制作膠體金試紙的硝酸纖維素膜選擇及應(yīng)用技巧

1、.制作膠體金試紙的硝酸纖維素膜選擇及應(yīng)用技巧轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園發(fā)布日期: 2007-01-28 16:16 文章來源: 丁香園 - 免疫學技術(shù)討論版 1901關(guān)鍵詞: 膠體金 硝酸纖維素膜 NC膜 選擇 技巧 前言 硝酸纖維素膜又稱為NC膜，在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。所以NC膜成為該試驗中最重要的耗材，而由于其屬于非標準器件，基本上每個項目開始階段都會遇到如何選擇合適的NC膜的問題。同時也存在是否要對NC膜進行，期處理及如何處理的討論。 一. NC膜的生產(chǎn)原理 這個雖然看上去屬于生產(chǎn)廠商的事情，但是GMP有個觀點是強調(diào)對過程的控制才會有好的結(jié)果。那么只有了

2、解NC膜的大致生產(chǎn)過程和基本原理才能更好的掌握這種材料的特性，最終制作出滿意的試紙.你了解嗎？ 我找了很久，終于找到一些比較直觀的圖片，大家可以到伊能公司的官方網(wǎng)站看到 首先，勻漿配比 購買回的原料硝酸纖維素粒子是一種非常普遍的有機化學物，溶解形成混漿，在該漿體內(nèi)，會加入一定比例的試劑來調(diào)整最后形成的膜的性質(zhì)，一般是一個試劑配方，主要包含表面活性劑/高分子聚合物/鹽離子/成型劑等溶解在一個緩沖體系內(nèi)。 不同的廠家加入的溶液配方不一樣，直接導致了在產(chǎn)品的差異。 其次，滾筒鋪膜 配好的勻漿通過滾筒，形成了一張薄膜，平攤在十分光滑的平面載體上。這個和造紙的過程是非常相似的。 最后，成型 在勻漿內(nèi)的成

3、型劑開始揮發(fā)，膜逐步干燥成型。同時在這個過程中由于溫度比較高，有些廠家在這個過程采取了在密閉腔體內(nèi)成型，同時補充配方溶液的形式，來避免一些有效成分的蒸發(fā)。切割出產(chǎn)品 通過以上步驟生產(chǎn)出來的膜是呈一個寬度極大的產(chǎn)品，寬度的大小直接和滾筒的大小相關(guān)，滾筒越大生產(chǎn)越方便，但設(shè)備的成本也越高.寬膜要經(jīng)過切割才能成為我們購買到的25mm或18mm（或20mm）寬，而長度上，成品卷膜和寬膜的長度是相同的.理論上可以讓廠家切成你需要的任意寬度，但這樣會造成原料的浪費和人力成本的增加，后來廠商在和試紙生產(chǎn)廠家的協(xié)調(diào)過程中，綜合用料成本和生產(chǎn)便利性基本確定了上面說的寬度，以次為標準.關(guān)于不同寬度的用途差異，稍后

4、詳述。 從生產(chǎn)的過程，我們可以得知，NC膜本身是已經(jīng)添加了表面活性劑來改善親水能力，而且已經(jīng)存在有一定的緩沖系統(tǒng)（雖然對紙條測試影響不會很大）。對后面談到的一些問題就比較容易理解。二.NC膜的供應(yīng)商及現(xiàn)狀 現(xiàn)在有銷售的NC膜品牌型號如下： MILLIPORE（美國），M135（有背襯/無背襯兩種） M180（有背襯/無背襯兩種） WHATMAN and S&S，Puraband impuraband SARTORIUS（德國），CN140 伊能（國產(chǎn)），8um 6um MDI（印度），8um 6um 說到這些供應(yīng)商，不得不談?wù)劙l(fā)展的歷史. S&S是膜行業(yè)的鼻祖，這點所有的膜公司都承認。mill

