超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)辣椒和肉醬中的蘇丹紅含量

1、河南省食品高級(jí)專家評(píng)定定專業(yè)論文超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)辣椒和肉醬中蘇丹紅i-iv的含量姓 名：李 靜職 業(yè)：食品科學(xué)與檢驗(yàn) 鑒定等級(jí)：高級(jí)單 位：雙匯集團(tuán)日 期：2014-5-16超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)辣椒和肉醬中的蘇丹紅i-iv的含量李 靜 (雙匯集團(tuán)，462000)摘要：建立了辣椒和肉醬中蘇丹紅i、ii、iii和iv含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(uplc-ms/ms)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)4%氨水乙腈提取后，經(jīng)尼龍濾膜過(guò)濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)。本方法中蘇丹紅i、ii、iii的定量限為1g/kg，蘇丹紅iv的定量限為5g/kg，線性范圍為1-50ng/ml

2、；在蘇丹紅i-iv添加水平為10-50g/kg時(shí)，辣椒樣品中蘇丹紅i、ii、iii和iv的回收率分別為88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，肉醬樣品中蘇丹紅i、ii、iii和iv的回收率分別為105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%。關(guān)鍵詞：蘇丹紅；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用；辣椒；肉醬引言：蘇丹紅是一種偶氮類合成工業(yè)染料，常用于溶劑、汽油以及鞋、地板等的增色。蘇丹紅早在1995年就被確認(rèn)為致癌物，蘇丹紅、也懷疑具有致癌性1。中國(guó)和歐盟等全球多數(shù)國(guó)家都禁止用于食品生產(chǎn)，但有不少食品生產(chǎn)企業(yè)為改善色澤、降低成本仍將其作為食用色素，因

3、此，建立蘇丹紅的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。目前，蘇丹紅的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法(hplc)2-4、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gc-ms)1和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(lc-ms/ms)5-8等，前處理方法主要包括中性氧化鋁柱凈化2和gpc凈化4等方法。由于gpc凈化比較費(fèi)時(shí)，且產(chǎn)生大量廢液；而中性氧化鋁柱凈化具有操作復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻，結(jié)果重現(xiàn)性差，回收率不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此，本文采用提取液直接稀釋上樣，結(jié)合uplc-ms/ms的高靈敏度、準(zhǔn)確定性定量和檢測(cè)快速等優(yōu)勢(shì)，建立了一種應(yīng)用uplc-ms/ms法測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)辣椒和肉醬中蘇丹紅含量的定性定量分析和確證方法。本方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速

4、，靈敏度高，檢出限低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。1 材料與方法1.1 主要儀器xevo tq ms超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)waters公司)；電子天平(瑞士mettler toledo公司)；vx-iii型多管平行振蕩器(北京targin公司)；kq-500de型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；gl-21m型離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司)；氮?dú)獍l(fā)生器(英國(guó)peak公司).1.2 試劑和材料蘇丹紅i-iv標(biāo)準(zhǔn)品(純度分別為96.7%、83.3%、91.3%和75.5%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)；乙腈、甲酸(美國(guó)fisher公司)；甲酸銨(美國(guó)alfa aesar公司)；氨水(天津科密歐)；辣

5、椒、肉醬(市售)。 1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制1.3.1 100g/ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 分別準(zhǔn)確稱取10.34mg蘇丹紅i、12.00mg蘇丹紅ii、10.95mg蘇丹紅iii和13.24mg蘇丹紅iv標(biāo)準(zhǔn)品于100ml容量瓶中，用丙酮定容，混勻，即為100g/ml的蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4冰箱中儲(chǔ)存。1.3.2 1.0g/ml混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 準(zhǔn)確吸取1.00ml 100g/ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100ml容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即為1.0g/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，儲(chǔ)存于4冰箱中。1.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)系列 用4%氨水乙腈將蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50

6、.0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列。1.4 儀器條件1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：waters beh-c18 柱，2.150mm，粒徑1.7m；柱溫：40；進(jìn)樣量：5l；流動(dòng)相：a：5mmol/l甲酸銨+0.1%甲酸水溶液，b：乙腈，洗脫梯度見(jiàn)表1所示。表1 羅丹明b流動(dòng)相的洗脫梯度時(shí)間(min)流速(ml/min)a(%)b(%)curve0.0 0.453070/2.00.450100線性變化3.0 0.459010線性變化4.0 0.453070即時(shí)變化1.4.2 質(zhì)譜條件 采用esi+多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)模式，電離電壓3.0 kv，源溫150，霧化氣溫度450，霧化氣流量900l/h，錐孔

