微生物數(shù)量測定沐風(fēng)書苑

1、 環(huán)境微生物新技術(shù)課程作業(yè)2.微生物數(shù)量測定方法有哪些？空氣、水、土壤樣品分別適用哪些方法？請舉例說明。 常見微生物數(shù)量的測定方法1. 計數(shù)器測定法： 即用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)。取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的(o.1mm3)，因而根據(jù)計數(shù)器刻度內(nèi)的細菌數(shù)，可計算樣品中的含菌數(shù)。本法簡便易行，可立即得出結(jié)果。 本法不僅適于細菌計數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌孢子計數(shù)。2、 電子計數(shù)器計數(shù)法: 電子計數(shù)器的工作原理是測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當(dāng)一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上

2、。該法測定結(jié)果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌。因此，要求菌懸液中不含任何碎片。3、活細胞計數(shù)法:常用的有平板菌落計數(shù)法，是根據(jù)每個活的細菌能長出一個菌落的原理設(shè)計的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測污染活菌數(shù)的方法，也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意：一般選取菌落數(shù)在30300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準確；為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入o0012，3，5一氯化三苯基四氮唑(ttc)；本法限用于形成菌落的微生物。廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品

3、等各種材料的細菌檢驗，是最常用的活菌計數(shù)法。4、比濁法比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測定細菌的數(shù)量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(od值)表示樣品菌液濃度。此法簡便快捷，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數(shù)目，對顏色太深的樣品，不能用此法測定。5、測定細胞重量法此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進行稱重；干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放人干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱重。此法適于菌體濃度較高的樣品，是測定絲狀真菌生長量的一種常用方法。6、測定細胞總氮量或總碳量氮、碳是

4、細胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測定氮、碳的含量可以推知細胞的質(zhì)量。此法適于細胞濃度較高的樣品。7、顏色改變單位法（colourchangeunit,簡稱ccu） 通常用于很小，用一般的比濁法無法計數(shù)的微生物，比如支原體等，因為支原體的液體培養(yǎng)物是完全透明的，呈現(xiàn)為清亮透明紅色，因此無法用比濁法來計數(shù)，由于支原體固體培養(yǎng)很困難，用cfu法也不容易計數(shù)，因此需要用特殊的計數(shù)方法，即ccu法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)，來計數(shù)微生物的相對含量的，下面以解脲脲原體為例單介紹其操作：（1）取12只無菌試管，每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。（2）在第一管加入0.2ml待測解脲脲原體菌液，充分

5、混勻，從中吸取0.2ml加入第二管，依次類推，10倍梯度稀釋，一直到最末一管（3）于37度培養(yǎng)，以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測菌液的ccu，也就是支原體的最大代謝活力，比如第六管出現(xiàn)顏色改變，他的相對濃度就是10的6次方ccu/ml. 取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀察計數(shù)或做片在顯微鏡下數(shù)，均稱為顯微鏡直接計數(shù)法。用瓊脂平板計數(shù)，稱為菌落計數(shù)法。 一般來說，比濁法和菌落計數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細菌的計數(shù)，但是對支原體這樣比較特殊的微生物，用ccu法比較合適。 微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類，由于多數(shù)微生物的個體較小，肉眼無法觀察 ，對其計

6、數(shù)一般比較困難。在目前的微生物實驗教學(xué),對微生物計數(shù)的方法主要有三大類：總細胞計數(shù)法、活細胞計數(shù)法和微生物生長量測定法 。并不是每一種方法都是通用的 ,不同的微生物種類需要不同的計數(shù)方法 , 目前多用以下8種方法進行計數(shù)：1.總細胞計數(shù)法1.1 血細胞計數(shù)板計數(shù)法 血細胞計數(shù)板是一塊特制的載玻片 ,其上劃有計數(shù)室 ,通過對計數(shù)室中的微生物數(shù)量的讀取 ,計算原溶液中的微生物數(shù)量。此方法由于計數(shù)板較厚,且計數(shù)室的高度是0.1mm ,不能采用油鏡進行觀察,故只能對體積較大的真核微生物進行測定 ,如酵母菌、霉菌抱子等,只能測得所有細胞的總數(shù),不能區(qū)別死細胞和活細胞,尤其是對運動能力強的活細胞難以計數(shù)。

