北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系賈弘禔

1、北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系生物化學(xué)與分子生物學(xué)系賈弘禔核酸的化學(xué)與生物合成核酸的化學(xué)與生物合成 核酸的化學(xué)與生物合成核酸的化學(xué)與生物合成 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、核酸的發(fā)現(xiàn)一、核酸的發(fā)現(xiàn) 1868 meischer- 從膿球發(fā)現(xiàn)從膿球發(fā)現(xiàn)“核素核素” 1944 avery et al- 肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 1952 hershey, chase-噬菌體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)噬菌體標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 1950 chargaff et al- chargaff法則法則 1953 watson，crick-dna雙螺旋雙螺旋 1973 boyer，cohen-dna clo

2、ning(克?。┛寺。?1976 dna sequencing(序列分析）序列分析） 1990 human genome project 二、核酸的種類、分布和含量二、核酸的種類、分布和含量1. 種類種類 deoxyribonucleic acid（dna） ribonucleic acid（rna） ribosome rna(rrna) transfer rna(trna) messenger rna(mrna)2. 分布分布 dna rna 核（核（%） 98 903. 含量含量 dna恒定，恒定，rna與細(xì)胞生長狀態(tài)有關(guān)與細(xì)胞生長狀態(tài)有關(guān)三、核酸的功能三、核酸的功能 dna-遺傳、遺傳、

3、rna-參與蛋白質(zhì)合成參與蛋白質(zhì)合成 第二節(jié)第二節(jié) 核酸的分子組成核酸的分子組成一、元素組成一、元素組成 c h o n （恒定，（恒定，910%）磷酸磷酸核苷（核苷（nucleoside) 戊糖戊糖-ribose(r) deoxyribose(dr) 堿基堿基 a g u c a g t c 核酸核酸多聚核苷酸（多聚核苷酸（polynucleotides)n核苷酸（核苷酸（nucleotide)p二、基本結(jié)構(gòu)單位二、基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸核苷酸 dna、rna組成異同組成異同 dna rna磷酸磷酸 磷酸磷酸 磷酸磷酸戊糖戊糖 2脫氧脫氧核糖（核糖（dr) 核糖（核糖（r）堿基堿基 嘌呤嘌呤 a

4、、g a、g 嘧啶嘧啶 c、t c、u 堿基堿基 戊糖戊糖o 核苷、核苷酸核苷、核苷酸 其它核苷酸其它核苷酸 nad、fad、camp、cgmp、5-fu、6-mp 1）2、3、5nmp， 3、5dnmp， 主要是主要是 5nmp、dnmp，dnarna組成組成 2）ntpdntp ndpdndp 多磷酸核苷酸，能量代謝多磷酸核苷酸，能量代謝 3）環(huán)核苷酸）環(huán)核苷酸 camp、cgmp 第二信使第二信使 4）nadnadp fadfmn 輔酶，生物氧化輔酶，生物氧化 5）抗代謝藥物）抗代謝藥物 6mp，5-fu小結(jié)小結(jié) 第三節(jié)第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu)核酸的分子結(jié)構(gòu) 一、一、 核苷酸的連接核苷酸的

5、連接3,5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵表示法表示法 pcpcpa pc-c-a 5-cca-3 二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu) 多核苷酸鏈內(nèi)核苷酸的排列順序多核苷酸鏈內(nèi)核苷酸的排列順序 三、三、dna的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu) dna的堿基組成（的堿基組成（chargaff法則）法則） 有種屬特異性有種屬特異性 無組織、器官特異性無組織、器官特異性 不受年齡、營養(yǎng)和環(huán)境的影響不受年齡、營養(yǎng)和環(huán)境的影響 不論種屬、組織來源，所有不論種屬、組織來源，所有dna分子分子 a t、g c a/t g/c 1 a + g t + c dna的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) dna sequence /dna sequenc

