基因芯片本科畢業(yè)論文范文

1、學(xué)科分類號(hào) 本 科 畢 業(yè) 論 文 題 目（中文）： 基因芯片篩選斑馬魚胚胎FBL基因相關(guān)差異表達(dá)基因及信號(hào)通路 （英文）： Gene chip filter the related genes and signal pathways of zebrafish emybryo FBL gene 姓 名 彭湃 學(xué) 號(hào) 2006150308 院 （系） 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、年級(jí) 生物科學(xué) 2006級(jí) 指導(dǎo)教師 莫小陽 副教授 二一年 四 月湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文誠(chéng)信聲明本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)議，除文中已經(jīng)注

2、明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 本科畢業(yè)論文作者簽名：（親筆簽名） 二一年 月 日（打印）一、湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文開題報(bào)告書 （本頁全打?。┱?文 題 目作 者 姓 名所屬院、專業(yè)、年級(jí) 院 專業(yè) 年級(jí)指導(dǎo)教師姓名、職稱預(yù)計(jì)字?jǐn)?shù)開題日期選題的根據(jù)：1）說明本選題的理論、實(shí)際意義 2）綜述國(guó)內(nèi)外有關(guān)本選題的研究動(dòng)態(tài)和自己的見解主要內(nèi)容：研究方法： （打?。┩瓿善谙藓筒扇〉闹饕胧海ù蛴。┲饕獏⒖假Y料：（打?。┲笇?dǎo)教師意見： （指導(dǎo)教師手寫）簽 名

3、： （親筆簽名） 年 月 日開 題 報(bào) 告 會(huì) 紀(jì) 要時(shí)間 （記錄人手寫） 地點(diǎn)（記錄人手寫）與會(huì)人員（記錄人手寫）姓 名職務(wù)（職稱）姓 名職務(wù)（職稱）姓 名職務(wù)（職稱）會(huì)議記錄摘要：（記錄人手寫）會(huì)議主持人簽名：記錄人簽名：年 月 日指導(dǎo)小組意見（由負(fù)責(zé)人本人手寫）負(fù)責(zé)人簽名： 年 月 日學(xué) 院 意 見負(fù)責(zé)人簽名： 年 月 日湖 南 師 范 大 學(xué) 學(xué)院指導(dǎo)教師指導(dǎo)畢業(yè)論文情況登記表論文（設(shè)計(jì)）題 目學(xué)生姓名所屬專業(yè)、年級(jí) 專業(yè) 級(jí)指導(dǎo)教師姓名職 稱學(xué) 歷指導(dǎo)時(shí)間指導(dǎo)地點(diǎn)指 導(dǎo) 內(nèi) 容學(xué)生簽名備 注 二、湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文評(píng)審表 （本頁打?。┱撐念}目斑馬魚基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析作者姓名彭

4、湃所屬院、專業(yè)、年級(jí)生科 院 生物科學(xué)專業(yè)2006年級(jí)指導(dǎo)教師姓名、職稱莫小陽副教授字 數(shù)定稿日期中文摘要本文對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因干擾相關(guān)基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了信息學(xué)分析，篩選得到差役表達(dá)基因534個(gè)，信號(hào)通路119 條，分析發(fā)現(xiàn)wnt信號(hào)通路，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路等，與斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因功能相關(guān)，研究結(jié)果為研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程中這些基因即信號(hào)通路與胚胎發(fā)育的關(guān)系提供了基礎(chǔ)，加深了對(duì)胚胎發(fā)育機(jī)理的理解。關(guān)鍵詞（3-5個(gè)）斑馬魚 基因芯片 心臟發(fā)育英文摘要In this paper, zebrafish embryos FBL siRNA expression

5、microarray data related to information analysis, and render screened 534 genes, signal pathway 119, analysis wnt signaling pathway, transforming growth factor- signaling pathway, MAPK signaling pathway and so on, and the zebra fish embryo development FBL gene function related to the study results du

6、ring the embryonic development of zebrafish genes that these signaling pathways and embryo development provides the foundation to deepen the understanding of the mechanism of embryonic development.關(guān)鍵詞（3-5個(gè)）Zebra fish Gene chip Heart development畢業(yè)論文指導(dǎo)教師評(píng)定成績(jī)（本頁由指導(dǎo)教師手寫）評(píng)審基元評(píng)審要素評(píng)審內(nèi)涵滿分實(shí)評(píng)分選題質(zhì)量30%目的明確符合要求選

7、題符合專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)，體現(xiàn)學(xué)科、專業(yè)特點(diǎn)和綜合訓(xùn)練的基本要求10理論意義或?qū)嶋H價(jià)值符合本學(xué)科的理論發(fā)展，有一定的學(xué)術(shù)意義；對(duì)經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)發(fā)展的應(yīng)用性研究中的某個(gè)理論或方法問題進(jìn)行研究，具有一定的實(shí)際價(jià)值10選題恰當(dāng)題目規(guī)模適當(dāng)5難易度適中5能力水平35%查閱文獻(xiàn)資料能力能獨(dú)立查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，歸納總結(jié)本論文所涉及的有關(guān)研究狀況及成果，并恰當(dāng)運(yùn)用5綜合運(yùn)用知識(shí)能力能運(yùn)用所學(xué)專業(yè)知識(shí)分析、研究和闡述問題；論文內(nèi)容有適當(dāng)?shù)纳疃取V度和難度10研究方案的設(shè)計(jì)能力整體思路清晰；研究方案合理可行5研究方法和手段的運(yùn)用能力能運(yùn)用本學(xué)科常規(guī)研究方法及相關(guān)研究手段（如計(jì)算機(jī)、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備等）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、實(shí)踐并加工

