生物工程下游技術第十一章無機基質高效色譜填料

1、第十一章第十一章 無機基質高效色譜填料無機基質高效色譜填料微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型離子交換層離子交換層惰性核惰性核惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆離子交換劑硅膠層涂覆實 心 微 球全 孔 微 球灌 注 微 粒固 定 相 外 殼固 體核擴 散 孔通 孔hplchplc中常用的幾種微粒類型中常用的幾種微粒類型 硅膠硅膠 可控孔徑玻璃可控孔徑玻璃 其它：氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、其它：氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、碳和石墨微球。碳和石墨微球。 制備制備: :制成適宜的球形或無定形顆粒制成適宜的球形或無定形顆粒, ,化學鍵合或涂層法改性?；瘜W鍵合或涂層法改性

2、。第一節(jié)第一節(jié) 無機基質無機基質一一. .硅膠硅膠: :表面含豐富表面含豐富硅醇基或硅羥基硅醇基或硅羥基, , 可化學鍵合或改性可化學鍵合或改性; ; 表面存在大量物理吸附水表面存在大量物理吸附水, ,增加處理或修飾復雜性。增加處理或修飾復雜性。1.1.化學性質化學性質: :多孔二氧化硅多孔二氧化硅 化學性質穩(wěn)定化學性質穩(wěn)定,ph,ph適應范圍適應范圍1-91-9，安全，安全phph范圍為范圍為2-82-8。晶型二氧化硅晶型二氧化硅表面可能僅有自由硅羥基；表面可能僅有自由硅羥基；無定形硅膠無定形硅膠則有自由硅羥基、鄰位硅羥基、氫鍵則有自由硅羥基、鄰位硅羥基、氫鍵結合水或物理吸附水。結合水或物理

3、吸附水。sioh自由硅羥基雙硅羥基ohsi締合硅羥基ohsi表面金屬內部金屬（活化硅羥基）ohsiohsiohmmhplc硅膠擔體的表面硅膠擔體的表面 物理吸附水的去除物理吸附水的去除-是硅膠衍生反應中不可或缺的一步是硅膠衍生反應中不可或缺的一步。因為物理吸附水與硅羥基競爭硅烷化試因為物理吸附水與硅羥基競爭硅烷化試劑的反應劑的反應, ,可能引起鍵合率的降低和非可能引起鍵合率的降低和非特異性吸附的增加特異性吸附的增加, ,降低填料的性能。降低填料的性能。 一般通過一般通過加熱或真空下熱處理加熱或真空下熱處理去去除物理吸附水。除物理吸附水。2.2. 物理性質物理性質: : 顆粒的形狀大小、孔的結構

4、、孔徑及其顆粒的形狀大小、孔的結構、孔徑及其分布、總孔容、比表面積、高機械強度分布、總孔容、比表面積、高機械強度20468101214161820222426保留時間（min）1234123檢測器響應a型硅膠zorbax-ods二甲基-c18b型硅膠zorbax rx-c18二甲基-c181、多慮平 0.125ug2、去甲丙咪嗪 0.25ug3、阿米替林 0.25ug4、三甲丙咪嗪 0.25ug以以a a型與型與b b型硅膠擔體的色譜柱分離三環(huán)抗抑郁藥的比較型硅膠擔體的色譜柱分離三環(huán)抗抑郁藥的比較色譜柱：色譜柱：15150.46 cm0.46 cm；流動相：乙腈；流動相：乙腈-0.025m-0

5、.025m磷酸鈉緩沖液（磷酸鈉緩沖液（3030：7070），），p p h2.5+h2.5+三乙胺與三氟醋酸各三乙胺與三氟醋酸各0.2%0.2%；流速：；流速：1.0ml/min1.0ml/min；40400 0c c；254nm254nm檢測；進樣檢測；進樣5l5l。 a a型：純度不高的酸性硅膠型：純度不高的酸性硅膠b b型：高純度的弱酸性硅膠型：高純度的弱酸性硅膠3.3.多孔硅膠的制法多孔硅膠的制法: : 將水玻璃將水玻璃( (硅酸鈉水溶液硅酸鈉水溶液) )酸化酸化, ,形成形成siosio2 2膠體溶液膠體溶液, ,以各種方法聚集成球形粒子以各種方法聚集成球形粒子, ,并并轉化成干膠轉

