動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

1、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)法和動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合了固定化細(xì)胞、流式懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合了固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器技術(shù)以及人工灌流細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器技術(shù)以及人工灌流等技術(shù)而發(fā)展起來的。主要包括懸浮培養(yǎng)、微載等技術(shù)而發(fā)展起來的。主要包括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維法等。體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維法等。 如今這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的研究如今這一技術(shù)已廣

2、泛應(yīng)用于現(xiàn)代生物制藥的研究和生產(chǎn)中。它的應(yīng)用大大減少了用于疾病預(yù)防、和生產(chǎn)中。它的應(yīng)用大大減少了用于疾病預(yù)防、治療和診斷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為生產(chǎn)疫苗、細(xì)胞因子、治療和診斷的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為生產(chǎn)疫苗、細(xì)胞因子、生物產(chǎn)品乃至人造組織等產(chǎn)品提供了強(qiáng)有力的工生物產(chǎn)品乃至人造組織等產(chǎn)品提供了強(qiáng)有力的工具。具。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)1 1懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)技術(shù)技術(shù) 基本操作基本操作 (1) (1)將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液將動(dòng)物培養(yǎng)材料分散成細(xì)胞懸浮液 過濾、離心、純化、漂洗后接種到有適過濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳代時(shí)按比例宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)系統(tǒng)中。傳代時(shí)按比例稀釋即可繼續(xù)培養(yǎng)。稀釋即

3、可繼續(xù)培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 對(duì)貼壁性細(xì)胞，最初采用在培養(yǎng)液中加對(duì)貼壁性細(xì)胞，最初采用在培養(yǎng)液中加人一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的人一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積。此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，貼壁面積。此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，放大過程可依靠滾瓶數(shù)量的重復(fù)性好，放大過程可依靠滾瓶數(shù)量的增加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間增加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大。微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，一定程大。微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，一定程度上改變了以上這些不足。微載體是直度上改變了以上這些不足。微載體是直徑徑6025060250um的微珠。的微珠。2 2微載體培養(yǎng)技術(shù)微

4、載體培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)理想的細(xì)胞支持物應(yīng)該具備特征：理想的細(xì)胞支持物應(yīng)該具備特征： (1)(1)生物相容性生物相容性 (2)(2)簡(jiǎn)便的無毒害固定化過程。簡(jiǎn)便的無毒害固定化過程。 (3)(3)良好的傳質(zhì)特性。良好的傳質(zhì)特性。 (4)(4)良好的機(jī)械穩(wěn)定性。良好的機(jī)械穩(wěn)定性。 (5)(5)最大的比表面積。最大的比表面積。 (6)(6)適合細(xì)胞生長(zhǎng)的形狀和大小。適合細(xì)胞生長(zhǎng)的形狀和大小。 (7)(7)粒徑分布均一。粒徑分布均一。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) (8)(8)能高壓滅菌。能高壓滅菌。 (9) (9)可重復(fù)利用，易于清洗?？芍貜?fù)利用，易于清洗。 (10) (10)能保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損

5、傷。能保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。(11)(11)接種方便。接種方便。(12)(12)能固定大部分細(xì)胞。能固定大部分細(xì)胞。(13)(13)適合大規(guī)模培養(yǎng)。適合大規(guī)模培養(yǎng)。(14)(14)易使細(xì)胞、載體與培養(yǎng)基分離。易使細(xì)胞、載體與培養(yǎng)基分離。(15)(15)適合于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。適合于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟是微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟是：(1)(1)選擇合適的微載體類型選擇合適的微載體類型 (2) (2)浸泡水化及消毒浸泡水化及消毒 (3) (3)接接種種 (4)(4)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù) (5)(5)消化消化 ( (通常用酶

6、消化法通常用酶消化法) )。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 采用膠原酶消化比胰蛋白酶采用膠原酶消化比胰蛋白酶- -edtaedta法可獲法可獲得更完整的細(xì)胞膜和更高的細(xì)胞活性。得更完整的細(xì)胞膜和更高的細(xì)胞活性。膠原酶專一性好，不損傷細(xì)胞膜，效果膠原酶專一性好，不損傷細(xì)胞膜，效果較好。較好。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) (6) (6)分離細(xì)胞：分離細(xì)胞： 對(duì)于回收率要求不高的細(xì)胞種類，對(duì)于回收率要求不高的細(xì)胞種類，分組分組沉降簡(jiǎn)單易行。沉降簡(jiǎn)單易行。 脫離微載體的培養(yǎng)液放入細(xì)長(zhǎng)容器，于上清液脫離微載體的培養(yǎng)液放入細(xì)長(zhǎng)容器，于上清液中分離收集細(xì)胞，中分離收集細(xì)胞，400400r rminmin，2min2min