8、處理、總結(jié)信息10外文應(yīng)用能力能閱讀、翻譯一定量的本專業(yè)外文資料、外文摘要和外文參考書目（特殊專業(yè)除外）體現(xiàn)一定的外語水平5論文質(zhì)量35%文題相符較好地完成論文選題的目的要求5寫作水平論點(diǎn)鮮明；論據(jù)充分；條理清晰；語言流暢10寫作規(guī)范符合學(xué)術(shù)論文的基本要求。用語、格式、圖表、數(shù)據(jù)、量和單位、各種資料引用規(guī)范化、符合標(biāo)準(zhǔn)10論文篇幅文科類不少于10000字，理工科類不少于7000字，藝體類不少于5000字，外國(guó)語言文學(xué)類不少于5000個(gè)實(shí)詞。5成果的理論或?qū)嶋H價(jià)值成果富有一定的理論深度和實(shí)際運(yùn)用價(jià)值 5正文部分成績(jī)（上表）：總成績(jī)：評(píng)定等級(jí)：外文資料譯文成績(jī)：指導(dǎo)教師評(píng)審意見： 指導(dǎo)教師簽名：

9、說明：此表指標(biāo)部分為正文部分計(jì)分表，正文部分成績(jī)實(shí)評(píng)總分×0.9，外文資料譯文成績(jī)滿分為10分?？偝煽?jī)正文部分成績(jī)外文資料譯文成績(jī)。評(píng)定成績(jī)分為優(yōu)秀、良好、中等、及格、不及格五個(gè)等級(jí)，總成績(jī)90100分記為優(yōu)秀，8089分記為良好，7079分記為中等，6069分記為及格，60分以下記為不及格。若譯文成績(jī)?yōu)榱?，則不計(jì)總成績(jī)，評(píng)定等級(jí)記為不及格。三、湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文答辯記錄表論文題目（打印）作者姓名（打?。┧鶎僭骸I(yè)、年級(jí)（打?。┰?專業(yè) 年級(jí)指導(dǎo)教師姓名、職稱（打?。┐?辯 會(huì) 紀(jì) 要時(shí)間（記錄人手寫）地點(diǎn)（記錄人手寫）答辯小組成員（記錄人手寫）姓 名職務(wù)（職稱）姓 名職務(wù)（

10、職稱）姓 名職務(wù)（職稱）答辯中提出的主要問題及回答的簡(jiǎn)要情況記錄：（記錄人手寫）會(huì)議主持人簽名：（親筆簽名）記錄人簽名：（親筆簽名）年 月 日 （記錄人手寫）答辯小組意見評(píng)語：（負(fù)責(zé)人手寫）評(píng)定等級(jí)：（負(fù)責(zé)人手寫） 負(fù)責(zé)人（簽名）： （負(fù)責(zé)人手寫） 年 月 日學(xué)院意見評(píng)語：論文學(xué)院最終評(píng)定等級(jí)： 負(fù)責(zé)人（簽名）： 學(xué)院（公章） 年月 日學(xué)校意見評(píng)語：評(píng)定等級(jí)： 負(fù)責(zé)人（簽名）： 年月 日43目錄中文摘要1英文摘要1一、前言211斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)的基因及信號(hào)通路5 1，1.1 相關(guān)基因介紹5 11.2 相關(guān)信號(hào)通路介紹712Morpholino技術(shù)1013，具體到FBL基因的研究進(jìn)展1114基

11、因芯片技術(shù)12二、材料和方法1421生物信息學(xué)軟件1422Morpholino1423基因芯片1424信息分析方法16三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果17四、討論3041Wnt signaling pathway（ WNT信號(hào)途徑）3042VEGF signaling pathway（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)途徑）3143Calcium signaling pathway(鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑) 3244Parkinson's disease（帕金森氏癥）3245MAPK signaling pathway（MAPK信號(hào)通路）3346Regulation of actin cytoskeleton（肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架

12、調(diào)節(jié)）3447TGF-beta signaling pathway（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-信號(hào)通路）3448Leukocyte transendothelial migration（白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮遷移）3649Oxidative phosphorylation(氧化磷酸化) 36410Ribosome（核糖體）36411Cell Communication（細(xì)胞通訊）37412Cell cycle(細(xì)胞周期) 39413. Ubiquitin mediated proteolysis（泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解）39五、參考文獻(xiàn)41致謝43摘要 基因芯片篩選斑馬魚胚胎FBL基因相關(guān)差異表達(dá)基因及信號(hào)通路 彭湃

13、湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)2006級(jí)摘要：本文對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因干擾相關(guān)基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了信息學(xué)分析，篩選得到差役表達(dá)基因534個(gè)，信號(hào)通路119 條，分析發(fā)現(xiàn)wnt信號(hào)通路，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路等，與斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因功能相關(guān)，研究結(jié)果為研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程中這些基因即信號(hào)通路與胚胎發(fā)育的關(guān)系提供了基礎(chǔ)，加深了對(duì)胚胎發(fā)育機(jī)理的理解。關(guān)鍵詞： 斑馬魚 基因芯片 心臟發(fā)育 FBL基因Gene chip filter the related genes and signal pathways of zebrafish emybryo FBL gen