6、化成干膠; ; 另外另外, ,也可利用正硅酸酯的縮聚和也可利用正硅酸酯的縮聚和siosio2 2氣氣溶膠水溶液噴霧干燥法。溶膠水溶液噴霧干燥法。粒度分布及雜質的控制是難點！粒度分布及雜質的控制是難點！堆砌硅珠法堆砌硅珠法 尿素、甲醛相分離聚合尿素、甲醛相分離聚合：將適宜濃度的硅溶：將適宜濃度的硅溶膠與一定比例的尿素和甲醛配成水溶液，攪拌均勻膠與一定比例的尿素和甲醛配成水溶液，攪拌均勻令其產生令其產生縮聚反應縮聚反應。待反應進行到一定程度后，便。待反應進行到一定程度后，便會產生會產生相分離相分離而從水溶液中而從水溶液中沉淀出沉淀出聚集硅微珠聚集硅微珠與與尿尿素甲醛樹脂素甲醛樹脂的的復合球復合球。

7、將這種復合球收集、洗滌。將這種復合球收集、洗滌并在高溫爐中并在高溫爐中煅燒煅燒，令樹脂分解，令樹脂分解逸去逸去，剩下的就是，剩下的就是多孔硅膠微球，其直徑可以控制在多孔硅膠微球，其直徑可以控制在4 45 5m m或或7 78 8m m之間。通過二次縮聚反應，直徑可加大到之間。通過二次縮聚反應，直徑可加大到1515m m。二二. .可控孔徑玻璃可控孔徑玻璃: : 含含硼的硼的nana2 2o-bo-b2 2o o3 3-sio-sio2 2系玻璃系玻璃, ,熱處理時會熱處理時會相分離，生成相分離，生成溶于酸的溶于酸的nana2 2o-bo-b2 2o o3 3相相及及不溶不溶于酸的于酸的高硅相高

8、硅相。以酸處理的方法，將酸可。以酸處理的方法，將酸可溶相浸析出來溶相浸析出來, ,剩下的高硅相就成了剩下的高硅相就成了可控?？煽夭ＡЯ?sio(sio2 2) )?？刂撇ＡУ慕M成及處理條件可?？刂撇ＡУ慕M成及處理條件可控制生成可控孔徑玻璃的孔徑、孔容及比控制生成可控孔徑玻璃的孔徑、孔容及比表面積。表面積。1.1.化學性質化學性質: : 表面具有游離硅羥基表面具有游離硅羥基, ,可以通過各種化學修可以通過各種化學修飾而得到不同官能團的表面飾而得到不同官能團的表面。 缺點缺點：游離硅羥基可能：游離硅羥基可能導致非特異性吸附導致非特異性吸附及蛋白質失活及蛋白質失活; ;適應的適應的phph范圍有一定

9、的局限范圍有一定的局限; ;制造成本較高。制造成本較高。2.2.物理特性物理特性: : 機械強度高機械強度高, ,可耐受劇烈、反復的處可耐受劇烈、反復的處理和操作，耐壓力強。理和操作，耐壓力強。 孔徑分布窄而均勻。孔徑分布窄而均勻。3.3.制造制造: : 采用普通玻璃制造工藝：采用普通玻璃制造工藝：精細選擇并精細選擇并控制適宜的相分離溫度與時間控制適宜的相分離溫度與時間?？住？讖揭话憧刂圃趶揭话憧刂圃?5nm25nm到到100nm100nm為宜。為宜。三、其它三、其它氧化鋁：氧化鋁：主要是主要是alal2 2o o3 3, ,作為色譜固定相，作為色譜固定相，主要用于主要用于小分子有機物等的分離