5、ipore，SARTORIUS和whatman都是后輩，我的理解是S&S在市場競爭的過程中經(jīng)營方式落后，最后被whatman收購。就產(chǎn)品質(zhì)量來說S&S的AE99和AE98是非常優(yōu)良的。而MDI是近年才出現(xiàn)的一個膜公司，可能也是與印度膠體金試紙生產(chǎn)行業(yè)的快速發(fā)展密切相關(guān)，其所有的產(chǎn)品都是在印度生產(chǎn)，經(jīng)營者為父子兩人，父親負責技術(shù)，兒子進行經(jīng)營。03年我曾測試過其樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在跑板方面有不均勻波浪現(xiàn)象，且加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果很不理想。今年初我又收到了一些樣品，情況仍然沒有太大改善，后來就不再考慮使用了。國產(chǎn)膜伊能是在去年開始進入市場的，主要特點是能降低成本，樣品我也試測了幾批，性能已經(jīng)與進口膜很接

6、近，經(jīng)過一些有針對性的優(yōu)化后可以用在HCG產(chǎn)品的生產(chǎn)。但不是所有的工廠都能購輕易的完成這個優(yōu)化工作。膜的國產(chǎn)化是一個趨勢，但進口廠家要實現(xiàn)國產(chǎn)化還面臨很大的問題，其中廠房設(shè)備的搬遷就是一個非常大的問題。幾家供應(yīng)商的國內(nèi)聯(lián)絡(luò)人和技術(shù)支持分別是 MILLIPORE（美國），Mrs Yang，harry WHATMAN and S&S，Clark，kevin SARTORIUS（德國），Mr Xu，Iric 伊能（國產(chǎn)），connie，Mr Yang MDI（印度），Ashawant Gupta 銷售模式都是直銷式，少量購買的情況下要通過代理商走一下帳。價格上MILLIPORE與WHATMAN相當，

7、SARTORIUS便宜一些，國產(chǎn)膜更便宜一些。印度膜和SARTORIUS價格相同，基本不用考慮。在科研市場，MILLIPORE使用最多?？蒲惺袌鲇捎趦H用來試驗，所以膜需求量小，不被供應(yīng)商重視。生產(chǎn)客戶中，MILLIPORE，WHATMAN，SARTORIUS占有量相當，伊能現(xiàn)在也開始有一些工廠客戶了，MDI量最小投訴也最多。 三.膜的選擇 以上談了該行業(yè)的一些發(fā)展現(xiàn)狀，那么我們大致了解后，回到最關(guān)心的問題，如何選擇膜？經(jīng)常會遇到的問題是，我是做*項目的，我該選擇那類膜？ 這里涉及到一個膜的分類標準問題，一個供應(yīng)商可能提供這個膜是8um，但另一個供應(yīng)商告訴你膜是135s的。這之間的區(qū)別與聯(lián)系是什

8、么？um指的是膜孔徑，而從上面膜的生產(chǎn)過程，我們可以看出，膜的孔徑實際上是沒有辦法界定的。由于干燥成型等過程的非絕對均一，膜的孔徑也是非均一的.膜孔徑的說法實際上是沿用了一直以來的一個形象稱呼.而以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時間是*s.該單位已經(jīng)越來越被各大廠商所接受，成為了一個通用的比較標準.以下我們將采用s單位來進行交流。換算情況大致為：8um=135s；6um=180s 不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)有什么影響呢？ 首先，我們分析一下液體在膜上的運動過程。一張長度為4cm的膜， 每隔1cm做一個標記， 當液體運動過標記處時記錄時間點. 那么你將會發(fā)現(xiàn)液體在膜上的運動是呈減速前行的。而兩張

9、不同秒數(shù)的膜（例如135s， 180s）在同一時間標記點處的運動速度不同.這個試驗用清水做不好觀察，可以考慮用色素水溶液，非常明顯。那么從這個試驗可以看出，在通過同一T線噴點位置時，金溶液通過的速度是快速膜慢速膜。那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這里就有一個讀數(shù)時間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。其實我們并沒有那么多選擇。經(jīng)過使用實踐，各供應(yīng)商一般都只提供兩個型號，就是135s和180s。

