基質(zhì)金屬蛋白酶-13在退變和創(chuàng)傷椎間盤(pán)髓核中的不同表達(dá)

1、基質(zhì)金屬蛋白酶-13在退變和創(chuàng)傷椎間盤(pán)髓核中的不同表達(dá) 鄧迎豐 方向明 陸繼業(yè)【摘要】目的：比較基質(zhì)金屬蛋白酶-13（mmp-13）在退變和創(chuàng)傷椎間盤(pán)髓核中的不同表達(dá)，探討mmp-13在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的作用。方法：本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意后，隨機(jī)將于2011年1月至7月期間在寧波大學(xué)附屬醫(yī)院中33例因“椎間盤(pán)突出癥”行髓核摘除和6例因“外傷性脊椎骨折”行內(nèi)固定的病人納入為研究對(duì)象。采用免疫組化方法檢測(cè)其髓核組織的mmp-13的表達(dá)，image-proplus5.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其灰度值。結(jié)果：椎間盤(pán)退變組和創(chuàng)傷組髓核組織中檢測(cè)到mmp-13的陽(yáng)性表達(dá)率分別為為73.2%

2、和20.4%（p<0.05），）且兩組間的圖像灰度值有顯著性差異，明顯高于創(chuàng)傷組，退變組中mmp-13水平是創(chuàng)傷組的 3.5倍（p<0.05）。結(jié)論： 椎間盤(pán)退變髓核組織中mmp-13顯著增高，mmp-13的異常表達(dá)可能在腰椎間盤(pán)退變發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。【關(guān)鍵詞】 椎間盤(pán)退變；基質(zhì)金屬蛋白酶13different expression of metalloproteinasel-13 in degenerative andtraumatic intervertebral nucleus pulposus deng ying feng*，fang xiang ming，lu

3、ji ye*first affiliated h ospital zhe jiang university，hangzhou 310000 chinacorresponding autho：fang xiang ming，first affiliated hospital zhe jiang university，hangzhou 310000 china，email:xiangming_【abstract】objective: to compare the expression of metalloproteinasel-13 in the nucleus pulpos

4、us, and investigate the possible role of matrix metalloproteinasel-13 in the pathogenesis of lumbar intervertebral disc degeneration. methods: after the approval of ethnical committee and the achievement of consence from patients, 33 patients with lumbar intervertebral disc degeneration and 6 patien

5、ts with lumber vertebrae fracture were enrolled. immunohistochemistry assay was used to detect the expression of mmp-13 from the nucleus pulposus. results: in disc degeneration and vertebrae fracture group, the expression of mmp-13 was detected in 73.2% and 20.4% respectively（p<0.05）. furthermore

6、, the mmp-13 level was significantly increased in disc degeneration group, with a 250% elevation （p<0.05）.conclusion: this study demonstrated that the expression of mmp-13 was significantly elevated in disc degeneration, and imply that mmp-13 might play an important role in the emergence and deve

7、lopment of the disc degeneration.【key word】intervertebral disc degeneration；matrix metalloproteinase 13基金項(xiàng)目：浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程作者單位：杭州 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬一院 鄧迎豐（現(xiàn)在寧波大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科工作） 方向明 通訊作者：方向明 email: xiangming_fang 椎間盤(pán)退變是腰椎間盤(pán)突出、腰椎管狹窄、下腰痛等疾病的重要病理基礎(chǔ)。椎間盤(pán)退變的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與髓核細(xì)胞的減少和細(xì)胞外基質(zhì)的降解密切相關(guān)，其中基質(zhì)成分的改變是椎間盤(pán)力學(xué)特征喪失的直接原因?；?/p>

8、質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，mmps）作為基質(zhì)降解酶，在髓核組織的基質(zhì)合成與降解失平衡、基質(zhì)成分紊亂的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用1-2 。最近的研究觀察到，在腰椎間盤(pán)退變的大鼠模型及重組白介素-1刺激體外單層培養(yǎng)的人椎間盤(pán)髓核細(xì)胞中均觀察到mmp-13表達(dá)的異常345。提示，mmp-13的表達(dá)和活性異?？赡茉谒韬思?xì)胞外基質(zhì)合成分解代謝失衡、椎間盤(pán)突變中起著關(guān)鍵作用。因此，本研究比較了退變椎間盤(pán)病人和創(chuàng)傷病人椎間盤(pán)髓核組織中mmp-13的表達(dá)，并初步探討mmp-13表達(dá)水平變化在椎間盤(pán)退變發(fā)生中的作用。對(duì)象與方法一、對(duì)象 本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情