14、e Pai PengGrade 2006, biological science，College of life science，Hunan Normal UniversityAbstract：In this paper, zebrafish embryos FBL siRNA expression microarray data related to information analysis, and render screened 534 genes, signal pathway 119, analysis wnt signaling pathway, transforming grow

15、th factor- signaling pathway, MAPK signaling pathway and so on, and the zebra fish embryo development FBL gene function related to the study results during the embryonic development of zebrafish genes that these signaling pathways and embryo development provides the foundation to deepen the understa

16、nding of the mechanism of embryonic development.Key words： Zebrafish Gene chip Heart development FBL gene前言斑馬魚是研究發(fā)育生物學(xué)的新興模式動(dòng)物。斑馬魚由于具有飼育容易、胚胎透明、體外受精、突變種多、遺傳學(xué)工具成熟等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育與人類遺傳疾病的新興模式動(dòng)物。與其他脊椎動(dòng)物相較下，斑馬魚最大的優(yōu)點(diǎn)就是具有多達(dá)6,000多種的遺傳突變種，這些突變種的建立大致上是利用X射線、ENU或反轉(zhuǎn)錄病毒的感染造成基因組的突變，之后再經(jīng)由多次的子代篩選所得。這些突變種的表征包含如胚

17、層分化，器官發(fā)育，生理調(diào)適與行為表現(xiàn)等多方面，所以可提供研究人員極佳的正向遺傳學(xué)材料來進(jìn)行發(fā)育機(jī)制上的研究。另外在斑馬魚系統(tǒng)中也開發(fā)出阻斷基因功能的工具-Morpholino，可快速以逆向遺傳學(xué)手法來驗(yàn)證基因的功能。所以正向遺傳學(xué)與逆向遺傳學(xué)的巧妙利用，可以正確推導(dǎo)出斑馬魚遺傳發(fā)育途徑。以下簡(jiǎn)述斑馬魚胚胎發(fā)育過程：斑馬魚的繁殖周期約7天左右，一年可連續(xù)繁殖6-7次。我們把斑馬魚的胚胎發(fā)育分為7個(gè)時(shí)期。分別為受精卵期，卵裂期，囊胚期，原腸胚期，分節(jié)期，咽胚期和孵化期，然后進(jìn)入幼魚階段。時(shí)期hpf描述受精卵期0受精卵完成了第一次細(xì)胞分裂。卵裂期0.75第2至第7個(gè)細(xì)胞周期（第8、9）過渡到較長(zhǎng)的、

18、不同步的。囊胚期2.25從快速的、同步的細(xì)胞周期（第8、9個(gè)）過渡到較長(zhǎng)的、不同步的細(xì)胞周期；然后開始進(jìn)行外包。原腸胚期5.25包括內(nèi)卷、集中和外延在內(nèi)的形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)形成了上胚層、下胚層以及胚軸；直至完成外包過程。分節(jié)期10體節(jié)、咽弓原基、神經(jīng)原節(jié)開始發(fā)育；開始進(jìn)行主要器官發(fā)生；出現(xiàn)最早的運(yùn)動(dòng)；出現(xiàn)尾巴。咽胚期24身體軸線開始從卵黃囊周圍的曲線逐漸伸直；循環(huán)系統(tǒng)、色素形成和鰭都開始發(fā)育。孵化期48完成主要器官的快速形態(tài)發(fā)生；頭部和胸鰭的軟骨開始發(fā)育；孵化不同步的發(fā)生。幼魚期72鰾開始充氣；出現(xiàn)覓食及主動(dòng)躲避行為。 1細(xì)胞 2細(xì)胞 4細(xì)胞 8細(xì)胞 早期囊胚 中期囊胚 晚期囊胚 原腸胚期 24小時(shí)

19、 一天 兩天 三天 幼魚 成魚1斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)的基因及信號(hào)通路相關(guān)基因介紹：1.1 NKX2.5 心臟特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子是在早期的心臟區(qū)域被激活表達(dá)的。其中，一個(gè)最早的在臟前體細(xì)胞中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子是NKX2.5。對(duì)于心臟前體細(xì)胞的分化最早的研究來源于果蠅。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅中tinman基因的突變抑制了果蠅心臟的形成。tinman基因編碼的是homeobox轉(zhuǎn)錄因子，這個(gè)因子屬于Nk2基因家族。nkx2.5是該基因家族的另外一個(gè)成員。在目前研究的椎動(dòng)物中nkx2.5于側(cè)板中胚層中正在分化的心肌細(xì)胞中表達(dá)，并且它的表達(dá)貫穿于心臟發(fā)育的整個(gè)過程。在人和老鼠的心臟發(fā)育過程中，nkx2.5 的突變