10、 雖然看到有些廠家的產(chǎn)品目錄上型號種類繁多，但這兩個型號的定貨量就占了95%以上，其他型號供貨上也就遠不如這兩個型號來得順利。135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. 你所要做的是，先選擇其中的一個型號， 然后比較不同供應(yīng)商同一個型號的差異，由于前面說的添加配方與你的試驗條件配合的不同，這個差異可能大也可能小。具體要根據(jù)試驗結(jié)果來確定最后的選擇。我個人不建議地毯式的測試不同規(guī)格/不同廠家的膜，這樣成本高，成功的幾率也小。四.膜的質(zhì)控方式 本節(jié)適合用膜量較大的公司用戶參考。對于一卷膜可以用上幾個月的用戶來說，廠家的質(zhì)控標準已經(jīng)完全能滿足你的要求，而不需要自己再做相關(guān)的質(zhì)控。膜的質(zhì)控

11、雖屬于原輔料QC職能，但由于其專業(yè)性強，一般都由小樣調(diào)試人員來執(zhí)行。膜入原料庫后需要進行如下檢驗工作： 1. 查收COA 在購買時， 供應(yīng)商會隨產(chǎn)品為每個lot的膜提供一張紙質(zhì)的出廠質(zhì)量證書， 該證書被稱為COA。如果你已經(jīng)購買某一批次的膜， 而沒有索取相應(yīng)的證書， 如果有需要可提供批號向廠家要求補發(fā)。其實在很多行業(yè)都有廠商為自己的產(chǎn)品附上COA的習慣。COA一般只提供給大客戶， 對小客戶是沒有意義的。其內(nèi)容主要是廠家在產(chǎn)品出廠時做過一些測試的羅列。作用可以理解為質(zhì)量憑證和測試數(shù)據(jù)參考。2. 檢查物理性能 膜的物理性能主要是2個參數(shù)， 膜厚度和寬度。長度不需要檢測。使用中可以關(guān)注長度上是否有斷

12、面重接現(xiàn)象， 斷面多費料則多， 少數(shù)發(fā)生。厚度，由螺旋測微尺，選擇幾個測量點檢測后算平均。膜生產(chǎn)的必測參數(shù)。主要表現(xiàn)為厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴散性能，點出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速。寬度，普通直尺測量。物理性能一般都不會有什么大問題。畢竟檢測標準客觀，易把握。沒有條件執(zhí)行的廠家可省略。 3. 跑水性能 樣本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易觀測，需制作一個簡易支架。操作：注入足夠溶液到下部槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標記（總長大于4cm）并放到傾斜支架，整個支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計時。記錄每個標記處的通過時刻，并與對照組比較。跑板時，理論上溶液呈水平線形

13、式上吸，觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反常現(xiàn)象。4. 點樣測試 C/T線出線時間，其他試驗條件相同情況下，記錄和比較C/T線出現(xiàn)時間是否與對照有差異。靈敏度，比較不同樣本濃度情況下，T線的變化是否和對照組同。一般每批次膜取前端一段用來測試即可。由于制造過程的不均一性， 不同批號的靈敏度會有一定差異，當大批量使用時，這種差異影響是非常大的，那么就要按照靈敏度表現(xiàn)將不同批號的膜進行分類。在膜的STOCK中要能夠輕易的分辨出來。當進入后期生產(chǎn)調(diào)用時，就能根據(jù)這些分類，按照訂單要求取用不同批號的膜，或者用強靈敏度的原料和差靈敏度的膜來搭配。 關(guān)于膜的批內(nèi)差。批內(nèi)差是肯定存在的，只是差距大小的問題，依據(jù)

14、一般的測試條件是很困難獲得詳細的數(shù)值，因為你不可能對每一卷膜的每一段都做詳細的測試。減小膜批內(nèi)差的最有效方法是不購入邊緣膜帶。前面說過膜的生產(chǎn)方式，生產(chǎn)出的半成品是寬幅很大的一個膜面，要通過截面裁切才能獲得25mm或者20mm的寬度。那么就有中間部分，和邊緣部分之分.越靠近中間部分，膜的均勻性越好，邊緣部分則相對要差，就造成了批內(nèi)差。一般可以通過COA獲得具體位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C來表示切出的窄膜在寬幅膜中的位置。如果是試用某個型號的膜小樣，還需要在以上檢測后加入膜加速老化試驗，包括膜單獨的老化試驗和點好膜后產(chǎn)品的老化試驗， 具體試驗方法請參看我以前寫的研發(fā)