9、同意后，隨機(jī)將2011年1月2011年7月寧波大學(xué)附屬醫(yī)院因腰椎間盤(pán)突出癥而手術(shù)的髓核標(biāo)本33例，分別取自腰3、4或腰4、5或腰5骶1。其中男性15例，女性18例。平均年齡43歲。均為慢性起病。病史平均26年，經(jīng)保守治療效果差，其髓核病理標(biāo)本檢測(cè)確定為退變椎間盤(pán)組織，列為研究組。因創(chuàng)傷導(dǎo)致脊椎骨折行內(nèi)固定手術(shù)6例，其中男性3例，女性3例，平均年齡41歲。以往無(wú)脊椎病史，手術(shù)切除的髓核標(biāo)本，病理檢測(cè)為正常未退變的椎間盤(pán)組織。全部標(biāo)本經(jīng)無(wú)菌生理鹽水沖洗三遍，洗去表面血跡，然后用10%福爾馬林固定。2、 方法 1，主要試劑：cdna合成試劑盒；taq dna聚合酶；mmp-13單克隆抗體。 2，mm

10、p-13 免疫組化  （1）石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；（2）3%h2o2去離子水（無(wú)色液體）孵育 10-15分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；（3）tbs 洗 2 3分鐘；（4）hp6.0 枸櫞酸修復(fù) 100power 3分20秒 后，20power 15分鐘；（5）tbst 0.025%  2 5分鐘；（6）血清封閉：10%fbs（稀釋與tbs）室溫30分鐘。傾去，勿洗；（7）滴加一抗 1:25稀釋與tbs中，4過(guò)夜；（ 8）復(fù)溫30分鐘。tbst 沖洗2 5分鐘；（9）兔二抗，37，20分鐘；（10）tbst 沖洗，2 3分鐘；（ 11）顯色劑顯色da

11、b 5分鐘左右 鏡下觀察；（12）自來(lái)水充分沖洗。大于20分鐘；（13）復(fù)染時(shí)間根據(jù)he定，不能太藍(lán)；（14）常規(guī)脫水，透明；（15）封片劑封片。三、圖像及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有圖像均經(jīng)image-proplus5.1圖像分析系統(tǒng)處理，所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均值間差異采用t檢驗(yàn)，spss 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。以p<0.01為相差非常顯著，p<0.05為相差顯著，p0.05為相差不顯著。 結(jié)果采用 spss 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件。病變組mmp-13平均陽(yáng)性表達(dá)率為73.2%（n=33），見(jiàn)下表一。正常組陽(yáng)性率為20.4%（n=

12、6）。兩組陽(yáng)性率進(jìn)行比較，行卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取= 0.01，p<0.01，兩組間陽(yáng)性率有顯著差異。表一：編號(hào)+-t陽(yáng)性率x137-51568223865.55%z6-21735923274.57%y2-21093514475.69%z19-32123724985.14%z24-31524119378.76%h2-11472917683.52%nb1-17-22021721992.24%nb1-19-21552918484.24%nb1-22-2914313467.91%w3-225212537766.84%x55-717813231057.42%x70-4864413066.15%x7

13、1-11495120074.50%x126-22537232577.85%n17-21453818379.23%n21-31374117876.97%nb1-5-22593329288.70%nb1-6-12663630288.08%n4-7733711066.36%n7-11395419372.02%n12-2786514354.55%n14-312612024651.22%nb1-8-11905424477.87%nb1-11-1798116049.38%nb1-20-11025715964.15%nb1-23-1614610757.01%w8-21916926073.46%w10-612

14、46418865.96%x43-12157428974.39%x68-62023523785.23%x90-11543018483.70%z1-21865223878.15%z20-51734722078.64%（正常椎間盤(pán)mmp-13表達(dá)）（椎間盤(pán)退變mmp-13的表達(dá)）討論 椎間盤(pán)疾病嚴(yán)重影響人們正常生活，其中腰椎間盤(pán)退變是最常見(jiàn)原因。引起椎間盤(pán)退變的因素很多，如創(chuàng)傷、遺傳、年齡、壓力等， 這些因素均可誘發(fā)椎間盤(pán)細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，如炎性因子分子分泌增多、細(xì)胞能量代謝障礙、基質(zhì)合成減少、細(xì)胞增殖緩慢及細(xì)胞老化等6。國(guó)內(nèi)外已有一些研究證實(shí)細(xì)胞外基質(zhì)成分改變是椎間盤(pán)力學(xué)特征喪失的主要原因，但