20、都能導(dǎo)致心臟發(fā)育的嚴(yán)重缺陷。由于 nkx2.5基因表達(dá)有高度的特異性和保守性， 以及它在心臟形成過程中的重要作用，tinman/nkx2.5已經(jīng)成為研究心肌細(xì)胞分化的焦點(diǎn)，研究者也在盡力尋找nkx2.5上游的調(diào)控基因。目前，對(duì)于斑馬魚突變株faust（fau）和acerebellar（ace）的研究結(jié)果表明，他們影響了 NKX2.5在心臟前體細(xì)胞中的表達(dá)，并且NKX2.5的起始表達(dá)需要 fau/gata5， 而其表達(dá)的維持則需要 ace/fgf8。但到目前為止還沒有真正找到nkx2.5上游的直接調(diào)控因子。1.2 BMP2 在心臟的特化過程中，心肌原始細(xì)胞產(chǎn)生于前端的側(cè)板中胚層 （ALPM），位

21、于前端側(cè)板中胚層下方的前端內(nèi)胚層對(duì)于調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)就有著重要的調(diào)節(jié)作用。目前的試驗(yàn)也證實(shí)了前端內(nèi)胚層對(duì)于誘導(dǎo)和維持心臟分化進(jìn)程的重要作用。內(nèi)胚層能夠分泌FGFs、Activin和BMP等多種信號(hào)分子。其中，BMP2 能夠在非心臟的區(qū)域誘導(dǎo)心肌細(xì)胞marker基因的表達(dá)。Noggin和BMPs分子高度親和從而阻止了體外培養(yǎng)的側(cè)板中內(nèi)胚層心肌細(xì)胞的分化。心臟分化起初不穩(wěn)定，需要一個(gè)持續(xù)不變動(dòng)的環(huán)境刺激來保證心臟分化的穩(wěn)定發(fā)生。在斑馬魚和非洲爪蟾中這種穩(wěn)定性就是依賴于BMP信號(hào)途徑，因此，BMP2的存在限定了心臟區(qū)域起始分化的界限。1.3 GATA 基因家族 GATA家族是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄

22、因子，在心臟的形成中也具有重要的作用。在脊椎動(dòng)物的心臟中表達(dá)3種GATA基因：gata 46。在斑馬魚中，GATA5的功能與老鼠中 GATA4的功能類似。斑馬魚gata 5由faust位點(diǎn)編碼，對(duì)faust突變體的研究表明，在早期的胚胎發(fā)育過程中，GATA5對(duì)于產(chǎn)生正常數(shù)量的心肌前體細(xì)胞以及維持一些心肌特異表達(dá)的基因，包括 nkx2.5的表達(dá)水平有重要作用。同時(shí)心臟原始細(xì)胞向胚胎中軸遷移的過程也需要GATA5的參與，因此gata 5的突變體會(huì)導(dǎo)致兩側(cè)的心臟原始細(xì)胞最終不能融合而形成心臟二分（CardiaBifida）的表型。GATA5 的過量表達(dá)還導(dǎo)致nkx2.5的異位表達(dá)以及形成異位的具有心

23、肌細(xì)胞跳動(dòng)功能的細(xì)胞團(tuán)。目前在斑馬魚和非洲爪蟾中越來越多的試驗(yàn)證明，用反義morpholino寡聚核苷鏈工具使gata 6基因的功能缺失后，心臟細(xì)胞的分化受到了影響。GATA6 的這種作用更多地體現(xiàn)在心臟原始細(xì)胞的成熟過程中，而不是起始誘導(dǎo)的過程。在斑馬魚中已經(jīng)證明了GATA 基因在對(duì)nkx2.5的調(diào)控和心肌細(xì)胞分化中的貢獻(xiàn)。據(jù)報(bào)道，GATA基因和NKX2.5在蛋白質(zhì)水平有直接的相互作用，從而調(diào)控了ANF、CARP（cardiac restricted ankyrin repeat protein）啟動(dòng)子等基因的表達(dá)。GATA4和NKX2.5共同結(jié)合到ANF基因的啟動(dòng)子上，發(fā)揮著協(xié)同的激活效應(yīng)

24、：GATA4的碳末端結(jié)合NKX2.5碳末端有自主抑制功能的結(jié)構(gòu)域后，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，進(jìn)而暴露出NKX2.5 的激活結(jié)構(gòu)域。在這個(gè)過程中，GATA5 能夠替代GATA4和NKX2.5相互作用。因此NKX2.5能募集GATA4或者GATA5形成轉(zhuǎn)錄的激活復(fù)合體，激活下游某些心臟特異基因的表達(dá)。相關(guān)的重要信號(hào)途徑： 1.4 WNT11信號(hào)途徑對(duì)心臟原始細(xì)胞會(huì)聚過程的調(diào)控在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程中，許多器官的前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化都是位于體軸的兩側(cè)，隨后朝著胚胎中軸會(huì)聚，最后組裝成一個(gè)最原始的器官。心臟的發(fā)育過程也遵循這樣的過程，首先在斑馬魚 6 個(gè)體節(jié)發(fā)育時(shí)期，心肌的前體細(xì)胞從前端的側(cè)板中胚層分化出