10、小分子有機物等的分離。限制其。限制其應用的因素在于其難以像應用的因素在于其難以像siosio2 2那樣通過鍵合那樣通過鍵合而得到適應不同分離模式的固定相。而得到適應不同分離模式的固定相。氧化鋯：氧化鋯：利用與硅膠鍵合相類似的方法，可利用與硅膠鍵合相類似的方法，可以對其進行表面修飾。以對其進行表面修飾。第二節(jié)第二節(jié) 硅膠的化學修飾與改性硅膠的化學修飾與改性一、一、表面硅羥基的化學修飾（主要途徑）表面硅羥基的化學修飾（主要途徑）：1 1、氯化反應：、氯化反應：可以將硅羥基轉化成硅氯基，可以將硅羥基轉化成硅氯基，硅氯基性質活潑可以與各種化合物反應而引硅氯基性質活潑可以與各種化合物反應而引入相應的基團

11、。這種方法引入的基團是入相應的基團。這種方法引入的基團是單分單分子層子層的，的，具有較好的傳質能力和色譜性能具有較好的傳質能力和色譜性能，但成本較高。但成本較高。2 2、氯硅烷與硅羥基的反應：、氯硅烷與硅羥基的反應： 通過氯硅烷可以通過氯硅烷可以將各種烷基鏈引入硅將各種烷基鏈引入硅膠表面膠表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯。氯硅烷包括一氯代型，二氯代型和三氯代型等。代型和三氯代型等。p231p2313 3、通過烷氧基硅烷與硅羥基的反應：、通過烷氧基硅烷與硅羥基的反應： 烷氧基硅烷與硅膠進行縮合反應，使烷氧基硅烷與硅膠進行縮合反應，使硅膠硅膠表面帶上環(huán)氧基或氨基等基團表面帶上環(huán)氧基或氨基等基團，在此

12、基礎，在此基礎上可以很方便地進一步進行反應或修飾。上可以很方便地進一步進行反應或修飾。這一鍵合反應可以在水相，也可以在有機這一鍵合反應可以在水相，也可以在有機介質中進行。介質中進行。si-ohcl-si(ch3)2rcl3sir(eto)3sira+csi-o-si(ch3)2rbsi-ohsi-ohsi-ohsi-ohsi-osi-osi-osi-o+siclrsi(oet)r（a a）表面硅羥基與氯二甲基硅烷的反應；）表面硅羥基與氯二甲基硅烷的反應；（b b）表面硅羥基與三官能團硅烷的反應；）表面硅羥基與三官能團硅烷的反應；（c c）表面硅羥基與三官能團烷基硅烷的反應）表面硅羥基與三官能團

13、烷基硅烷的反應a、縱向交聯(lián)b、橫向交聯(lián)c、單體（二甲基-取代）d、單體（空間保護）sioohsisisisisioohosiosiohsiohosisiohoohohsiosisisisisioosioooooooooosisisisisisisisiosisisisisiohoosiohsisiohsisisisiohosisisiosioh與硅膠擔體共價鍵合硅烷的各種類型與硅膠擔體共價鍵合硅烷的各種類型二、包敷與涂層：二、包敷與涂層：1.1. 可通過不同的途徑制備穩(wěn)定的聚合物涂層可通過不同的途徑制備穩(wěn)定的聚合物涂層。常常將選擇的聚合物、寡聚物或單體以適宜溶劑將選擇的聚合物、寡聚物或單體以適

14、宜溶劑制成溶液，均勻分布于無機基質的全部表面上，制成溶液，均勻分布于無機基質的全部表面上，蒸去溶劑后，令高聚物或單體聚合，形成致密蒸去溶劑后，令高聚物或單體聚合，形成致密的聚合物涂層。的聚合物涂層。2.2. 亦可亦可將將含雙鍵的聚合物含雙鍵的聚合物涂于硅膠表面，使其表涂于硅膠表面，使其表面帶上雙鍵，使其于面帶上雙鍵，使其于隨后涂敷上去的第二單體隨后涂敷上去的第二單體進行共聚。進行共聚。還可以還可以將含有雙鍵的不飽和聚合物將含有雙鍵的不飽和聚合物涂于硅膠表面，以涂于硅膠表面，以自由基引發(fā)進一步交聯(lián)自由基引發(fā)進一步交聯(lián)，以，以獲得理化性質更穩(wěn)定的涂層。獲得理化性質更穩(wěn)定的涂層。三、整體修飾：三、整

