細胞內(nèi)化學(xué)組分測

1、細胞內(nèi)化學(xué)組分測定分析技術(shù)流式細胞技術(shù)流式細胞技術(shù) 流式細胞技術(shù)流式細胞計基本結(jié)構(gòu) 流式細胞計的基本結(jié)構(gòu)流式細胞計主要由四部分組成。它們是：n流動室和液流系統(tǒng)；n激光源和光學(xué)系統(tǒng)；n光電管和檢測系統(tǒng)；n計算機和分析系統(tǒng)。 原理 待測樣品(如細胞、染色體、精子或細菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過殼液包圍的進樣管而進入流動室，排成單列的細胞，由流動室的噴嘴噴出而成為細胞液流，并與入射激光束相交。細胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細胞液流成 90處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長。熒光檢測器為光電倍增管。

2、散射光檢測器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細胞大小有關(guān)。激光光源光收集系統(tǒng)：濾光片光收集系統(tǒng)：光電倍增管液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)facs vantage diva 科研型（大型機）應(yīng)用舉例 流式細胞術(shù)在細胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床腫瘤學(xué)、臨床血液學(xué)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用 ：1.在細胞生物學(xué)方面的應(yīng)用 細胞生物學(xué)是fcm應(yīng)用最廣泛也是最基本的領(lǐng)域，細胞周期分析是其基本分析內(nèi)容之一，而實施的技術(shù)途徑是通過測定細胞周期各時相的dna含量來達到的 。 2在免疫學(xué)方面的應(yīng)用： fcm以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基

3、礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)測、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分?；诿庖呒夹g(shù)是免疫細胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹fcm在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問題。 3.在遺傳學(xué)研究的應(yīng)用： 用流式細胞術(shù)測定染色體dna含量,可得到染色體頻率分布圖，稱為流式染色體核型分析。同類型染色體出現(xiàn)一個峰，峰的面積代表這種類型染色體的豐度。流式染色體核型分析技術(shù)不僅能快速分析核型，而且能分選出不同類型的染色體,做成人類每條染色體的dna文庫，可用于人類基因組研究、遺傳病和癌癥的診斷的研究。

4、4在腫瘤學(xué)研究的應(yīng)用： 腫瘤細胞一般都含有異常數(shù)量的 dna。在大多數(shù)實體瘤和急性白血病中都發(fā)現(xiàn)有非整倍體的細胞，由于流式細胞術(shù)樣品制備方法簡單，測定結(jié)果精確，能快速得到有關(guān)dna倍性的信息,因而能提供有價值的診斷數(shù)據(jù)。如果在測量 dna含量的同時，再測定其他參數(shù)（如不同類型的中等纖維蛋白，蛋白質(zhì)含量、細胞大小、核質(zhì)比等）則可進一步提高診斷的可靠性。 。 此外，流式細胞術(shù)在血液學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域中也得到廣泛的應(yīng)用。 流式細胞術(shù)正在向高靈敏、高速度、多參數(shù)測量、獲取形態(tài)學(xué)信息等方面發(fā)展。 放射自顯影技術(shù) 放射自顯影技術(shù)是利用感光材料的感光特性，使之感受放射性核素的涉嫌后，通過顯影和定

5、影而得到和標(biāo)本中偶那個放射性示蹤劑所在部位、強度完全一致的銀粒影像的技術(shù)，所得到的圖像稱之為放射自顯影影像。原理 將放射性同位素（如14c和3h）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)一定時間的放射性曝光，組織中的放射性即可使乳膠感光。然后經(jīng)過顯影、定影處理顯示還原的黑色銀顆粒，即可得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量，放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)記上放射性的化合物進行定位或相對定量測定。 n1.發(fā)射電子： 核乳膠被發(fā)射源帶電粒子作用 負電的鹵素離子中釋放電子 agbr+ ag+br-+e-n離子對形成：當(dāng)電離離子通過溴化銀晶

6、體時形成許多離子對n3.銀原子形成：溴離子所發(fā)出的電子被帶正電的銀離子所俘獲。e-+ag+ agn4.潛影形成：俘獲電子的過程，是還原過程，很多帶正電的銀原子被還原，在溴化銀分子中形成潛影。n5.顯影、定影形成：顯影：是形成潛影的鹵化銀晶體在顯影過程中被還原成銀鹽顆粒，顯出影像定影：未形成潛影的晶體通過定影而溶解 放射自顯影成像圖片用途 放射自顯影術(shù)（radioautography）用于研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。應(yīng)用舉例 研究藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、毒物在器官、組織、細胞中的分布、運轉(zhuǎn)，以及分析其合成、更新、蓄積作用機理等。研究特異性標(biāo)

7、記前體（如胸腺嘧啶核苷酸dna前體）的滲入部位、特點、影響因素等，探討生物活性分子代謝部位機理。標(biāo)記抗體或藥物在離體那個同位素標(biāo)記。標(biāo)本上顯示抗原或抗體位置，祚定位示蹤。用于核算中堿基程序的檢測原位雜交時其探針用同位素標(biāo)記。特點定位精確，靈敏度高，分辨率好，能保存相當(dāng)長時間；操作簡便，無需復(fù)雜設(shè)備；可供定量研究和雙同位素示蹤；將形態(tài)、機能和代謝地研究統(tǒng)一起來；研究某些大分子在體內(nèi)地動態(tài)變化過程。 免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫組織化學(xué)技術(shù)是用顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術(shù)。原理 先將組織或細胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出