25、來并且位于體軸的兩側(cè)。隨后這兩側(cè)的細(xì)胞再向中間遷移，最終會(huì)聚形成原始的管狀心臟。如果這一過程受阻，兩側(cè)的細(xì)胞不能正常會(huì)聚，則會(huì)出現(xiàn)心臟二分的表型。2000年Heisenberg的研究小組指出，在斑馬魚中，wnt11非經(jīng)典信號(hào)途徑調(diào)節(jié)了原腸運(yùn)動(dòng)中的向中會(huì)聚和延伸的過程（Convergence and Extension Movement）。而后又有研究確定了非經(jīng)典的Wnt 信號(hào)途徑中參與這一過程的一些分子。后來的研究又進(jìn)一步證明了斑馬魚胚胎的會(huì)聚延伸運(yùn)動(dòng)需要Wnt非經(jīng)典途徑中的一些胞內(nèi)分子，包括RhoA、Rac1、Cdc42和JNK等。同時(shí)Wnt4a和Wnt11r又被確定為調(diào)節(jié)會(huì)聚延伸過程的2個(gè)

26、新型分子。而且同時(shí)下調(diào)Wnt4a和Wnt11r 或者下調(diào)Wnt4a或Wnt11r與Slb/wnt11的組合，相比下調(diào)單個(gè)分子而言，會(huì)聚延伸過程將出現(xiàn)更嚴(yán)重的缺陷。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游有很多的分枝， 涉及這一過程調(diào)控的有Dvl/RhoA 分枝，另外還有Rho Kinase2分枝。在非洲爪蟾和老鼠的研究中還發(fā)現(xiàn)， Wnt11 信號(hào)途徑還參與了心臟細(xì)胞的分化， 以及心臟可收縮表型的誘導(dǎo)。而在雞胚的研究中卻發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管分泌的Wnt信號(hào)能抑制前端鄰近的軸旁中胚層心臟的形成。但是在斑馬魚中，目前還沒有關(guān)于Wnt 信號(hào)是否對(duì)于心臟分化有影響的研究報(bào)道。這也說明關(guān)于Wnt 信號(hào)通路在斑馬魚心臟發(fā)育過程中的作

27、用還有待進(jìn)一步的研究。1.5 BMP4在心臟環(huán)化過程中的調(diào)控當(dāng)斑馬魚心臟前體細(xì)胞向中融合之后，就會(huì)沿前后軸延伸形成心管。在胚胎24h的時(shí)候，心管呈現(xiàn)出向胚胎左側(cè)傾斜的趨勢(shì)。隨后，心管的位置又逐漸返回到體軸中線。經(jīng)過48h之后，心室向右偏轉(zhuǎn)，心房則向左偏轉(zhuǎn)，這樣心房心室之間形成了一定的彎曲角度，且位于身體的左側(cè)，這個(gè)過程就是心臟的環(huán)化過程。如果在 24h 時(shí)期，心管是向胚胎的右側(cè)傾斜，則到 48h，心臟環(huán)化的方向?qū)⑾喾?，心臟位于斑馬魚的右側(cè)。從整個(gè)過程來看，斑馬魚心臟的左右不對(duì)稱性在心臟環(huán)化過程之前就已經(jīng)形成了。胚胎發(fā)育 20 體節(jié)的時(shí)期（心管融合時(shí)期），BMP4 在心臟區(qū)域就有非常特異的表達(dá)，

28、而且正好呈現(xiàn)了不對(duì)稱性（其他一些基因如nkx2.5、mef2都是對(duì)稱表達(dá)的）。這個(gè)時(shí)期，BMP4為一環(huán)形表達(dá)區(qū)域，位于頭部中后腦邊界上方，并且左側(cè)側(cè)板中胚層的表達(dá)強(qiáng)于右側(cè)側(cè)板中胚層的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，如果心臟BMP4 不對(duì)稱表達(dá)模式的改變，將會(huì)影響心臟的環(huán)化過程。shh在很多系統(tǒng)中都證明位于 BMP4 途徑的上游。在斑馬魚中注射了shh mRNA之后，BMP4的表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)心臟的環(huán)化過程就受到了影響。跟據(jù)報(bào)道，以斑馬魚為模型，采用能夠熱激活的斑馬魚系，研究 BMP4 信號(hào)在左右對(duì)稱中的影響發(fā)現(xiàn)，BMP信號(hào)主要影響了發(fā)育的2個(gè)時(shí)期。一是斑馬魚體節(jié)形成階段，在右側(cè)的側(cè)板中胚層區(qū)域BMP4抑制了sp

29、w的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)了內(nèi)臟和心臟的左右不對(duì)稱性。在 Kupffers vesicle中BMP4通過調(diào)節(jié)lefty1的表達(dá)抑制了spw的表達(dá)。二是在體節(jié)形成階段晚期，BMP信號(hào)途徑不再調(diào)節(jié)內(nèi)臟發(fā)育的不對(duì)稱性，但是仍然調(diào)節(jié)心臟左右發(fā)育的不對(duì)稱性。試驗(yàn)結(jié)果表明，BMP4對(duì)右側(cè)側(cè)板中胚層中spw表達(dá)的抑制，位于Nodal 信號(hào)途徑的上游。而在更晚的階段，后側(cè)的側(cè)板中胚層中則位于Nodal信號(hào)途徑的下游，調(diào)節(jié)著心臟的環(huán)化過程。心臟是人體生存和活動(dòng)必不可少的重要器官，因此人類的某些先天性心臟疾病或者后天形成的心臟疾病的研究就成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門。對(duì)心臟發(fā)育過程中基因表達(dá)調(diào)控的研究有助于人們找到這些疾病的根