7、氣流量20l/h，碰撞氣為高純氬氣，蘇丹紅i-iv的選擇離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表2所示。表2 mrm模式下蘇丹紅i-iv的監(jiān)測(cè)條件名稱定性離子對(duì)定量離子對(duì)采集時(shí)間（s）錐孔電壓(v)碰撞能量(ev)蘇丹紅i249.25/156.22249.25/156.220.1612020249.25/232.2513蘇丹紅ii277.29/121.23277.29/121.230.0782022277.29/156.2016蘇丹紅iii353.29/156.20353.29/156.200.0783420353.29/196.1522蘇丹紅iv381.32/106.22381.32/106.220.1613

8、024381.32/156.10301.5 樣品處理稱取處理均勻的樣品2.000.01g于50ml聚丙烯離心管中，加入10ml 4%氨水乙腈，于多管平行振蕩器上振蕩提取30min，超聲提取15min，7000r/min離心5min，吸取1ml上清液過(guò)0.22m有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。2 結(jié)果與討論2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化蘇丹紅在esi+電離模式下易得到h+形成較為穩(wěn)定的m+h+的分子離子，本試驗(yàn)對(duì)1g/ml蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描和子離子掃描，獲得蘇丹紅i-iv的母離子掃描圖和特征碎片離子掃描圖(如附錄所示)，選擇豐度比最強(qiáng)的碎片離子對(duì)249.25/156.22、277

9、.29/121.23、353.29/156.20和381.32/106.22分別作為蘇丹紅i、ii、iii和iv的定量離子對(duì)，豐度比較強(qiáng)的離子對(duì)249.25/232.25、277.29/156.20、353.29/196.15和381.32/156.10分別作為蘇丹紅i、ii、iii和iv的定性離子對(duì)，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件如表2所示。2.2 液相色譜條件的優(yōu)化 在esi+電離模式下，為了使蘇丹紅更容易得到h+，在流動(dòng)相中加入微量甲酸，可顯著提高目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度；添加適量銨鹽可改善蘇丹紅的峰型。為了將色譜柱中的極性和非極性雜質(zhì)盡可能完全洗脫，從而延長(zhǎng)色譜柱使用壽命，本文采用梯度洗脫，最終選用

10、表1中的洗脫程序?qū)δ繕?biāo)化合物進(jìn)行洗脫。2.3 定容液的選擇用純甲醇、純乙腈、乙腈+水(1+1，v/v)和甲酸+乙腈+水(2+10+88，v/v/v)定容時(shí)，蘇丹紅iii和蘇丹紅iv均出現(xiàn)雙峰，后峰靈敏度是前峰的2-3倍，改用在甲醇或乙腈中加入一定量氨水時(shí)，隨著氨水比例的增大，前峰越來(lái)越小，后峰越來(lái)越大，當(dāng)氨水比例增至4%時(shí)，前峰響應(yīng)變?yōu)楹蠓宓?%以下，可以忽略?？紤]蘇丹紅的非極性較強(qiáng)，且加熱處理會(huì)對(duì)蘇丹紅iv有較大影響，所以定容液與提取液應(yīng)保持一致，最終選用4%氨水乙腈定容。2.4 提取試劑的選擇7-8本試驗(yàn)對(duì)比采用純乙腈、正己烷和4%氨水乙腈作為提取試劑對(duì)蘇丹紅回收率的影響，試驗(yàn)表明三種提取

11、試劑對(duì)蘇丹紅i、ii和iii的提取效果差別不大；而采用4%氨水乙腈作為提取試劑時(shí)，蘇丹紅iv的回收率明顯上升，這可能因?yàn)椴捎眉円译婊蛘和樘崛r(shí)，需加熱或氮吹置換定容液，而加熱和長(zhǎng)時(shí)間放置對(duì)蘇丹紅iv的穩(wěn)定性影響很大，綜合考慮各方面的影響和操作的方便性，最終選用4%氨水乙腈作為提取試劑。2.5 凈化方法的選擇考慮到樣品提取后脂肪含量較高，且蘇丹紅的非極性較強(qiáng)，無(wú)法用正己烷去油，本試驗(yàn)選用226免疫親和柱和中性氧化鋁柱凈化。結(jié)果表明226免疫親和柱能吸附50%以上的蘇丹紅；而采用中性氧化鋁柱凈化時(shí)，在上樣的過(guò)程中已有90%以上的蘇丹紅被洗脫，可能是由于中性氧化鋁柱的活性不好控制造成，綜合考慮回收