6、ing dna的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu) watson, crick （1953）在）在chargaff法則及法則及wilkins,franklin的的x線衍射工作基礎(chǔ)上提出線衍射工作基礎(chǔ)上提出dna的的double helix結(jié)構(gòu)模型結(jié)構(gòu)模型 dna分子由相互平行、走向相反、堿基互補(bǔ)分子由相互平行、走向相反、堿基互補(bǔ)的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，盤繞的兩條脫氧核糖核苷酸鏈圍繞同一中心軸，盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小成雙螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋的一側(cè)為大溝，另一側(cè)為小溝。溝。 磷酸磷酸脫氧核糖形成的長鏈骨架在外，堿脫氧核糖形成的長鏈骨架在外，堿基在內(nèi)，兩平行鏈對(duì)應(yīng)

7、堿基間以氫鍵相連；對(duì)應(yīng)基在內(nèi)，兩平行鏈對(duì)應(yīng)堿基間以氫鍵相連；對(duì)應(yīng)堿基總是堿基總是a=t、g = c配對(duì)（配對(duì)（base pairing)或或互補(bǔ)，形成穩(wěn)定聯(lián)系?；パa(bǔ)，形成穩(wěn)定聯(lián)系。 各堿基平面垂直或基本垂直于雙螺旋中心軸，各堿基平面垂直或基本垂直于雙螺旋中心軸，鏈內(nèi)堿基間形成縱向鏈內(nèi)堿基間形成縱向vander waals力與長軸平力與長軸平行，使雙螺旋更穩(wěn)定。行，使雙螺旋更穩(wěn)定。 相臨堿基對(duì)間距離為相臨堿基對(duì)間距離為0.34nm,每周螺距為每周螺距為3.4nm(10bp), d為為 2nm (b型）型） dna double helix類型類型 helix type bp/turn rotat

8、ion/bp vertical rise/bp helical d a 11 +34.7 2.56a 23a b 10 +34.0 3.38a 19a c 9.33 +38.6 3.32a 19a z 12 -30.0 5.71a 18a dna的高級(jí)結(jié)構(gòu)的高級(jí)結(jié)構(gòu) 超螺旋超螺旋 如線粒體如線粒體dna 細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒dna 病毒病毒dna 核小體結(jié)構(gòu)核小體結(jié)構(gòu) 2 (h2ah2b h3 h4 )/dna(146bp) =核心顆粒核心顆粒 超螺線管超螺線管染色質(zhì)染色質(zhì) 四、四、 rna的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu) rna的種類（見前）的種類（見前） rna的堿基組成的堿基組成 a u g c 稀有堿

9、基稀有堿基 rna的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 核苷酸序列核苷酸序列 3,5磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵連接 rna高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu) trna的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu) 7090 nt 二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu) 三葉草形狀三葉草形狀 三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu) 倒倒“l(fā)”形形accdhu環(huán)環(huán)t 環(huán)環(huán)反密碼環(huán)反密碼環(huán)5額外環(huán)額外環(huán) mrna的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)3-poly a(30200);5-7甲基鳥苷甲基鳥苷三磷酸三磷酸;中間為密碼子中間為密碼子 codon第四節(jié)第四節(jié) 核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì) 一、酸性化合物一、酸性化合物 兩性兩性但酸性強(qiáng)但酸性強(qiáng) 電泳行為電泳行為泳向正極（泳向正極（ph7-8） 沉淀行為沉淀行為加鹽

10、（中和電荷）加鹽（中和電荷） m+與磷酸與磷酸“-”中和；乙醇中和；乙醇 二、高分子性質(zhì)二、高分子性質(zhì) 粘度粘度 dnarna 超離心沉降超離心沉降 凝膠過濾凝膠過濾 三、三、uv吸收吸收 260nm 四、變性、復(fù)性與雜交四、變性、復(fù)性與雜交 核酸在理、化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞稱核酸變性。根據(jù)核酸在理、化因素作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞稱核酸變性。根據(jù)變性因素區(qū)分為堿變性、熱變性等。如變性因素區(qū)分為堿變性、熱變性等。如dna的堿變性、的堿變性、dna的熱的熱變性，其中以變性，其中以dna的熱變性更具典型意義的熱變性更具典型意義dna的熱變性的熱變性 粘度改變，鋼性線性分子變得無序，粘度下降粘度改