30、源，找到重要的藥物靶標(biāo)，指導(dǎo)預(yù)防干預(yù)先天性心臟病發(fā)生或者心血管疾病的治療。目前對(duì)于心臟發(fā)育的研究已經(jīng)深入分子研究的層次。但是從目前的研究成果不難發(fā)現(xiàn)，確定和尋找到的這些基因大多數(shù)都屬于發(fā)育生物學(xué)中的經(jīng)典信號(hào)途徑，并且這些基因或者信號(hào)途徑本身在發(fā)育過程中都具有多重身份，調(diào)節(jié)多個(gè)發(fā)育環(huán)節(jié)，甚至調(diào)節(jié)多種器官的發(fā)育。對(duì)心臟發(fā)育的影響也只是其中的一種角色。因此，它們屬于發(fā)育調(diào)控過程中較上游的基因，而非控制心臟發(fā)育所特有的信號(hào)途徑。這樣設(shè)計(jì)的致病方案或者篩選的藥物將不能精確地作用于心臟疾病，還可能影響到其他方面。因此在這個(gè)領(lǐng)域，研究者面臨的最大挑戰(zhàn)就是要尋找更多下游的、對(duì)心臟發(fā)育具有特異調(diào)控作用的分子和信

31、號(hào)途徑。這是深入了解心臟發(fā)育全過程的迫切需要，對(duì)指導(dǎo)臨床醫(yī)學(xué)有重要的意義。2Morpholino技術(shù)嗎啉基又稱嗎啉（英語：Morpholino），是一種用來修飾基因表現(xiàn)的分子，嗎啉基寡核苷酸是一種反義技術(shù)，可用來阻礙其它分子與特定核酸序列的結(jié)合?？勺钃鮎NA上約25個(gè)堿基的區(qū)域。此分子可應(yīng)用在一些模式生物的研究上，包括小鼠、斑馬魚、Xenopus（一類青蛙）等。嗎啉寡聚合苷酸（Morpholino oligonucleotides，MF）由美國(guó)著名的Gene Tools，LLC公司開發(fā)，是非離子型DNA類似物，其中的核糖被嗎啉代替（是以含有氮和氧的六元環(huán)代替RNA的五元核糖骨架）磷酸二酯鍵ph

32、osphoroamidate所取代，是進(jìn)行反義抑制的有效方法。Zebrafish Morphoinos文庫包括上千個(gè)寡核苷酸序列，每個(gè)寡核苷酸序列都是針對(duì)目標(biāo)序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的序列互補(bǔ)而設(shè)計(jì)的，在目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄起始端形成穩(wěn)定的RNA-RNA雙鏈，通過阻礙mRNA和核糖體的結(jié)合而抑制翻譯的起始，它能減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應(yīng)，快速誘導(dǎo)蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。實(shí)驗(yàn)證明這種結(jié)合是高度特異性的，長(zhǎng)25個(gè)堿基的MF-RNA中僅有4個(gè)堿基的錯(cuò)配就可以造成抑制的目的基因翻譯能力的完全喪失。由于Morphoinos寡核苷酸具有靶基因結(jié)合的高度特異性以及極強(qiáng)的核苷酶抗性，因此可以長(zhǎng)效的、特異性誘導(dǎo)目

33、標(biāo)基因的表達(dá)下調(diào)。Morphoinos以嗎啉環(huán)類似物為基架，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性使得Morphoinos具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：1.與其它類型的反義寡核苷酸相比，Morphoinos能更好地抵抗核酸酶的作用；2.Morphoinos與靶序列結(jié)合后通過空間位阻效應(yīng)發(fā)揮作用，不激活RNaseH，不引起目標(biāo)基因mRNA的降解；3.針對(duì)翻譯起始區(qū)設(shè)計(jì)的Morphoinos用于抑制蛋白的翻譯，針對(duì)pre-mRNA剪切位點(diǎn)區(qū)設(shè)計(jì)的Morphoinos可影響mRNA剪切，得到不同的轉(zhuǎn)錄本，可以方便的用于目標(biāo)基因結(jié)構(gòu)域的突變研究；4.與靶細(xì)序列結(jié)合能力強(qiáng)，可以滲入mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且特異性好。3.具體到FBL基因

34、的研究進(jìn)展根據(jù)MHC等位型特異的多肽結(jié)合基序,可以設(shè)計(jì)出與MHC分子結(jié)合的多肽,這可崐以通過體外實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)中采用MHC分子表達(dá)缺陷的細(xì)胞(RMA-S細(xì)胞)與相崐應(yīng)的多肽共育一定時(shí)間后,可誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MHC分子,這可能是缺陷細(xì)胞表達(dá)不穩(wěn)定的MHC重鏈,2M復(fù)合體,當(dāng)與多肽結(jié)合后就形成三分子的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),使得MHC分子在崐細(xì)胞表面表達(dá)增加。因此用合成多肽來驗(yàn)證多肽的MHC結(jié)合性可以選用這一方法,它可以作為篩選多肽抗原的第一步。如果多肽不與MHC分子形成穩(wěn)定結(jié)合,則它很崐難被MHC分子從胞內(nèi)遞呈出來。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明,預(yù)測(cè)的7個(gè)多肽均能與H-2Db分子結(jié)合。 合成多肽抗原性驗(yàn)證的第二步,是將多肽與表

