實驗二微生物培養(yǎng)基的配置與滅菌

1、實驗報告課程名稱：環(huán)境微生物學實驗 實驗類型：綜合實驗實驗項目名稱：微生物培養(yǎng)基的使用與滅菌學生姓名： 專業(yè)：環(huán)境工程學號： 同組學生姓名： 指導老師： 實驗地點： 實驗日期：2018年 9月23日裝訂線一、實驗目的和要求（必填）二、實驗內(nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設(shè)備（系統(tǒng)、軟件或平臺）四、操作方法與實驗步驟五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理六、實驗結(jié)果與分析（必填）七、討論、心得注：不同類型的實驗課對實驗報告可有不同要求，各個學科的實驗報告可以根據(jù)自己的學科特點做適當?shù)恼{(diào)整，但上述基本內(nèi)容中的第一、二、六條為必須填寫的內(nèi)容。一、實驗目的和要求1. 了解微生物培養(yǎng)基的種類及其配制原理，掌握微生物培養(yǎng)基

2、的配制程序。2. 學習并掌握牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基和淀粉瓊脂培養(yǎng)基的配制方法。3. 了解幾種滅菌方法與手法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其操作方法。二、實驗內(nèi)容和原理1. 培養(yǎng)基：指由人工配制的、話合不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)。一般要求:提供微生物正常生活所需的各種養(yǎng)料(如碳源、氣源、無機鹽類、生長因子、水等)并保持養(yǎng)料間的平衡；具有適宜的ph、合適的滲透壓、合適的氧化還原電位；保持無菌狀態(tài)。2. 培養(yǎng)基的選擇與設(shè)計原則(1)目的明確原則:應根據(jù)微生物得種類以及培養(yǎng)的目的采用不同類型的培養(yǎng)基。對于不同的微生物，培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比也不同

3、。例如枯草芽胞桿菌，在一般培養(yǎng)時使用肉湯培養(yǎng)基、在觀察培養(yǎng)時使用生芽胞培養(yǎng)基、在產(chǎn)蛋白酶過程培養(yǎng)中使用以玉米粉、黃豆餅粉為原料的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。(2)營養(yǎng)協(xié)調(diào)原則:微生物細胞組成元素的調(diào)查或分析，是培養(yǎng)基設(shè)計的重要參考依據(jù)。根據(jù)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)要選用不同的培養(yǎng)基，例如細菌使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、放線菌使用高氏一號合成培養(yǎng)基、酵母菌使用麥芽汁培養(yǎng)基、霉菌使用察氏合成培養(yǎng)基。同時培養(yǎng)基也需根據(jù)微生物的生長需要配置不同的營養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比的培養(yǎng)基，例如高濃度的糖類物質(zhì)、重金屬離子等不能促進微生物生長，反而起到抑制的作用。(3)理化適宜原則:指培養(yǎng)基的ph值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢等物理化學條件較為

4、適宜。(4)經(jīng)濟節(jié)約:配制培養(yǎng)基時應盡量利用廉價且易獲得的原料作為培養(yǎng)基組份，特別是在發(fā)酵工業(yè)中，以降低生產(chǎn)成本?？梢怨I(yè)生產(chǎn)中廢棄物作為培養(yǎng)微生物的原料，如制糖工業(yè)中的含有蔗糖的廢液、乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液、豆制品工業(yè)的廢液、造紙工業(yè)中含戊糖和己糖的亞硫酸紙漿等都可以是制作培養(yǎng)基的原料。在工業(yè)上甲烷發(fā)酵主要利用廢水及廢渣作為原料，而在農(nóng)村中也普遍以糞便及肥草等作為甲烷發(fā)酵的原料。3. 培養(yǎng)基的種類1、 按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分區(qū)分根據(jù)對培養(yǎng)組成物質(zhì)的化學成分是否完全了解來區(qū)分，可以將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。（1）天然培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物