7、目前已經(jīng)提出一些方法,如結(jié)合特定的美藍染色技術(shù),區(qū)別酵母菌死活細胞,將運動的細胞加人甲醛溶液中,破壞其運動以便計數(shù)等。1.2 細菌計數(shù)板計數(shù)法 細菌計數(shù)板是在血細胞計數(shù)板的基礎(chǔ)上改進而來 ,主要是降低計數(shù)板的厚度 ,同時將計數(shù)室的高度從0.1mm降低到0.02mm,以用油鏡對較小的原核微生物進行計數(shù)。1.3 膜過濾計數(shù)法 利用計數(shù)板對高濃度的菌液測定比較準確 ,但當(dāng)樣品中細菌的數(shù)量很低時 ,如湖水、海水或飲用水等 ,用膜過濾計數(shù)法更精確些 ,可以將一定體積樣品溶液加結(jié)晶紫染色 ,再用0.02um的聚偏二氟乙烯膜負壓過濾 ,再用無菌水沖洗至無色后 ,將過濾的膜進行抽干 ,將膜放到載玻片上,滴加甘

8、油 ,蓋上蓋玻片 ,即可在顯微鏡下計數(shù)。一般隨機抽取20個視野進行計數(shù) ,最后算平均數(shù) ,計算整個濾膜上的菌的數(shù)量 ,得到原菌液中的微生物數(shù)量。此測定方法一般只能用于樣品中細菌數(shù)量很低的情況 ,多數(shù)時候細菌個體由于粘附成團而影響結(jié)果。所以 ,過濾前的細胞分散處理很重要 ,例如將細菌懸液經(jīng)過酸堿或超聲波處理 ,將聚團的細胞打散 , 可以增加此方法的準確性。2.活細胞計數(shù)法2.1 平板菌落計數(shù)法 平板菌落計數(shù)法只能用于測定活細胞的數(shù)量 ,但是操作過程相對計數(shù)板而言復(fù)雜一些 ,而且測得的細菌數(shù)量往往小于實際值。 主要原因是在計算細菌濃度時 ,往往每個菌落并不一定是由一個單細胞生長繁殖而來 ,有可能是

9、2個或多個,致使結(jié)果比實際菌液樣品中的細菌數(shù)量低 ,這也就是為什么現(xiàn)在都用菌落形成單位數(shù)（cfu/ml）來取代過去的絕對細菌數(shù)量。為了使菌落數(shù)更接近實際菌液中細菌的數(shù)量值 , 目前多數(shù)辦法是:盡量擴大稀釋倍數(shù) ,涂布平板時少取稀釋菌液 ,使平板中的菌落數(shù)減少,避免由于菌液中細菌數(shù)過多造成多個細菌形成一個菌落。例如 ,將系列梯度稀釋至 10-8或更低(稀釋倍數(shù)取決于原菌液)。2.2 比濁法 微生物細胞在一定濃度范圍內(nèi) ,與濁度成正比 ,即與光密度成正比,菌越多,光密度越大。故可通過分光光度計測定吸光值 ,通常測定600nm下的吸光值od600 ,通過與標(biāo)準曲線對比 ,求出樣品中菌液濃度 ,計算出

10、細胞的數(shù)量。實驗測定時容易出現(xiàn)誤差 ,必須控制菌濃度在與光密度成正比的線性范圍內(nèi) ,否則不準確。2.3 霉菌計數(shù)法 對于霉菌的計數(shù)一般比較困難 , 由于霉菌生長快、菌絲疊加導(dǎo)致無法準確計數(shù)。國標(biāo)霉菌計數(shù)法的原理是將待測菌液進行10倍梯度系列稀釋 ,利用高鹽察氏培養(yǎng)基(cao)與待測菌液混勻后倒平板 ,2528(土1) 下培養(yǎng)3d后開始計數(shù) ,選擇菌落數(shù)在 10150之間的平板進行計數(shù) ,取同稀釋度的兩個平板的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù) , 即為每g(或ml)檢樣中所含霉菌數(shù)。3.微生物生長量測定法3.1 凱氏定氮計數(shù)法 蛋白質(zhì)是微生物細胞的主要成分 ,含量較穩(wěn)定 ,可以通過測定樣品中含量穩(wěn)定的蛋白

11、質(zhì)的量計算細菌的數(shù)量 ,將細胞洗滌收集 ,用凱氏定氮法測全氮 ,蛋白質(zhì)含氮量為16%,細菌中蛋白質(zhì)含量因種類的不同而有差別 ,平均值為65%, 根據(jù)每一種微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總含量可以計算出待側(cè)樣品中細胞的總質(zhì)量 ,最后根據(jù)單個細胞的質(zhì)量計算出樣品的細胞數(shù)量。總含氮量與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系為：蛋白質(zhì)總量=含氮量16% ,那么 ,微生物細胞總質(zhì)量=蛋白質(zhì)總量65%，微生物細胞總數(shù)=細胞總質(zhì)量單個細胞質(zhì)量。每一種微生物細胞的蛋白質(zhì)含量不同 ,且不同時期的細胞蛋白質(zhì)含量、單個細胞的質(zhì)量都有差別 ,所以用此方法測定的結(jié)果誤差較大 ,只能作為參考。3.2 dna含量測定法 相比凱氏定氮計數(shù)法較大誤差，dna