35、達(dá)同一MHC分子的無關(guān)靶細(xì)胞共育,使多肽與靶細(xì)胞表面MHC分子結(jié)合,而后觀察特定抗原CTL細(xì)胞對(duì)多肽致敏靶細(xì)胞的殺傷活性,如果CTL能殺傷靶細(xì)胞,表明這一多肽可能被克隆CTL的TCR所識(shí)別,即為CTL所識(shí)別的抗原2。在實(shí)驗(yàn)中把FBL-3誘導(dǎo)的活化淋巴細(xì)胞(未經(jīng)過克隆的細(xì)胞)作為效應(yīng)細(xì)胞,觀察到它們明顯地殺傷Gag3,Gag5結(jié)合的EL-4,間接表明預(yù)測(cè)的7個(gè)多肽中,這二個(gè)多肽很可能是FBL-3的腫瘤抗原。 用FBL-3特異CTL殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證多肽的抗原性仍是間接的方法。合成多肽驗(yàn)證的第三步是用多肽替代FBL-3作體內(nèi)免疫,觀察免疫小鼠能否建立抗FBL-3的免疫反應(yīng)。如果多肽確實(shí)是FBL-3的抗原

36、,用它免疫小鼠應(yīng)誘發(fā)免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗FBL-3的效應(yīng)。表1和表2顯示,多肽體內(nèi)免疫可誘導(dǎo)多肽特異的CTL產(chǎn)生,表明它的免疫原性是確實(shí)存在的。但用Gag3,Gag5體內(nèi)免疫后均不能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的抗FBL-3腫瘤免疫反應(yīng),用FBL-3攻擊免疫鼠與未免疫鼠的存活期并無明顯差別。表明這二個(gè)多肽有別于FBL-3的腫瘤抗原。為什么FBL-3-CTL崐識(shí)別的多肽體內(nèi)免疫不能誘導(dǎo)能夠殺傷FBL-3的CTL產(chǎn)生呢?難道CTL識(shí)別的多肽與誘導(dǎo)這一CTL的多肽間有一定的差別嗎?報(bào)道表明,一條多肽可以誘導(dǎo)一組不同識(shí)別格局CTL的產(chǎn)生,克隆CTL可以殺傷1-3個(gè)位點(diǎn)突變多肽致敏的靶細(xì)胞。認(rèn)為CTL TCR僅識(shí)別1到2個(gè)

37、關(guān)鍵氨基酸,并不是對(duì)多肽全序列的識(shí)別行為。因此我們認(rèn)為,FBL-3CTL對(duì)靶細(xì)胞結(jié)合多肽的識(shí)別很可能屬于這類情況。 T細(xì)胞表位或腫瘤抗原的預(yù)測(cè)是當(dāng)前免疫學(xué)熱門課題,但尚處于初步階段。我們選用腫瘤原性較強(qiáng)的FBL-3細(xì)胞,預(yù)測(cè)出可能表達(dá)的7個(gè)多肽,實(shí)驗(yàn)證明多肽體內(nèi)免疫可以誘導(dǎo)多肽特異CTL的產(chǎn)生,但有意義多肽免疫后不能建立抗FBL-3免疫反應(yīng),此與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,提出以CTL作為檢測(cè)多肽抗原性的效應(yīng)細(xì)胞具有一定的局限性。因此在深入研究中,將采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)綜合考查,同時(shí)擴(kuò)大從Friend病毒基因序列預(yù)測(cè)多肽的范圍,和從FBL-3細(xì)胞表面酸洗抗原混合液中尋找腫瘤抗原,此工作正在進(jìn)行之中。4.基因芯

38、片技術(shù)基因芯片技術(shù)是指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。早在八十年代，Bains W.等人就將短的DNA片斷固定到支持物上，借助雜交方式進(jìn)行序列測(cè)定。但基因芯片從實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技術(shù)和照相平板印刷技術(shù)的有機(jī)結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術(shù)的引入。它使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計(jì)的探針分子切實(shí)可行，而且借助激光共聚焦顯微掃描技術(shù)使得可以對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)和分析。正如電子管電路向晶體管電路和集成電路發(fā)展是所經(jīng)歷的那樣，核酸雜交技術(shù)的

39、集成化也已經(jīng)和正在使分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)生著一場(chǎng)革命?，F(xiàn)在全世界已有十多家公司專門從事基因芯片的研究和開發(fā)工作，且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。主要代表為美國(guó)Affymetrix公司。該公司聚集有多位計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)和分子生物學(xué)專家，其每年的研究經(jīng)費(fèi)在一千萬美元以上，且已歷時(shí)六七年之久，擁有多項(xiàng)專例。產(chǎn)品即將或已有部分投放市場(chǎng)，產(chǎn)生的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益令人瞻目。  基因芯片技術(shù)由于同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對(duì)樣品大量序列進(jìn)行檢測(cè)和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（Southern Blotting和Northern Blotting等）技術(shù)操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)