7、離心加速離心加速微載體沉淀。微載體沉淀。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) (7) (7)傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)： 如果進(jìn)如果進(jìn)行行放大培養(yǎng)，可在細(xì)胞脫離微載放大培養(yǎng)，可在細(xì)胞脫離微載體后，加入一些新的微載體以增大培養(yǎng)體后，加入一些新的微載體以增大培養(yǎng)體積，提高培養(yǎng)液的利用率，不過此法體積，提高培養(yǎng)液的利用率，不過此法比比全部用新微載體全部用新微載體的細(xì)胞得率要少。的細(xì)胞得率要少。 盡量減少培養(yǎng)液中盡量減少培養(yǎng)液中ca2+ca2+濃度可促進(jìn)微載濃度可促進(jìn)微載體之間的細(xì)胞轉(zhuǎn)移體之間的細(xì)胞轉(zhuǎn)移。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 除了交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體除了交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體, ,還可采用以還可采用以下微載體：下微

8、載體： 1)1)纖維素為基質(zhì)微載體：纖維素為基質(zhì)微載體： 2)2)蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體：變性膠原微載體，蛋蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體：變性膠原微載體，蛋黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合。黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合。 3)3)高分子材料為基質(zhì)微載體：高分子材料為基質(zhì)微載體： 4)4)無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體。無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)3 3 多孔載體培養(yǎng)多孔載體培養(yǎng) 一優(yōu)點(diǎn)一優(yōu)點(diǎn) 降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。大的生長(zhǎng)空間，降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。大的生長(zhǎng)空間，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。化傳質(zhì)。 多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)

9、胞，也適合懸浮細(xì)胞多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)。的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)。 多孔載體固定細(xì)胞過程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無毒害和損多孔載體固定細(xì)胞過程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無毒害和損傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到未長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)多孔載體制備的材料選擇多孔載體制備的材料選擇主要考慮材料的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)主要考慮材料的生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn) (1 (1）生物相容性：材料對(duì)細(xì)胞

10、必須無毒害，）生物相容性：材料對(duì)細(xì)胞必須無毒害，對(duì)貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用。對(duì)貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用。 (2) (2)機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長(zhǎng)時(shí)間攪拌狀機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長(zhǎng)時(shí)間攪拌狀態(tài)下不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、回收態(tài)下不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、回收利用的要求。利用的要求。 (3) (3)熱穩(wěn)定性：在熱穩(wěn)定性：在121 121 、蒸汽滅菌下不、蒸汽滅菌下不分解、不破碎、不軟化。分解、不破碎、不軟化。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)4 4微囊化培養(yǎng)技術(shù)微囊化培養(yǎng)技術(shù) 微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可以自由透過，而各種酶、輔體，小分子

11、物質(zhì)可以自由透過，而各種酶、輔酶、離子交換劑、活性炭及蛋白等大分子物質(zhì)酶、離子交換劑、活性炭及蛋白等大分子物質(zhì)可包裹在其中不能逸出，利用它們催化反應(yīng)底可包裹在其中不能逸出，利用它們催化反應(yīng)底物。微囊化培養(yǎng)是借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹物。微囊化培養(yǎng)是借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)在在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，細(xì)胞總的各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，細(xì)胞總的生長(zhǎng)體積有了一定的增加，而且減少了攪拌對(duì)生長(zhǎng)體積有了一定的增加，而且減少了攪拌對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力。微囊化培養(yǎng)為單克隆抗體、細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力。微囊化培養(yǎng)為單克隆抗體、干擾素

12、等生產(chǎn)提供了有效途徑。干擾素等生產(chǎn)提供了有效途徑。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)5 5 中空纖維法中空纖維法 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是理查中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是理查德德克瑞克等在克瑞克等在19721972年發(fā)明的。最初使年發(fā)明的。最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，表面有酸纖維素混合組成的可透性膜，表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過，細(xì)胞也可在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過，細(xì)胞也可在上面帖附生長(zhǎng)。上面帖附生長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生中空纖維細(xì)