12、含量測定法相對較準確。 每個微生物細胞的dna含量非常恒定 ,平均為8.410-5ng ,將一定體積的細菌懸液離心 ,從細菌細胞中提取dna , 得其重量,則可計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數(shù)?？偨Y(jié)：本文對常用的8種微生物數(shù)量測定方法進行總結(jié)與比較 ,血細胞計數(shù)板和細菌計數(shù)板常用于測定單細胞或孢子 ,相對比較準確；膜過濾用于測定細胞濃度很低的樣品 ,平板菌落計數(shù)對多數(shù)微生物的測定都適用 ,但是相對其他計數(shù)法要復(fù)雜；比濁法相對準確 ,但需要標(biāo)準曲線；對于絲狀微生物的數(shù)量測定 , 國際上有明確的標(biāo)準，而凱氏定氮法和dna含量測定法都是通過對微生物細胞內(nèi)含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)進行定量測定 , 再

13、算出細胞的數(shù)量 ,操作相對復(fù)雜。 環(huán)境中的微生物數(shù)量測定方法1、 空氣中：空氣中沒有可為微生物直接利用的營養(yǎng)物質(zhì)和足夠的水分，它不是微生物生長繁殖的天然環(huán)境，因此空氣中沒有固定的微生物種類。它主要通過土壤塵埃、小水滴、人和動物體表的干燥脫落物、呼吸道的排泄物等方式被帶入空氣。由于微生物能產(chǎn)生各種休眠體，故可在空氣中存活相當(dāng)長的時期而不至死亡。空氣中微生物的種類，主要為真菌和細菌。其數(shù)量則取決于所處的環(huán)境和飛揚的塵埃量。1. 自然沉降法（沉降平板法）根據(jù)空氣中攜有微生物氣溶膠粒子在地心引力作用下，以垂直的自然方式沉降到瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)24h,37溫箱培養(yǎng)計算菌落數(shù)。根據(jù)奧梅梁斯基建議，面積為10

14、0cm2的平板培養(yǎng)基，暴露于空氣中5min,于37溫箱培養(yǎng)24h后所生長的菌落數(shù)相當(dāng)于10l空氣中的細菌數(shù)。空氣中的細菌數(shù)（cfu/m3）=1000（100/a）(5/t)(1/10)n =50000n/(at) a-平板面積cm2；t-暴露時間min；n-平均菌落數(shù)(cfu/皿)特點：簡單方便，但穩(wěn)定性差，直徑15um的粒子在5min內(nèi)沉降距離有限，使小粒子采集效率低。 2.撞擊法 anderson采樣器原理：多級篩孔型采樣器由6個帶有微細針孔的金屬撞擊盤構(gòu)成，盤下放置有培養(yǎng)基的平皿，每個圓盤上有400個環(huán)形排列小孔，由上到下孔徑逐漸減小。氣流從頂罩進第一級，較小的粒子會由于動量不足隨氣流繞

15、過平皿進入下一級。經(jīng)6次撞擊后，可把絕大部分的微生物采集下。 空氣含菌量(cfu/m3)=【六級采樣板的總菌數(shù)(cfu)28.3(l/min)采樣時間(min)】1000 特點：a.采集粒譜范圍廣，一般在0.220um以上； b.采集效率高，逃逸少；c.微生物存活率高。 3.過濾法使一定量的空氣通過吸附劑（滅菌生理鹽水），然后培養(yǎng)吸附劑中的細菌，計算出菌落數(shù)。 4.液體撞擊法 和固體撞擊式采樣器一樣，是利用噴射氣流方式將空氣中的微生物粒子采集到小體積液體中，適用于高濃度的空氣微生物采樣。2、 水樣中：（1）水樣中細菌總數(shù)的測定1.直接計數(shù)法血球計數(shù)板計數(shù)利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，這是一

16、種常用的微生物計數(shù)法。此法是將待測細菌菌懸液或孢子液置于計數(shù)板的計數(shù)室中，由于計數(shù)室的容積是已知的，并有一定的刻度，因此可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物個體數(shù)計算出單位體積內(nèi)微生物的總數(shù)。該法只適用于計算形態(tài)較大的酵母菌、藻類及孢子等。. 染色涂片計數(shù)法此法是利用涂片面積與視野面積之比來計算出樣品中微生物量。取稀釋定容的菌液，滴在載玻片上并均勻涂布在一定面積上，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下借相同倍數(shù)標(biāo)定過的目測微尺，測得視野半徑計算出視野面積，從已知總面積計算出視野總數(shù)。根據(jù)幾個視野中的細胞平均值，計算出樣品中的細菌數(shù)。3. 比濁度法此法根據(jù)細菌懸液的濁度與菌數(shù)成正比的原理，將細菌懸液與標(biāo)準濁度管