40、量少、檢測(cè)效率低等不足。而且，通過設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測(cè)定、實(shí)變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測(cè)序等。材料和方法材料1生物信息學(xué)軟件北京博奧生物有限公司的MAS系統(tǒng)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心/gene 用于查找基因的功能。美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心/pubmed用于查找信號(hào)途徑的功能。谷歌搜索 CNKI翻譯助手方法1Morpholino根據(jù)所要研究的斑馬魚基因序列設(shè)計(jì)特定的Morphoinos Antisense片段，將特定

41、的Morphoinos片段溶于雙蒸水中配成3mM的儲(chǔ)液，置于-20保存。以KCL溶液（0.2M）稀釋Morphoinos儲(chǔ)液0.1mM-0.5mM濃度梯度，選擇1-16細(xì)胞周期的斑馬魚胚胎向植物極進(jìn)行顯微注射。注射完畢，將胚胎置于28培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2基因芯片目前已有多種方法可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即原位合成（in situ synthesis）與合成點(diǎn)樣兩種。支持物有多種如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護(hù)基建立共價(jià)連接；作點(diǎn)

42、樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負(fù)電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等。原位合成法主要為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（Light-directed synthesis），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導(dǎo)聚合技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。半導(dǎo)體技術(shù)中曾使用照相平板技術(shù)法在半導(dǎo)體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術(shù)是當(dāng)前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術(shù)成熟且已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽陣列提供了一條快捷的途徑。  以合成寡核苷酸探針為例，該技術(shù)主要步驟為

43、：首先使支持物羥基化，并用光敏保護(hù)基團(tuán)將其保護(hù)起來。每次選取擇適當(dāng)?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其它部們不透光。這樣，光通過蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護(hù)。因?yàn)楹铣伤玫膯误w分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護(hù)基的保護(hù)，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應(yīng)后仍舊帶有光敏保護(hù)基團(tuán)。因此，每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應(yīng)被活化，以及所用單體的種類和反應(yīng)次序就可以實(shí)現(xiàn)在待定位點(diǎn)合成大量預(yù)定序列寡聚體的目的。后一方法在多聚物的設(shè)計(jì)方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的DNA或多肽固相合成儀完成，只是合成后用特殊的自動(dòng)化微量點(diǎn)樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜

44、、尼龍膜或玻片上。支持物應(yīng)事先進(jìn)行特定處理。3信息分析方法3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析步驟如下：1）、數(shù)據(jù)準(zhǔn)備，第一列為基因symbol、ID 或探針I(yè)D，后面可以附帶數(shù)值，通常為fold change2）、用戶登陸用。3）、登陸后，首先點(diǎn)擊按扭，新建項(xiàng)目4）、填寫項(xiàng)目相關(guān)信息，然后submit5）、進(jìn)入分析列表，點(diǎn)擊紅色標(biāo)記按扭，新建分析任務(wù)。6）、填寫分析任務(wù)信息，提交分析數(shù)據(jù)。輸入的分子類型可以是gene、mRNA、miRNA、protein等，每種類型支持多種ID，可以選擇性的輸出結(jié)果。7）、submit 后，點(diǎn)擊任務(wù)列表中的執(zhí)行按扭，出現(xiàn)提示，點(diǎn)擊確定，即開始運(yùn)行。8）、結(jié)果展示，左邊為結(jié)

45、果目錄，點(diǎn)擊各目錄，在右邊將顯示詳細(xì)結(jié)果，點(diǎn)擊右上角的excel 符號(hào)，即可保存結(jié)果。3.2基因及信號(hào)途徑功能分析進(jìn)入NCBI的官方網(wǎng)站（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）/。通過站內(nèi)搜索，在Gene中可以搜索到基因的功能和該基因的相關(guān)信息。在PubMed能搜索到信號(hào)途徑的過程和功能。也可以在谷歌的學(xué)術(shù)搜索中來搜索我們想要知道的基因及信號(hào)途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，將斑馬魚基因芯片試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，導(dǎo)入北京博奧生物有限公司的MAS系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到以下與斑馬魚發(fā)育相關(guān)的信號(hào)途徑及基因方面的分析結(jié)果。見下表：PathwayNameGeneApopt

46、osisAKT2ApoptosisTP53Toll-like receptor signaling pathwayAKT2Toll-like receptor signaling pathwayFOSToll-like receptor signaling pathwayMAP3K7Toll-like receptor signaling pathwayTBK1RibosomeRPSARibosomeRPL4RibosomeRPL18ARibosomeRPL21RibosomeRPL23ARibosomeRPL27RibosomeRPL36ALRibosomeRPL37RibosomeRPS1

47、5ARibosomeRPS19RibosomeRPS24RibosomeRPS25RibosomeRPS26RibosomeRPS29RibosomeRPL35T cell receptor signaling pathwayAKT2T cell receptor signaling pathwayCDC42T cell receptor signaling pathwayFOST cell receptor signaling pathwayNRAST cell receptor signaling pathwayMAP3K7Synthesis and degradation of keto

48、ne bodiesACAT1Fatty acid elongation in mitochondriaHADHAFatty acid elongation in mitochondriaHADHBChronic myeloid leukemiaACVR1BChronic myeloid leukemiaAKT2Chronic myeloid leukemiaCRKChronic myeloid leukemiaCTBP2Chronic myeloid leukemiaHDAC1Chronic myeloid leukemiaNRASChronic myeloid leukemiaTP53Fc epsilon R