13、胞培養(yǎng)技術(shù)就是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管毛細(xì)血管”中空纖維供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)等條件。培養(yǎng)系中空纖維供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)等條件。培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分由統(tǒng)的核心部分由3-63-6層這樣的空心纖維組成，層這樣的空心纖維組成，培養(yǎng)時(shí)將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔。培養(yǎng)時(shí)將待培養(yǎng)細(xì)胞接種于空心纖維的外腔。 培養(yǎng)一段時(shí)間后，逐漸用無血培養(yǎng)基代替含血培養(yǎng)一段時(shí)間后，逐漸用無血培養(yǎng)基代替含血培養(yǎng)基。此時(shí)雖然細(xì)胞不再增殖，但能正常生培養(yǎng)基。此時(shí)雖然細(xì)胞不再增殖，但能正常生活并分泌所需的代謝產(chǎn)物。由手這種培養(yǎng)方法活并分泌所需的代謝產(chǎn)物。由手這種培養(yǎng)方法在分離和純化分泌

14、物時(shí)比較方便，因而在生產(chǎn)在分離和純化分泌物時(shí)比較方便，因而在生產(chǎn)激素和單抗時(shí)經(jīng)常采用。激素和單抗時(shí)經(jīng)常采用。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)九九 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng) 9 91 1 生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析 由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切敏感以及對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴(yán)格的要求，傳統(tǒng)敏感以及對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴(yán)格的要求，傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量培養(yǎng)，因而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)，因而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和過程控制提出了特殊的要求。細(xì)胞培養(yǎng)用生物過

15、程控制提出了特殊的要求。細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器的種類越來越多，規(guī)模也越來越大，反反應(yīng)器的種類越來越多，規(guī)模也越來越大，反應(yīng)器的主要結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式和固應(yīng)器的主要結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣升式和固定床為主。定床為主。 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)用于動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的用于動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求：生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求： (1) (1)混合系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)能提供均勻、溫和的混混合系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)能提供均勻、溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。合狀態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。 (2) (2)反應(yīng)器內(nèi)反應(yīng)器內(nèi)空間利用率高空間利用率高，選用合適的載，選用合適的載體系統(tǒng)和材

16、料。體系統(tǒng)和材料。 (3) (3)能嚴(yán)格保證能嚴(yán)格保證無菌無菌環(huán)境。環(huán)境。 (4) (4)能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和c02濃度等條件。濃度等條件。 (5) (5)能夠方便地實(shí)現(xiàn)能夠方便地實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣、樣品的采樣和觀察。品的采樣和觀察。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)9 92 2 生物反應(yīng)器應(yīng)用概況生物反應(yīng)器應(yīng)用概況 采用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是一種有效采用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是一種有效的途徑。但是，由于動(dòng)物細(xì)胞、組織的多樣性，的途徑。但是，由于動(dòng)物細(xì)胞、組織的多樣性，使得在培養(yǎng)材料、培養(yǎng)環(huán)境等方面千差萬別，使得在培養(yǎng)材料、培

17、養(yǎng)環(huán)境等方面千差萬別，因此，如何根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象體內(nèi)生存環(huán)境的特點(diǎn)，因此，如何根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象體內(nèi)生存環(huán)境的特點(diǎn)，開發(fā)合適的生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境進(jìn)開發(fā)合適的生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境進(jìn)行高效離體培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)條件、工藝等進(jìn)行行高效離體培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)條件、工藝等進(jìn)行優(yōu)化將是重要的研究課題。優(yōu)化將是重要的研究課題。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器一般有微動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器一般有微載體式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式載體式、中空纖維式、灌注培養(yǎng)式、旋轉(zhuǎn)壁式等，幾種新型的反應(yīng)器類型特點(diǎn)介紹如下：等，幾種新型的反應(yīng)器類型特點(diǎn)介紹如下：動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)( (一一) )柱狀中空纖維反應(yīng)器柱狀中空

18、纖維反應(yīng)器 中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微孔中空纖中空纖維細(xì)胞反應(yīng)器主體是由微孔中空纖維管束制成的，纖維束由外殼包裹，因此可分維管束制成的，纖維束由外殼包裹，因此可分為殼體空間及管體空間兩部分，每部分各有其為殼體空間及管體空間兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。一般講，細(xì)胞生長(zhǎng)在殼體部分，新鮮進(jìn)出口。一般講，細(xì)胞生長(zhǎng)在殼體部分，新鮮培養(yǎng)液從殼體部分導(dǎo)人，氣體在管體部分通過，培養(yǎng)液從殼體部分導(dǎo)人，氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體部分。殼體部其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體部分。殼體部分的細(xì)胞如是附壁性的，則附著在纖維外側(cè)，分的細(xì)胞如是附壁性的，則附著在纖維外側(cè)，在培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化液將其

