現(xiàn)對重組子克隆的鑒定。（3）具有多克隆位點(MCS)區(qū)段。正是由于具有MCS序列，可以使具兩種不同粘性末

52、端(如EcoR和BamH l)的外源DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到pUC18質(zhì)粒載體上。由于PCR產(chǎn)物的兩端并非絕對平整，在絕大多數(shù)的產(chǎn)物分子的3'端均突出一個堿基A，如果用平整末端的載體與其連接效率極低。因此，目前許多生物試劑公司推出PCR產(chǎn)物的專用克隆載體，包括pUC-T。它們的基本骨架與相應(yīng)的載體系列基本相同，只是在線形化的質(zhì)粒載體的平整末端的5'端有一突出的堿基T，利用該特點，使載體與PCR產(chǎn)物之間產(chǎn)生了小的互補粘端，使PCR產(chǎn)物的克隆效率大幅度提高。（二）表達載體表達載體需要有一個強啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列；有SD序列且該序列與起始密碼子ATG之間要有合適的

53、距離；在克隆基因與啟動子之間有正確的閱讀框架；外源基因下游有轉(zhuǎn)錄終止子等。pKK表達質(zhì)粒載體：pKK質(zhì)粒的啟動子為Ptac。由大腸桿菌強啟動子Ptrp和Plac雜合組成。pKK233-3表達載體含有Ptac啟動子、lacE的RBS、pUC8的多克隆位點，在遠(yuǎn)端還有一個rrnB的轉(zhuǎn)錄終止信號。pET載體：對全世界許多研究者，Novagen的pET系統(tǒng)已成為在大腸桿菌中蛋白表達的首選。該系統(tǒng)成功的一個主要原因是目標(biāo)基因被克隆到不為大腸桿菌RNA聚合酶識別的T7啟動子之下，在加入T7 RNA聚合酶之前幾乎沒有表達發(fā)生。克隆到載體的目標(biāo)基因是關(guān)閉的，不會因產(chǎn)生的蛋白對細(xì)胞有毒性而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定。重組

54、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到染色體上含有一拷貝由lacUV5控制的T7 RNA聚合酶基因的表達宿主中并通過加入IPTG誘導(dǎo)表達；也可通過ICE6感染原始克隆宿主菌來提供T7 RNA聚合酶。使用大腸桿菌啟動子系統(tǒng)（如tac、lac、trc、pL）有困難的許多基因已在該系統(tǒng)穩(wěn)定克隆和表達。T7 RNA聚合酶的選擇性和活性使得幾乎所有細(xì)胞資源都用于目標(biāo)基因的表達，誘導(dǎo)后幾小時目標(biāo)基因產(chǎn)物就可超過細(xì)胞總蛋白的50。第二節(jié) 病毒（噬菌體）載體噬菌體(bacteriophage，簡稱phage)是一類細(xì)菌病毒的總稱。其結(jié)構(gòu)比質(zhì)粒要復(fù)雜，噬菌體的DNA分子除了復(fù)制起點之外，還有編碼外殼蛋白質(zhì)的基因。噬菌體也可以用于克隆和擴增

55、特定的DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。噬菌體顆粒外殼是蛋白質(zhì)分子，內(nèi)部的核酸一般是雙鏈線性DNA分子，也有的是雙鏈環(huán)形DNA、單鏈線性DNA、單鏈環(huán)形DNA及單鏈RNA等多種形式。噬菌體的感染效率極高，達到了令人生畏的地步。一個噬菌體顆粒感染了一個細(xì)菌細(xì)胞之后，便可迅速地形成數(shù)百個子代噬菌體顆粒，而每一個子代顆粒又能夠各感染一個新的細(xì)菌細(xì)胞，再產(chǎn)生出數(shù)百個子代顆粒，如此只要重復(fù)4次感染周期，一個噬菌體顆粒便能夠使數(shù)十億個的細(xì)菌細(xì)胞致死。若是在瓊脂平板上感染生長的細(xì)菌，釋放出來的噬菌體便可以迅速地吸附到鄰近的細(xì)菌細(xì)胞上，重復(fù)發(fā)生感染周期，這種細(xì)菌的裂解反應(yīng)是以最初被感染的細(xì)胞所在的位置為中

56、心，慢慢地向四周擴展，最后在瓊脂平板上形成大量的噬菌斑，即感染的細(xì)菌細(xì)胞被噬菌體裂解之后留下的空斑。噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶原周期兩種不同的類型。溶菌周期是指噬菌體吸附到寄主細(xì)胞表面后，注入DNA，噬菌體DNA進行復(fù)制及蛋白質(zhì)合成，并組裝成子代噬菌體顆粒，最后使寄主細(xì)胞破裂，釋放出子代噬菌體顆粒。我們將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫做烈性噬菌體。溶原生長周期是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。溫和噬菌體是既能進入溶菌生命周期又能進入溶原生命周期的噬菌體。溶原性細(xì)菌是具有一套完整的噬菌體基因組的細(xì)菌。用溫和噬菌體感染細(xì)菌

57、培養(yǎng)物使之形成溶原性細(xì)菌的過程，叫做溶原化。在溶原性細(xì)菌內(nèi)存在的整合或非整合的噬菌體DNA叫原噬菌體。整合是指噬菌體DNA已插入到寄主細(xì)菌染色體之中。以游離DNA分子形式存在的噬菌體DNA叫非整合噬菌體DNA。1l-雙鏈DNA噬菌體載體 l噬菌體，可能是迄今為止研究得最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體。有關(guān)l噬菌體的研究歷史，是同現(xiàn)代分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立與發(fā)展的過程密切相關(guān)的。大家所熟悉的DNA雙向復(fù)制機理的揭示、轉(zhuǎn)錄的終止作用和抗終止作用蛋白質(zhì)的分離、DNA連接酶和促旋酶的發(fā)現(xiàn)，以及位點特異的重組作用和SOS復(fù)制修復(fù)機理的闡明等等，都是以l噬菌體為材料做出的重要的研究成果。l噬菌

58、體是一種中等大小的溫和噬菌體。lDNA為線狀雙鏈分子，長度為48502bp。迄今已經(jīng)定位的l噬菌體的基因至少有61個，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動，我們稱這類基因為l噬菌體的必要基因；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因為l噬菌體的非必要的基因。取代了非必要基因的外源基因可以隨寄主細(xì)胞一道復(fù)制和增殖，這是l噬菌體賴以發(fā)展作為基因克隆載體的一種重要特性。lDNA兩端具有由12個核苷酸組成的粘性末端（這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點），可用來構(gòu)建柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能容納大片段的外源DNA插入，對構(gòu)建真核基因組片段的基因文庫是特別有用的載體。1）l DNA載體的構(gòu)建 lDNA可通過噬菌體特異性感染高效進入宿主細(xì)胞或受體細(xì)胞，噬菌體空殼蛋白對lDNA的包裝與其序列無關(guān)，以及l(fā)-DNA在大腸桿菌細(xì)胞中的高拷貝復(fù)制，這是l-DNA在分子克隆技術(shù)發(fā)展早期就被選作載體使用的原因。野生型的l-DNA本身存在著種種缺陷，必須對之進行多方面的改造，才能滿足一個理想載體的要求，這些改造的內(nèi)容包括如下幾個方面：（1）縮短野生型l-DNA的長度，提高外源DNA片段的有效裝載量。l-DNA的包裝范圍為l-DNA總長的75%105%