5、的原料，其成分難以確切知道，雖然不能確切知道它的化學成分，但一般來講，營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，所以較為常用，尤其適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基和大生產(chǎn)上的培養(yǎng)基。（2）合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是一類化學成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學成分的化學藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學成分精確、重復性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。（3）半合成培養(yǎng)基。在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。如果在合成培養(yǎng)基中加入瓊脂，由

6、于瓊脂中含有較多的化學成分不太清楚的雜質(zhì)，故也只能算是半合成培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。2、 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)區(qū)分培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三類。（1）固體培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計數(shù)和菌種保存等方面。用于微生物分離，鑒定，計數(shù)。如圖，微生物分離成菌落、菌苔。圖中為大腸桿菌菌落，適用涂布平板法得到。（2）半固體培養(yǎng)基。是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半固體狀態(tài)?？捎糜谟^察細菌的運動、鑒定菌種和測定噬菌體的效價等方面。常用于觀察微生物運動特征。（3）液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中不

7、加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，適于作生理等研究，由于發(fā)酵率高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。瓊脂含量主要功效固體培養(yǎng)基1.5%-2.0%微生物分離，鑒定，計數(shù)等半固體培養(yǎng)基0.5%-0.8%觀察微生物運動特征、鑒定菌種等液體培養(yǎng)基無大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實驗室進行微生物的基礎(chǔ)理論和應用方面的研究3、 按培養(yǎng)基的用途區(qū)分(1)起礎(chǔ)培養(yǎng)基。無選擇性地滿足一般微生物生長需要的培養(yǎng)基。如:牛肉旁蛋白胨培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基。(2)加富培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一些特殊營養(yǎng)物質(zhì)。如血液。血清、組織液或生長因子等，用以培養(yǎng)對營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物。如:培養(yǎng)百日咳桿菌需要

8、含有血液的培養(yǎng)基。(3)選擇培養(yǎng)基。利用某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或特殊環(huán)境要求，在培養(yǎng)基中加入某些特殊物質(zhì)。抑制非目的微生物生長。促進目的微生物生長。如:馬丁氏cmartin)培養(yǎng)基。(4)鑒別培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種化學試劑。某種微生物在該培養(yǎng)基上生長，其所產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與化學試劑發(fā)生特征性反應，以此鑒定該種微生物。如: emb培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基等。4. 凝固劑:凝固劑必須具有的特點:不被微生物液化、分解和利用；在微生物生長的溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)凝固點的溫度對微生物無害；不因消毒滅菌的高溫處理而破壞；透明度好、粘著力強；配制方便、價格低廉。常見凝固劑：凝固劑成分凝固點/熔

9、點優(yōu)點與用途瓊脂(洋菜)多糖凝固點42c.熔點96c來源廣泛易大量獲得、價格使宜、用量少(1.5-2%)、絕大多數(shù)微生物不能水解利用。明膠蛋白質(zhì)凝固點20c，熔化點24c常用于配制鑒別培養(yǎng)基。進行細菌的生理生化鑒定硅膠無機硅酸鈉、硅酸鉀和鹽酸、硫酸進行中和反應產(chǎn)生凝固就不再融化常用于自養(yǎng)型微生物的分離5. 消毒與滅菌目標目的差別消毒(disinfection)殺死或除去特定環(huán)境中的致病微生物使微生物數(shù)量減少到不能引起人發(fā)病不一定能殺死含芽抱的細菌滅菌(sterilization)殺死或除去特定環(huán)境中的所有微生物去除所有微生物殺死包括細菌與細菌芽孢、抱子6. 主要滅菌方法(1)干熱滅菌法。如：火

10、焰灼燒(適用接種環(huán))、熱空氣滅菌(適用玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品)(2)濕熱滅菌法。如：高壓蒸汽滅菌(適用含水分、不怕受潮的物品)、間歇滅菌(適用不耐熱培養(yǎng)基)(3)過濾除菌。如：蔡氏濾器、針式微孔過濾器(適用不能加熱滅菌的也體物致，如維生素、血清等)(4)紫外線滅菌。原理：誘導胸腺嘧啶二聚體的形成，抑制微生物dna復制；輻射使空氣中的氧氣轉(zhuǎn)為臭氧、h2o轉(zhuǎn)為h2o2此二者皆有殺菌作用。但由于紫外線穿透力弱，因此紫外線殺菌只適用于物體表面的除菌。(4)儀器。干熱滅菌器(160170c，1.52h)、高壓蒸汽滅菌器(121c、1520min)三、主要儀器設(shè)備（必填）1. 藥品和試劑:干粉培養(yǎng)基