19、消化并沖在培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化液將其消化并沖出：若是非附壁性的應(yīng)采用微濾材料將其截留出：若是非附壁性的應(yīng)采用微濾材料將其截留在殼體內(nèi)而讓廢培養(yǎng)液排出。在殼體內(nèi)而讓廢培養(yǎng)液排出。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)( (二二) )板框式中空纖維反應(yīng)器板框式中空纖維反應(yīng)器 因柱狀中空纖維反應(yīng)器中營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和因柱狀中空纖維反應(yīng)器中營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物會(huì)存在濃度梯度，所以細(xì)胞分代謝產(chǎn)物會(huì)存在濃度梯度，所以細(xì)胞分布受到影響而不均勻。布受到影響而不均勻。 人們開發(fā)出板框式中空纖維反應(yīng)器。該人們開發(fā)出板框式中空纖維反應(yīng)器。該反應(yīng)器的中心是一束中空纖維淺床，置反應(yīng)器的中心是一束中空纖維淺床，置于兩個(gè)不銹鋼微孔濾板之間。于兩

20、個(gè)不銹鋼微孔濾板之間。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)板框式中空纖維反應(yīng)器板框式中空纖維反應(yīng)器 液營(yíng)養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng) 中空纖中空纖維板維板動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)三、中心灌流式反應(yīng)器三、中心灌流式反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)四、四、灌流微載體生物反應(yīng)器灌流微載體生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)( (五五) )旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器 一般由水平放置的內(nèi)外兩個(gè)同心圓柱組一般由水平放置的內(nèi)外兩個(gè)同心圓柱組成。靜態(tài)的內(nèi)柱由半透膜構(gòu)成，使氣體成。靜態(tài)的內(nèi)柱由半透膜構(gòu)成，使氣體可以通過該膜進(jìn)行交換。旋轉(zhuǎn)的外柱由可以通過該膜進(jìn)行交換。旋轉(zhuǎn)的外柱由非通透性材料制成。非通透性材料制成。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)1010生物反應(yīng)器

21、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 1.1.病毒疫苗病毒疫苗 2.2.非抗體免疫調(diào)節(jié)劑非抗體免疫調(diào)節(jié)劑 3.3.多肽生長(zhǎng)因子多肽生長(zhǎng)因子 4.4.酶類酶類 5.5.激素激素 6.6.腫瘤特異性抗原腫瘤特異性抗原 7.7.單克隆抗體單克隆抗體 8.8.病毒殺蟲劑病毒殺蟲劑動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)注意幾個(gè)問題：注意幾個(gè)問題：( (一一) )細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 (1)(1)氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚氨離子：細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中抑制因素的積聚是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。是提高細(xì)胞密度的主要限制因素。(2)(2)乳酸：乳酸： (3)(3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒二氧化碳

22、：二氧化碳積聚，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。性作用或者改變細(xì)胞代謝水平。 (4)(4)甲基乙二醛甲基乙二醛( (mc)：(5)滲透壓：滲透壓： (6) (6)載體：可考慮采用多孔敬載體替代容易使載體：可考慮采用多孔敬載體替代容易使細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。細(xì)胞受機(jī)械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)( (二二) )細(xì)胞死亡與凋亡細(xì)胞死亡與凋亡 大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。最初的研究似乎表明細(xì)胞死亡大多由于壞死，而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少胞死亡大多由于壞死

23、，而人們逐漸認(rèn)識(shí)到至少是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是是一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡。 用基因工程方法將用基因工程方法將bcl2基因這種細(xì)胞凋基因這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞。亡抑制基因?qū)爰?xì)胞。bcl2基因的過量表達(dá)基因的過量表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。量。 大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，可通過“細(xì)胞靜止細(xì)胞靜止”過程來降低營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。過程來降低營(yíng)養(yǎng)成分消耗和代謝毒物產(chǎn)生。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) ( (三三) ) 培養(yǎng)基與細(xì)胞系培養(yǎng)基與細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞培