11、變，鋼性線性分子變得無序，粘度下降 uv吸收增強(qiáng)，其規(guī)律如下：吸收增強(qiáng)，其規(guī)律如下： 80 90 100 100%50%od260（254） tm 變性溫度范圍變性溫度范圍 高色效應(yīng)高色效應(yīng) hyperchromic effect 核酸變性后、氫鍵破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，紫外吸收核酸變性后、氫鍵破壞，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，紫外吸收（260nm）增強(qiáng)，謂高色效應(yīng)）增強(qiáng)，謂高色效應(yīng) 解鏈溫度解鏈溫度融解溫度融解溫度 melting temperature，tm uv吸收增值達(dá)到最大吸收增值吸收增值達(dá)到最大吸收增值50%時(shí)的溫度，稱時(shí)的溫度，稱tmtm值與值與 dna g+c含量有關(guān)，含

12、量有關(guān)，g+c含量愈大，含量愈大，tm愈高，反之則反愈高，反之則反 與核酸分子長度有關(guān)，分子愈長，與核酸分子長度有關(guān)，分子愈長，tm愈高。愈高。 變性溫度范圍與變性溫度范圍與dna樣品均一性有關(guān)，分子種類愈純（單一），樣品均一性有關(guān)，分子種類愈純（單一），長度愈一致，其變性范圍愈窄，反之則變性溫度范圍愈寬。長度愈一致，其變性范圍愈窄，反之則變性溫度范圍愈寬。 dna變性的復(fù)性變性的復(fù)性 renaturation dna發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的發(fā)生熱變性后，經(jīng)緩慢降溫，如放置室溫逐漸冷卻，解開的互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)再形成氫鍵，恢復(fù)完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱互補(bǔ)鏈之間對(duì)應(yīng)的

13、堿基對(duì)再形成氫鍵，恢復(fù)完整的雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱dna熱變性的復(fù)性。熱變性的復(fù)性。核酸復(fù)性時(shí)核酸復(fù)性時(shí)uv下降，此稱低色效應(yīng)下降，此稱低色效應(yīng) hypochromic effect dna熱變性后緩慢冷卻處理過程稱退火熱變性后緩慢冷卻處理過程稱退火 annealing dna加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來不及配對(duì)互加熱變性后，若經(jīng)驟然降溫，互補(bǔ)鏈堿基之間來不及配對(duì)互補(bǔ)，形成氫鍵聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。補(bǔ)，形成氫鍵聯(lián)系，兩鏈維持分離狀態(tài)。慢慢驟驟 核酸分子雜交核酸分子雜交 hybridization 當(dāng)不同來源的核酸變性后一起復(fù)性時(shí)，只要這些核酸分子中含有當(dāng)不同來源的核酸變性后一起復(fù)性時(shí)，

14、只要這些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成堿基配對(duì)，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核相同序列的片段，即可形成堿基配對(duì)，出現(xiàn)復(fù)性現(xiàn)象，形成雜種核酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。酸分子，或稱雜化雙鏈，稱核酸分子雜交。核酸分子雜交核酸分子雜交第五節(jié)第五節(jié) dna的生物合成的生物合成一、一、dna生物合成的概念生物合成的概念生物體內(nèi)由dnap催化合成dna的過程，包括 dddp指導(dǎo)的dna合成復(fù)制 rddp指導(dǎo)的dna合成反轉(zhuǎn)錄 dddp、重組酶或sos系統(tǒng)酶參與的dna修復(fù)二、二、dna的復(fù)制合成的復(fù)制合成半保留復(fù)制概念復(fù)制起始點(diǎn)（ori）和方向（53）復(fù)制體系e.coli為例dnab（識(shí)別ori）、解旋酶(topo)、解鏈蛋白(rep蛋白)、引發(fā)酶/前體、dnapiii、dnapi、dna連接酶半保留復(fù)制半保留復(fù)制插入 dnadn