地中海貧血分子基礎(chǔ)和產(chǎn)前診斷-徐湘民

1、北海，北海， 20132013年年 8 8月月23-2523-25日日 異常血紅蛋白異常血紅蛋白 地中海貧血地中海貧血 (地貧地貧) 遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白 Hereditary persistence of fetal hemoglobin(HPFH)l 全球每年約有全球每年約有790萬(wàn)出生缺陷患兒出生萬(wàn)出生缺陷患兒出生l 5中常見的疾病占中常見的疾病占7000種出生缺陷的種出生缺陷的25%l 血紅蛋白病的發(fā)病率位于第三位血紅蛋白病的發(fā)病率位于第三位204060801001200中國(guó)南方高發(fā)地區(qū)中國(guó)南方高發(fā)地區(qū)人群攜帶率人群攜帶率3%-24%珠海珠海 3140韶關(guān)韶

2、關(guān) 3444廣州廣州 2604汕頭汕頭 1049湛江湛江 3160 正常人群正常人群88.93%11種突變種突變12種突變種突變 防城港市防城港市 224百色市百色市 834柳州市柳州市 790賀州市賀州市 1033玉林市玉林市 1349南寧市南寧市 1559 正常人群正常人群75.86%17.55% -地地貧貧正常人群正常人群75.86 %9種突變種突變13種突變種突變 常染色體隱性遺傳病常染色體隱性遺傳病 致病基因：致病基因： 突變純合子：突變純合子： 病理學(xué)基礎(chǔ)：病理學(xué)基礎(chǔ)： -地中海貧血地中海貧血臨床綜合征臨床綜合征 正常正常 正常正常 -地中海貧血特征地中海貧血特征 -地中海貧血特征

3、地中海貧血特征Hb H Hb H 病病 中間型中間型 -地中海貧血地中海貧血 BartBarts s胎兒水腫綜合征胎兒水腫綜合征 重型重型 - -地中海貧血地中海貧血 -地中海貧血地中海貧血臨床綜合征臨床綜合征 小細(xì)胞低色素性溶血型貧血小細(xì)胞低色素性溶血型貧血 (中、重度中、重度)黃疸黃疸肝脾腫大肝脾腫大 (脾大明顯脾大明顯)骨髓擴(kuò)增骨髓擴(kuò)增發(fā)育遲緩發(fā)育遲緩合并感染合并感染Barts 水腫胎水腫胎( 地貧地貧,宮內(nèi)或出生后半小時(shí)內(nèi)死亡宮內(nèi)或出生后半小時(shí)內(nèi)死亡) RBC 參數(shù)參數(shù) MCV MCH 細(xì)胞形態(tài)變化細(xì)胞形態(tài)變化 Hb 成分分析成分分析 Hb A2 ( ) 或或 ( ) Hb Barts

4、 Hb H ( ) Hb E ( ) 1 2 3 4 5Normal AA2 AE Barts AF HA+ +- -500V, 25min1. 正常人正常人Hb2. 輕型輕型 地貧地貧 3. 異常異常Hb E雜合子雜合子4. 新生兒新生兒Hb Barts ( 4, 地貧標(biāo)準(zhǔn)型）地貧標(biāo)準(zhǔn)型）5. Hb H 輕度黃疸輕度黃疸 肝脾腫大肝脾腫大( (脾大明顯脾大明顯) ) 骨髓擴(kuò)增骨髓擴(kuò)增 合并感染合并感染不需進(jìn)行常規(guī)輸血治療不需進(jìn)行常規(guī)輸血治療血紅蛋白水平維持在血紅蛋白水平維持在60-100g/L水平水平 發(fā)病年齡在發(fā)病年齡在2歲以后歲以后, 或成年期發(fā)病或成年期發(fā)病 輕度黃疸輕度黃疸 肝脾腫大

5、肝脾腫大 (脾大明顯脾大明顯) 骨髓擴(kuò)增骨髓擴(kuò)增 合并感染合并感染不需進(jìn)行常規(guī)輸血治療不需進(jìn)行常規(guī)輸血治療血紅蛋白水平維持在血紅蛋白水平維持在60-100g/L水平水平發(fā)病年齡在發(fā)病年齡在2歲以后歲以后, 或成年期發(fā)病或成年期發(fā)病 l 重癥地貧患兒的出生是世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問題重癥地貧患兒的出生是世界公認(rèn)的公共衛(wèi)生問題l 通過產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是首選預(yù)防措施通過產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是首選預(yù)防措施l WHO優(yōu)先推薦在發(fā)展中國(guó)家實(shí)施預(yù)防的遺傳性疾病優(yōu)先推薦在發(fā)展中國(guó)家實(shí)施預(yù)防的遺傳性疾病l 預(yù)防地貧是中國(guó)南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求預(yù)防地貧是中國(guó)南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求 -珠

6、蛋白基因缺失珠蛋白基因缺失 中間型地貧中間型地貧: 復(fù)雜變異復(fù)雜變異 -珠蛋白基因點(diǎn)突變珠蛋白基因點(diǎn)突變 中間型地貧中間型地貧:復(fù)雜變異復(fù)雜變異 -珠蛋白基因點(diǎn)突變珠蛋白基因點(diǎn)突變 2 1 2 1 3HVRinterHVR53CD59 IVS IIVS II UTRUTR53CD13CD31CD125 CD122 CD142 CD4445CD49CD30CD78 CD74 CD118 EXON IIEXON I EXON III / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ -珠蛋白基因珠蛋白基因缺失