24、養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長(zhǎng)、增殖的重動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長(zhǎng)、增殖的重要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清要因素。天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。培養(yǎng)基開發(fā)成為當(dāng)今細(xì)胞領(lǐng)域的一大課題。 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免血清的批次、質(zhì)無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)在于避免血清的批次、質(zhì)量、成分等對(duì)細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于量、成分等對(duì)細(xì)胞造成的污染、毒性和不利于產(chǎn)品純化等不良影響。產(chǎn)品純化等不良影響。 在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞

25、在最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)目可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)( (四四) )過程監(jiān)控過程監(jiān)控 測(cè)量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長(zhǎng)期測(cè)量在線氧吸收速率確定從細(xì)胞生長(zhǎng)期生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終生產(chǎn)病毒到病毒感染期和細(xì)胞死亡后終止感染的轉(zhuǎn)換時(shí)間；用在線葡萄糖分析止感染的轉(zhuǎn)換時(shí)間；用在線葡萄糖分析儀的測(cè)定調(diào)整灌流速度；測(cè)定氧消耗估儀的測(cè)定調(diào)整灌流速度；測(cè)定氧消耗估計(jì)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷；測(cè)定氧吸收計(jì)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)率的代謝負(fù)荷；測(cè)定氧吸收速率估測(cè)速率估測(cè)atp的形成；測(cè)量在線氧化還的形成；測(cè)量在線氧化還原能力作為活

26、細(xì)胞濃度的指標(biāo)等均得以原能力作為活細(xì)胞濃度的指標(biāo)等均得以應(yīng)用。應(yīng)用。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 測(cè)定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢測(cè)定在線氧吸收速率并用質(zhì)譜儀分析廢氣中二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸商。一般氣中二氧化碳呼出率計(jì)算呼吸商。一般來說，呼吸商應(yīng)接近來說，呼吸商應(yīng)接近1.01.0，這就要求細(xì)胞，這就要求細(xì)胞培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出。培養(yǎng)中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出。 用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行用親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)進(jìn)行在線蛋白質(zhì)含量測(cè)定。另外，用在線蛋白分在線蛋白質(zhì)含量測(cè)定。另外，用在線蛋白分解與反相色譜監(jiān)測(cè)重組蛋白的糖基化以了解解與反相色譜監(jiān)測(cè)重組蛋白的糖基化以了解產(chǎn)品的

27、一致性。產(chǎn)品的一致性。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法(細(xì)胞運(yùn)輸) 當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國(guó)內(nèi)進(jìn)行寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，當(dāng)前培養(yǎng)細(xì)胞既在國(guó)內(nèi)進(jìn)行寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，也在國(guó)際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的方法。也在國(guó)際交流，為此需要裝運(yùn)細(xì)胞的方法。一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器，一種是用液氮或干冰貯存運(yùn)輸，需要特殊容器，較麻煩，且不適于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行。另一方法為充液法，較麻煩，且不適于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行。另一方法為充液法，方便當(dāng)行，是當(dāng)前多采用的方法。方便當(dāng)行，是當(dāng)前多采用的方法。 具體方法：具體方法： 選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，待培養(yǎng)近單層后，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)層后

28、，去掉培養(yǎng)液充滿新培養(yǎng)液。液量要達(dá)培養(yǎng)瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝馄款i部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝饬袅窟^多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來回流動(dòng)對(duì)細(xì)胞有干擾留量過多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來回流動(dòng)對(duì)細(xì)胞有干擾作用。作用。一般經(jīng)一般經(jīng)4 45 5天運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞活力無大影響。時(shí)間過天運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞活力無大影響。時(shí)間過長(zhǎng)長(zhǎng), ,細(xì)胞活力下降。細(xì)胞活力下降。 到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，到達(dá)后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的液體量。置保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的液體量。置3737攝氏度培養(yǎng)，攝氏度培養(yǎng)，次日傳代。次日傳代。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)十一十一 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤

29、細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程 體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的歷史一定程度上體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的歷史一定程度上代表了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。代表了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)展歷史。 1952 1952年，蓋爾年，蓋爾( (gey)首先成功地建立世首先成功地建立世界上第一個(gè)細(xì)胞系界上第一個(gè)細(xì)胞系子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系，子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系，并且使惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的并且使惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展成就主要腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展成就主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)(1)在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞類型上，從間充質(zhì)源性的細(xì)胞在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞類型上，從間充質(zhì)源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞，再由神經(jīng)外胚層源性到造血轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞，再由