8、來，以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結(jié)合，將抗原放大，由于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑dab顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，顯示細胞或組織中的化學(xué)成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、含量。 n1、免疫熒光方法 是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上

9、熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用比較廣。n2、免疫酶標(biāo)方法 免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術(shù)。基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。 本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點是：定位準(zhǔn)確，對

10、比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。n3、免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌a蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。 免疫組織化學(xué)技術(shù)照片用途 組織

11、或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進行檢測。應(yīng)用舉例 1 確定細胞類型通過特定抗體標(biāo)記出細胞內(nèi)相應(yīng)抗原成分，以確定細胞類型。如角蛋白是上皮性標(biāo)記，前列腺特異性抗原僅見于前列腺上皮，甲狀腺球蛋白抗體是甲狀腺濾泡型癌的敏感標(biāo)記，而降鈣素抗體是甲狀腺髓樣癌的特有標(biāo)記。有些細胞（如表皮內(nèi)朗格漢斯細胞、黑色素細胞、淋巴結(jié)內(nèi)指突狀和樹突狀網(wǎng)織細胞）光鏡下不易辨認，但免疫組化標(biāo)記（s-100蛋白等）能清楚顯示其形態(tài)。2 辨認細胞產(chǎn)物利用某些細胞產(chǎn)物為抗原制備的抗體，可作為相應(yīng)產(chǎn)物的特殊標(biāo)記，如內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生的各種激素，

12、大多數(shù)可用免疫組化技術(shù)標(biāo)記出來，據(jù)此可對內(nèi)分泌腫瘤作功能分類，檢測分泌異位激素的腫瘤等。 3 了解分化程度大多數(shù)標(biāo)記物都有其特定的分布部位，如上皮細胞膜抗原（ema）著色部位在細胞膜上，但差分化乳癌胞漿內(nèi)也可出現(xiàn)陽性顆粒；角蛋白的含量也與分化程度有關(guān)，低分化或未分化癌含量較低、染色較弱。4 鑒定病變性質(zhì)通過標(biāo)記ig輕鏈（、）可區(qū)分部分b細胞性淋巴瘤與b細胞反應(yīng)性增生，前者常表達單一的ig輕鏈（+/+），后者常為多ig輕鏈（+、+）。而標(biāo)記bcl-2蛋白在區(qū)別濾泡型淋巴瘤和反應(yīng)性濾泡增生上有相當(dāng)?shù)囊饬x。在濾泡型淋巴瘤，90%以上腫瘤性濾泡細胞有bcl-2的高表達；而在濾泡反應(yīng)性增生時，濾泡反應(yīng)中

13、心的細胞不表達bcl-2蛋白，而套細胞則表達。n5 發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶某些癌的早期轉(zhuǎn)移有時與淋巴結(jié)內(nèi)竇性組織細胞增生不易區(qū)別。用常規(guī)病理組織學(xué)方法要在一個組織中認出單個轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞或幾個細胞是不可能的，而采用免疫組化方法（如用上皮性標(biāo)志）則十分有助于微?。ò┺D(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)。對轉(zhuǎn)移性腫瘤也可借助免疫組化標(biāo)志尋找原發(fā)瘤，如骨組織內(nèi)有前列腺特異性抗原陽性細胞，提示前列腺癌轉(zhuǎn)移。n6 探討腫瘤起源或分化表型一些來源不明的腫瘤長期爭論不休，最后通過免疫組化標(biāo)記取得共識。如顆粒性肌母細胞瘤，曾被認為是肌源性的，但該腫瘤肌源性標(biāo)記陰性，而神經(jīng)性標(biāo)記陽性，證明為神經(jīng)來源（可能來自神經(jīng)鞘細胞）。分化很差的腫瘤病理

14、上常按細胞形態(tài)分為梭形細胞腫瘤、小圓細胞腫瘤等，通過多種標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用，也可能確定其來源。n7 確定腫瘤分期判斷腫瘤是原位還是浸潤及有無血管、淋巴管侵襲與腫瘤分期密切相關(guān)。用常規(guī)病理方法判斷有時是十分困難的，但用免疫組化法可獲得明確結(jié)果。如采用層粘連蛋白和型膠原的單克隆抗體可清楚顯示基底膜的主要成分，一旦證實上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸潤癌了，其預(yù)后是不同的。用第八因子相關(guān)蛋白、荊豆凝集素等顯示血管和淋巴管內(nèi)皮細胞的標(biāo)記物則可清楚顯示腫瘤對血管或淋巴管的浸潤。對許多腫瘤的良惡性鑒別及有無血管或淋巴管浸潤，這是主要的鑒別依據(jù)，同時也有治療及預(yù)后意義。 特點n1、特異性強 免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，lca顯示淋巴細胞成分。只有當(dāng)組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。n2、敏感性高 在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間