7、缺失 中間型地貧中間型地貧: :復(fù)雜變異復(fù)雜變異 -珠蛋白基因點(diǎn)突變珠蛋白基因點(diǎn)突變 -珠蛋白基因缺失珠蛋白基因缺失 中間型地貧中間型地貧: :復(fù)雜變異復(fù)雜變異 -珠蛋白基因缺失珠蛋白基因缺失 中間型地貧中間型地貧: :復(fù)雜變異復(fù)雜變異 -珠蛋白基因點(diǎn)突變珠蛋白基因點(diǎn)突變 -珠蛋白基因缺失珠蛋白基因缺失 -珠蛋白基因點(diǎn)突變珠蛋白基因點(diǎn)突變 人群攜帶者篩查發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)家庭人群攜帶者篩查發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)家庭 基于基于DNA分析的胎兒基因型分析的胎兒基因型診斷診斷 胎兒取樣胎兒取樣 家系分析家系分析 基于基于DNA分析的胎兒基因型診斷分析的胎兒基因型診斷 胎兒取樣胎兒取樣 家系分析家系分析 全血細(xì)胞計(jì)數(shù)全血

8、細(xì)胞計(jì)數(shù) MCV (80fL) MCH ( 5% l -地貧地貧:基因基因分析技術(shù)分析技術(shù)l -地貧地貧:基因基因分析技術(shù)分析技術(shù) Reverse Dot Blot （RDB）: 反向點(diǎn)雜交反向點(diǎn)雜交 probe melting curve-based genotyping assay （PMCA）: 基于基于探針探針熔解曲線的基因分型熔解曲線的基因分型 Gap-PCR : 缺口缺口PCR Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification （MLPA）: 多重連接探針擴(kuò)增多重連接探針擴(kuò)增 檢測(cè)檢測(cè)基因拷貝數(shù)的基因拷貝數(shù)的熒光定量熒光定量PCRl

9、3種缺失型種缺失型 地貧檢測(cè)試劑盒：?jiǎn)喂芏嘀氐刎殭z測(cè)試劑盒：?jiǎn)喂芏嘀豨ap-PCR法法l 17種種 地貧突變檢測(cè)試劑盒：反向點(diǎn)雜交法地貧突變檢測(cè)試劑盒：反向點(diǎn)雜交法l 多位點(diǎn)缺失型多位點(diǎn)缺失型 地貧檢測(cè)試劑盒：地貧檢測(cè)試劑盒： PCR熒光探針法熒光探針法l 25 種種 地貧突變檢測(cè)試劑盒：熒光地貧突變檢測(cè)試劑盒：熒光PCR熔解曲線法熔解曲線法- HW-THAI- FIL - SEA-11Kb 4.2 3.7 2 1 1 3HVRHVR 1 210kb0kb20kb 30kb 40kb 50kb53 1 基因基因2個(gè)拷貝個(gè)拷貝 看家基因看家基因2個(gè)拷貝個(gè)拷貝 1 基因基因1個(gè)拷貝個(gè)拷貝 看家基因

10、看家基因2個(gè)拷貝個(gè)拷貝 1 基因基因0個(gè)拷貝個(gè)拷貝 看家基因看家基因2個(gè)拷貝個(gè)拷貝CtCt值值CtCt33334No 01 3個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán) 3個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán) 3個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán) 4個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán) 3個(gè)個(gè)循循環(huán)環(huán)PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增 -SEA/, - 3.7/- 4.2/等基因分型等基因分型-SEA, - 3.7, - 4.2 等單倍型分析等單倍型分析 珠蛋白基珠蛋白基因拷貝數(shù)因拷貝數(shù) -地貧分子診斷地貧分子診斷: 臨床表型與基因分型臨床表型與基因分型Gap-PCR定性定性檢測(cè)基因缺失檢測(cè)基因缺失待檢人待檢人基因基因組組DNAPMCA. SamplesVariant IdentifiedPCR/melt

11、ing analysisHybridizationMembrane WashingPCRRDBMeltProSignal DevelopmentPCRDirect SequencingPCR Clean-UpSequencing PCRCapillary Electrophoresis(260 min)Variant IdentifiedVariant Identified(370 min)(160 min)30 min3 reactions100 min15 min100 min120 min45 min120 min2 reactions160 min1 reaction100 min 擴(kuò)

12、展家系篩查計(jì)劃擴(kuò)展家系篩查計(jì)劃 基于醫(yī)院水平的預(yù)防計(jì)劃基于醫(yī)院水平的預(yù)防計(jì)劃 基于社區(qū)或行政區(qū)的預(yù)防計(jì)劃基于社區(qū)或行政區(qū)的預(yù)防計(jì)劃 世界衛(wèi)生組織的出生缺陷世界衛(wèi)生組織的出生缺陷“三級(jí)預(yù)防三級(jí)預(yù)防”策略策略 孕前和孕期干預(yù)是我國(guó)出生缺陷預(yù)防的重點(diǎn)孕前和孕期干預(yù)是我國(guó)出生缺陷預(yù)防的重點(diǎn) 斗門區(qū)斗門區(qū) 金灣區(qū)金灣區(qū) 香洲區(qū)香洲區(qū) l 統(tǒng)一調(diào)度統(tǒng)一調(diào)度l 質(zhì)量控制質(zhì)量控制l 轉(zhuǎn)診病例確診轉(zhuǎn)診病例確診l 高風(fēng)險(xiǎn)對(duì)象建檔高風(fēng)險(xiǎn)對(duì)象建檔l 產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷一級(jí)技術(shù)中心一級(jí)技術(shù)中心l 宣傳教育宣傳教育l 攜帶者篩查攜帶者篩查l 病例轉(zhuǎn)診病例轉(zhuǎn)診l 遺傳咨詢遺傳咨詢l 隨訪隨訪二級(jí)檢測(cè)站二級(jí)檢測(cè)站斗門市婦幼保健院斗門市婦幼保健院唐家鎮(zhèn)醫(yī)院唐