17、進行比較，以推算其菌數(shù)的一種間接表示方法。（2） 水中細菌活菌數(shù)的測定 1.平板菌落計數(shù)法根據(jù)在固體培養(yǎng)基上所生長的菌落計數(shù)，每一個菌落是由一個單細胞繁殖而成，為肉眼可見的細胞群體。根據(jù)菌落數(shù)可以計算出待測菌液中活菌數(shù)量。方法：a.取水樣1ml利用無菌水按10倍數(shù)作一系列稀釋，水樣稀釋濃度要求在平板上長出的菌落數(shù)在30300個之間為宜。稀釋時應(yīng)盡量使微生物細胞分散開，否則易長出片狀菌苔。b.以無菌操作用無菌移液管吸取1ml充分混勻的水樣，注入無菌平皿中，再傾入約15ml已融化并冷卻到45的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，迅速轉(zhuǎn)動，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。c.置水平位置靜止凝固后，倒置于37培養(yǎng)24h，每個水樣

18、取三個連續(xù)適宜稀釋菌液倒平板，各傾注三個平皿，同時作不加水樣的空白對照。d.待菌落生長好取出平皿計數(shù)，統(tǒng)算出同一稀釋度三個平皿上菌落平均數(shù)。根據(jù)下公式計算： 每毫升菌液中活菌總數(shù)=同一稀釋度的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)2. 液體稀釋法（mpn法）此法也可進行活菌數(shù)計算，由于某些微生物在瓊脂平板上不易生長，故不適用平板菌落計數(shù)，但在液體培養(yǎng)基中生長易于檢查。因此根據(jù)某些稀釋菌液接種培養(yǎng)后所生長微生物的試管數(shù)，用統(tǒng)計數(shù)學(xué)方法計算出原樣品的含菌量。如反硝化細菌、氨化細菌、糞大腸桿菌及紫色非硫光合細菌均可用此法計數(shù)。操作時先將樣品作一系列的10倍稀釋，至最后一級稀釋液接種后，不出現(xiàn)菌的生長為臨界級數(shù)。取后五種

19、稀釋液接種于無菌的液體培養(yǎng)基中，一般需做35管平行實驗。適溫培養(yǎng)，根據(jù)生長菌試管數(shù)，確定數(shù)量指標(biāo)，查出菌的近似值，再行計算。3. 濾膜過濾計數(shù)法當(dāng)單位體積水樣中所含微生物數(shù)量較少時，可通過超濾膜過濾濃集后，再進行培養(yǎng)計數(shù)。每毫升水樣的含菌數(shù)=濾膜上的總菌數(shù)/濃縮水樣的毫升數(shù)（3） 應(yīng)用分光光度計測定細菌數(shù)量 每種菌細胞能吸收和散射通過它們的光，每種菌的散射光強度及吸收光度與細胞總數(shù)有相對應(yīng)的關(guān)系。菌體越多，懸液濁度越大，散射及吸收光越多。利用分光光度計測定懸液減少光線透過的程度，用光密度（od）表示，od是透光率的對數(shù)函數(shù)同細胞總數(shù)成正比。光密度可用光電比色計或分光光度計測定。測定時首先用一系

20、列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度菌數(shù)的標(biāo)準曲線。然后測出未知菌懸液的光密度，從標(biāo)準曲線中查出相應(yīng)的菌數(shù)。此法比較簡單而精確，但如果待測樣品顏色太深或含其它懸浮物較多時，不宜使用此法。3、 土壤中： 土壤是最復(fù)雜、最豐富的微生物基因庫，所含微生物不僅數(shù)量巨大，而且各類繁多，主要包括細菌、真菌和放線菌三大類，是土壤最活躍的成分。土壤微生物數(shù)量測定方法可分為三大類：一類是根據(jù)在培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)來計算土壤微生物的數(shù)量，統(tǒng)稱為培養(yǎng)計數(shù)法，主要有稀釋平板法和最大或然計數(shù)法；二類是將土壤微生物染色后，在顯微鏡下觀察計數(shù)，稱為直接鏡檢法，包括涂片法、瓊脂薄片法和膜過濾法等；三類是直接將微生物從土壤中分離和提取出來后再進行測定，主要有離心分離法。例如：稀釋平板法操作步驟（1）土壤系列稀釋液制備取新鮮土壤（2）10.00g，放入裝有70ml水的廣口瓶中，在振蕩機上振蕩10min。迅速吸取10