15、其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚 。正常的細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原、蛋白多糖、水、少量的彈性蛋白和粘連因子。椎間盤(pán)不同部位的膠原含量不同，以i型和ii型膠原為主，髓核中合成的主要是ii型膠原。在椎間盤(pán)退變中的基質(zhì)的生物化學(xué)變化表現(xiàn)為7：i型膠原替代髓核中的ii型膠原、蛋白多糖特別是聚合體含量下降、硫酸角質(zhì)素和硫酸軟骨素比升高。目前已發(fā)現(xiàn)，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的酶系有4種：基質(zhì)金屬蛋白酶（mmps)、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及天冬氨酸蛋白酶。其中mmps是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶1,2,8，它是一類(lèi)與zn和ca依賴(lài)的蛋白水解酶家族，主要包括mmp-1、8、13等。髓核中最主要的膠原是ii型膠原，mm

16、p-13在 ii型膠原降解中具有重要作用，它對(duì)ii型膠原降解的效率是mmp-1、mmp-8的5倍9。omlor等3在以兔或大鼠為模型研究超生理壓力誘發(fā)椎間盤(pán)退變?cè)囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)，mmp-13基因表達(dá)在椎間盤(pán)退變過(guò)程中上調(diào)。maclean等4報(bào)道采用鼠尾模型研究一定載荷對(duì)椎間盤(pán)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)mmp-13在加載2h后增加最多。本研究也觀察到，在椎間盤(pán)退變病人的髓核中存在mmp-13表達(dá)的異常現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在退變椎間盤(pán)中炎癥因子可以上調(diào)mmp-13的表達(dá)，而異常的mmp-13表達(dá)可能導(dǎo)致椎間盤(pán)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度降解，推測(cè) mmp-13在椎間盤(pán)退變過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用8-10。xinli等1

17、1證實(shí)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠在轉(zhuǎn)錄水平提高mmp-13的表達(dá)，并且通過(guò)多途徑減少蛋白多糖的合成。若能以髓核組織中的mmp-13作為治療靶標(biāo)，將可能明顯改善椎間盤(pán)退變這個(gè)種常見(jiàn)病的預(yù)后。本研究中，椎間盤(pán)組織的退變均經(jīng)病理標(biāo)本檢測(cè)確定。獲得椎間盤(pán)退變的髓核標(biāo)本較容易，但獲得正常的髓核標(biāo)本則有一定困難，并涉及到倫理問(wèn)題，因此，本研究中采用腰椎骨折的髓核作為正常髓核標(biāo)本。國(guó)內(nèi)外研究7,12表明，腰椎骨折的主要病理改變是受損椎體壓縮、爆裂及中柱結(jié)構(gòu)的破壞造成脊髓損傷及脊柱穩(wěn)定較差，也可能產(chǎn)生纖維環(huán)破裂，但是，不會(huì)引起髓核組織細(xì)胞外基質(zhì)的變化，因此，研究中將腰椎骨折的髓核作為正常對(duì)照具有科學(xué)性。結(jié)合

18、他人的研究，本研究結(jié)果提示：mmp-13在腰椎間盤(pán)退變過(guò)程中具有非常重要的意義，對(duì)mmp-13進(jìn)一步的研究和拓展有助于進(jìn)一步了解椎間盤(pán)退變的明確的作用機(jī)理。但椎間盤(pán)退變的原因極其復(fù)雜，本研究?jī)H就mmp-13表達(dá)水平與椎間盤(pán)退變的相關(guān)性進(jìn)行了研究，未深入到mmp-13表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其生物學(xué)活性變化的研究，因此存在一定的局限性，進(jìn)一步的闡述上述問(wèn)題將有助于明確mmp-13在椎間盤(pán)退變發(fā)病中的作用和分子靶向治療。參考文獻(xiàn)1 kozac ild, gunera, ok tay g, et a.l a lte ra tions in biochem􀀁ica l components o

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