12、率和凈化效果，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度，最終選用樣品不經(jīng)凈化，增大稀釋倍數(shù)后直接上機(jī)。2.6 線性方程和定量限 按1.3.3配制蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4建立的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。分別以定量離子峰面積y對(duì)含量x(ng/ml)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以定量離子對(duì)的10倍信噪比為定量限，蘇丹紅i、ii、iii的定量限均為0.2ng/ml，蘇丹紅iv的定量限為1.0ng/ml，采用陰性樣品中添加目標(biāo)化合物的方法，按1.5的方法進(jìn)行前處理，得到本方法中蘇丹紅i、ii、iii的定量限為1g/kg，蘇丹紅iv的定量限為5g/kg。純標(biāo)品和加標(biāo)試驗(yàn)的總離子流圖如附錄所示。2.7 加標(biāo)回收率和精密度取處理均勻的

13、陰性辣椒和肉醬樣品，按表3設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果表明，蘇丹紅i、ii、iii和iv在辣椒樣品中的回收率分別為88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，rsd分別為3.7%-5.8%、3.7%-6.8%、6.0%-7.4%和5.0%-5.9%；在肉醬樣品中的回收率分別為105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%，rsd分別為2.7%-5.3%、3.3%-7.5%、4.4%-9.9%和3.9%-6.6%。具體結(jié)果如表3所示。表3 蘇丹紅i-iv的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果項(xiàng)目添加濃度辣椒片肉醬(g/kg)回收率(%)rsd回收率(%)rsd123456平

14、均(%)123456平均(%)蘇丹紅i1094 95 97 104 96 99 97.5 3.7 120 110 106 105 105 108 109.0 5.3 5096 103 92 88 89 97 94.3 5.8 112 106 114 112 110 108 110.4 2.7 蘇丹紅ii1098 95 93 104 85 100 95.8 6.8 110 99 117 96 101 109 105.3 7.5 5090 95 89 85 87 90 89.5 3.7 83 77 84 81 84 83 82.1 3.3 蘇丹紅iii1099 99 112 118 114 106

15、 108.0 7.4 108 111 100 103 112 109 107.1 4.4 5097 99 95 85 88 97 93.6 6.0 85 89 84 106 96 102 93.8 9.9 蘇丹紅iv1075 67 71 68 67 65 68.6 5.0 69 73 65 70 69 71 69.4 3.9 5067 75 65 64 67 70 67.9 5.9 70 65 73 62 64 70 67.3 6.6 結(jié)束語(yǔ)：本試驗(yàn)研究了復(fù)雜基質(zhì)辣椒和肉醬中蘇丹紅i-iv含量的檢測(cè)方法，采用4%氨水乙腈提取，uplc-ms/ms測(cè)定。本方法中蘇丹紅i、ii、iii的定量限為1

16、g/kg，蘇丹紅iv 的定量限為5g/kg，線性范圍為1-50ng/ml，辣椒樣品中蘇丹紅i、ii、iii和iv的回收率分別為88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，肉醬樣品中蘇丹紅i、ii、iii和iv的回收率分別為105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%。本方法操作簡(jiǎn)單快速，定性定量準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度高，檢出限低，適用于辣椒和肉醬中蘇丹紅含量的定性定量分析和確證。致謝： 感謝孫寶國(guó)院士，給予我極大的幫助和指導(dǎo)，為我提供了詳盡的資料，使我能夠在較短的時(shí)間內(nèi)做專項(xiàng)研究，取得了很大的提高。感謝雙匯集團(tuán)多年的培養(yǎng)和關(guān)愛(ài)，給了我研究平臺(tái)，感謝

17、各位同事的幫助和指導(dǎo)，為我營(yíng)造了一個(gè)積極向上的氛圍，使我勇于探索，樹(shù)立工作目標(biāo)，取得一個(gè)又一個(gè)成績(jī)，今后我會(huì)在實(shí)踐工作中更加兢兢業(yè)業(yè)，做好本職工作，公正客觀的檢測(cè)，為雙匯集團(tuán)把好關(guān)，做到一個(gè)食品從業(yè)者應(yīng)盡的職責(zé)，為社會(huì)提供安全放心的美食！參考文獻(xiàn)：1 黃曉蘭,吳惠勤,黃芳等. gc- ms/sim法同時(shí)測(cè)定食品中的蘇丹紅i-ivj. 分析測(cè)試學(xué)報(bào). 2005, 24(4):1-3.2 國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所起草. gb/t 19681-2005. 食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法s. 2005.3 羅美中,李碧芳,何小青等. 高效液相色譜-二極管陣列法測(cè)定食品中蘇丹紅1著

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