15、思路一文。 五.膜的深入探討和應(yīng)用技巧 從本節(jié)開始，我們開始對膜進行深入討論和談一些應(yīng)用技巧。1. 蛋白與膜的結(jié)合原理 蛋白與膜的結(jié)合原理， 已知的結(jié)合力包括疏水作用力H鍵靜電作用力等，確切的結(jié)合原理并不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：1）首先兩者靠靜電作用力結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結(jié)合。 2）首先兩者靠疏水作用結(jié)合，然后靠靜電作用來維持長時間結(jié)合。兩條假說，都表明其結(jié)合過程分為兩步，首先結(jié)合和后面長時間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性，導致在這方面的工作非常依賴實踐經(jīng)驗。2. 膜對結(jié)合的影響 1）膜孔徑 有些技術(shù)人員傾向使用膜孔徑來區(qū)分不同的膜，但是請注意這只僅僅限于同一廠

16、家的產(chǎn)品，如果是不同廠家的產(chǎn)品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關(guān)系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結(jié)合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數(shù)為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。 另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那么金標復合物通過T線的時間也就越長，反應(yīng)也就越充分。綜合以上兩點，結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。 2）不同廠家的膜差異 這個差異主要來源于兩點：1生產(chǎn)膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數(shù)量不同。同理，在膜

17、處理中這兩類物質(zhì)一般會對性能產(chǎn)生較大影響。 2 處理過程不同。3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方 1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。首先，單克隆抗體與膜的結(jié)合優(yōu)于多克隆抗體，主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的最佳結(jié)合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了優(yōu)化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結(jié)合到固相材料上。 2）緩沖液 大家最關(guān)心的可能就是希望獲得一個性能優(yōu)良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。 其實我也無法提供給你一個萬用配方清單。因為不同的反應(yīng)體系需要不同的配方來支持， 而不同機構(gòu)的反應(yīng)體系又有差異。想獲”魚”先學”漁”.。為

18、了不誤導大家，我在下面涉及到配方的問題上，僅提供思路，具體配方請自己摸索。緩沖液的構(gòu)成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質(zhì)（針對某一特定問題）+PH調(diào)整. 我在參考過以前的各種資料后，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據(jù)自己的需要添加作用物質(zhì)，原來的很多需要添加的作用物質(zhì)，由于膜制造技術(shù)的改進已經(jīng)不再需要。推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應(yīng)性。作用物質(zhì)的情況大致羅列如下：少量NACL，減少信號強度，消假陽。有機醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利于結(jié)合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。表面活性劑（TW20，TX100

19、），增加親水力，可避免線條中空現(xiàn)象，也可增色。糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。調(diào)PH到某個位置，可以消假陽。 4. 點樣環(huán)境 環(huán)境濕度對點膜過程非常重要。最佳濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現(xiàn)散點，導致測試會出現(xiàn)疏水斑。濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。 5. 點樣儀器與膜面情況的關(guān)系 目前有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式.非接觸點膜式優(yōu)于劃膜式，進口劃膜式優(yōu)于國產(chǎn)劃膜式。 因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆，劃管會在其

20、表面留下印痕.進口的劃膜機由于使用的材料和控制系統(tǒng)較好，所以留下的劃痕較輕，而國產(chǎn)儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標復合物形成阻力，導致假陽性。 同時容易出現(xiàn)跑板時在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細線（鬼線），而跑板結(jié)束后鬼線消失的奇怪現(xiàn)象。 6. 膜的寬度與點樣位置 膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標復合物通過T線位置時速度變慢，反應(yīng)時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。 7. 溶液在膜上的擴散 溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當干燥時線條邊緣的干燥速度高于中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發(fā)現(xiàn)線條出現(xiàn)兩端紅，中間淡的現(xiàn)象，就要考慮這個問題了?？梢约尤缟厦嬲f的作用物質(zhì)來解決。 8. 點膜前后的封閉作用 從供應(yīng)商處購買回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經(jīng)常會遇到關(guān)于封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什么問題都