11、(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基。馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基) .1mo1/l hc1，1mo1/l. naoh。2. 儀器：天平，電磁爐，高壓蒸汽滅菌鍋，電熱烘箱。3. 破離器皿:培養(yǎng)山帶硅膠塞的試管。帶鋁蓋的試管。移液管，裝有玻璃珠的三角瓶，涂布棒，量筒，錐形瓶。玻棒等。4. 其它物品:刻度搪瓷杯，藥匙，稱量紙，ph精密試紙，線繩，牛皮紙，報紙，棉花，滅菌指示膠帶等。四、操作方法和實驗步驟1. 培養(yǎng)基的制備1、 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)基稱取營養(yǎng)瓊脂干粉培養(yǎng)基6.6g加水至200ml加熱煮沸至完全溶解(用玻棒不斷攪拌，一旦沸騰立即將搪瓷杯移開，沸騰3次) 調(diào)ph7. 2-7.4,定容至200ml趁

12、熱分裝(用細玻棒引流)：試劑瓶(藍蓋)裝40ml，共4瓶、硅膠塞試管裝5ml，共5只貼上滅菌指示膠帶，標注培養(yǎng)基名稱，班級，組別，日期置于搪瓷杯中，統(tǒng)一包裝2、 淀粉瓊脂培養(yǎng)基放線菌培養(yǎng)基稱取高氏一號干粉培養(yǎng)基7.5g加水至200ml加熱煮沸至完全溶解(用玻棒不斷攪拌，一旦沸騰立即將搪瓷杯移開，沸騰3次) 調(diào)ph7. 2-7.4,定容至200ml趁熱分裝(用細玻棒引流)：試劑瓶(藍蓋)裝40ml，共4瓶、硅膠塞試管裝5ml，共5只貼上滅菌指示膠帶，標注培養(yǎng)基名稱，班級，組別，日期置于搪瓷杯中，統(tǒng)一包裝3、 馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基稱取馬鈴薯蔗糖干粉干粉培養(yǎng)基9.4g加水至200ml加熱煮

13、沸至完全溶解(用玻棒不斷攪拌，一旦沸騰立即將搪瓷杯移開，沸騰3次) 調(diào)ph7. 2-7.4,定容至200ml趁熱分裝(用細玻棒引流)：試劑瓶(藍蓋)裝40ml，共4瓶、硅膠塞試管裝5ml，共5只貼上滅菌指示膠帶，標注培養(yǎng)基名稱，班級，組別，日期置于搪瓷杯中，統(tǒng)一包裝2. 無菌操作1、 棉花塞制作(1個1人); 加塞時，應使棉塞長度的1/3在試管口外， 2/3在試管口內(nèi)，如圖1所示，做塞的棉花要選纖維較長的棉花。 2、 玻璃器皿的包裝：培養(yǎng)皿包裝;錐形瓶包裝;移液管包裝;三角玻棒包裝移液管包裝錐形瓶包裝3、 培養(yǎng)基配制(1種/組)、培養(yǎng)基分裝、包扎(4瓶/組，40ml/瓶;5支/組, 5m試管蒸

14、餾水分裝(4根/組; 9ml根) ;滅菌、斜面放置(2人大組)。五、討論、心得本次的實驗內(nèi)容雖然簡單卻是微生物相關(guān)實驗的基礎(chǔ)。在培養(yǎng)基的配置上，我們小組負責的是年肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制作，加熱培養(yǎng)基液體時因為來不及移開杯子導致有一兩滴培養(yǎng)基灑落在臺面上，因此下次配置時應注意，培養(yǎng)基液體一沸騰就要馬上將搪瓷杯移開停止加熱，另外在培養(yǎng)基分裝時要盡可能的快速，以免培養(yǎng)基凝固在杯子中無法分裝，最后再清洗搪瓷杯時要等殘余的培養(yǎng)基液體干透后就能清液將凝固的培養(yǎng)基清除。而在移液管包裝時一開始也不太順手，包裝用的報紙總是不夠長，最后才抓到技巧，即一開始就要將報紙與移液管擺成小于30度的位置，因為之后再卷報紙時每

15、卷報紙卷的間距會越來越小，因此使用這樣的技巧可以比較容易的進行包裝。六、思考題1. 微生物生長與氧化還原電位的關(guān)系?氧化還原電位反映了水中所有物質(zhì)表現(xiàn)出來的宏觀氧化還原性，單位一般用ev表示，通常以ph=7時為標準，記為eh。氧化還原電位主要受環(huán)境中氧的影響，同時也受環(huán)境的ph值以及環(huán)境中的具有氧化還原性質(zhì)物質(zhì)的影響。氧化還原電位對微生物的生長繁殖及存活有很大影響。隨著氧化還原電位的降低，各種微生物的活性隨之發(fā)生改變，首先表現(xiàn)在氮呼吸，產(chǎn)生氨氮、亞硝酸鹽;繼續(xù)降低，是鐵錳呼吸，三價鐵逐漸被還原成二價鐵，這個過程耗氧產(chǎn)酸，ph下降;若繼續(xù)降低便是硫呼吸，原本存在的硫酸根被還原成硫化氫，硫化氫跟亞

16、鐵離子反應，黑臭現(xiàn)象凸顯;最后極度缺氧情況下，有機質(zhì)分解產(chǎn)生甲烷，也就是俗稱的“沼氣”。一般好氧微生物在eh值+100mv以上均可生長，+300+400mv的最合適。厭氧性微生物只能在eh值低于+100mv以下生長,在-100mv以下生長較好。兼性厭氧微生物在+100mv以上時進行好氧呼吸，在+100mv以下時進行發(fā)酵。2. 培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么?配制固體培養(yǎng)基加入瓊脂加熱熔化時要注意哪些問題?在制作微生物的培養(yǎng)基的過程中，可以通過添加瓊脂作為凝固劑來將液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基。加熱熔化時要注意1.加熱器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸騰和把培養(yǎng)基燒焦；太低，培養(yǎng)基

17、容易凝固。2.受熱要均勻，可以墊上石棉網(wǎng)，要用玻璃棒不停緩慢攪拌。3.加熱完畢后，要在合適的溫度（60左右）倒平板，防止凝固。3. 干熱滅菌、高壓蒸汽滅苗和間歇滅菌的原理有何不同，各適用于哪些場合和物品?三者皆是屬于加熱滅菌，指利用高溫使蛋白質(zhì)凝固變性的方法。(1)干熱滅菌是利用干熱空氣或火焰使細菌的原生質(zhì)凝固，并使細菌的酶系統(tǒng)破壞而殺死細菌的方法。多用于容器及用具的滅菌，條件溫度為160170度加熱1.52h，如火焰灼燒(適用接種環(huán))、熱空氣滅菌(適用玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品)。(2)高壓蒸汽滅菌系指在密閉的高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，利用壓力大于常壓的飽和水蒸汽來殺滅微生物的方法。具有滅菌完全可靠、效果好、時間短、易于控制等優(yōu)點，能殺滅所有繁殖體和芽胞，條件是加熱到121度1520分鐘，常用于普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌。(3)間歇滅菌是在常壓下，于不密閉的滅菌箱內(nèi)，用 100 流通蒸汽 30-60 分鐘來殺滅微生物的方法來殺滅微生物，必須待二至三天芽胞開始繁殖的時候再次滅菌如此反復三次就可。本法適用于 1-2ml 注射劑及不耐高溫的品種如血清等物質(zhì)，但不能保證殺滅所有的芽胞，所以最好要加抑菌劑。4. 如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底?把滅菌后的培