15、體修飾： 指利用具有不同官能團的指利用具有不同官能團的鹵代硅烷鹵代硅烷或或烷氧基硅烷烷氧基硅烷的的水解、縮聚反應水解、縮聚反應，直接，直接制出空間交聯(lián)型、含不同制出空間交聯(lián)型、含不同r r基的硅膠?；墓枘z。四、硅烷化試劑：四、硅烷化試劑： 氯硅烷：氯硅烷：容易和空氣中微量水反應，容易和空氣中微量水反應，放出放出hclhcl氣，對環(huán)境造成危害。氣，對環(huán)境造成危害。 烷氧基硅烷：烷氧基硅烷：對環(huán)境和人體的危害性對環(huán)境和人體的危害性小。廣泛應用。小。廣泛應用。各類無機色譜填料各類無機色譜填料 正相色譜填料正相色譜填料 反相色譜填料反相色譜填料 凝膠過濾色譜填料凝膠過濾色譜填料 高效離子交換色譜填料

16、高效離子交換色譜填料 高效親和色譜填料高效親和色譜填料 高效疏水色譜填料高效疏水色譜填料第三節(jié)第三節(jié) 正相色譜填料正相色譜填料 液相色譜分正相和反相色譜液相色譜分正相和反相色譜（依據(jù)相間的相對極性依據(jù)相間的相對極性） 正相正相：固定相極性大于流動相極性，：固定相極性大于流動相極性， 適用于非極性至中等極性的中小分子化合物適用于非極性至中等極性的中小分子化合物的分離，如脂溶性維生素、甾體激素、醫(yī)藥等的分離，如脂溶性維生素、甾體激素、醫(yī)藥等的分離分析。的分離分析。 反相反相：固定相極性小于流動相極性。：固定相極性小于流動相極性。 正相色譜正相色譜液固吸附色譜液固吸附色譜柱填料：吸附劑，表面分布有活

17、性吸附位點；柱填料：吸附劑，表面分布有活性吸附位點；競爭吸附：溶劑溶質分子，溶質溶質分子競爭吸附：溶劑溶質分子，溶質溶質分子 柱內保留時間差異柱內保留時間差異 物質分離！物質分離！1.1.硅膠硅膠 吸附色譜中吸附色譜中最常用最常用。但樣品呈堿性時，。但樣品呈堿性時，會造成嚴重吸附，溶質峰拖尾或難以洗會造成嚴重吸附，溶質峰拖尾或難以洗脫，脫，可選用可選用alal2 2o o3 3。 al al2 2o o3 3對于不飽和化合物，特別是芳香族對于不飽和化合物，特別是芳香族化合物多核芳烴的保留能力較強，芳香化合物多核芳烴的保留能力較強，芳香異構體可得到良好分離。異構體可得到良好分離。 硅膠硅膠 10

18、0-200100-200目目 2.5kg 2.5kg 生產商生產商:fisher :fisher 產品價格產品價格:4500:4500元（元（rmbrmb）化學鍵合固定相：化學鍵合固定相：將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到將各種不同有機基團通過化學反應鍵合到載體表面的一種方法載體表面的一種方法。它代替了固定液的。它代替了固定液的機械涂漬，它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個機械涂漬，它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應用最廣泛的一種固重大突破。它是目前應用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/43/4以上的分離問題是以上的分離問題是在在化學鍵合固定相化學鍵合固定相上進行的。上

19、進行的。 2.2.極性鍵合相填料極性鍵合相填料 鍵合固定相類型：鍵合固定相類型： 用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用用來制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠硅膠。利用硅膠表面的利用硅膠表面的硅醇基硅醇基(si(si一一oh)oh)與與有機分子有機分子可成可成鍵鍵, ,即可得到各種性能的固定相。一般分即可得到各種性能的固定相。一般分3 3類：類：（1 1）疏水基團疏水基團 如不同鏈長的烷烴（如不同鏈長的烷烴（c8c8和和c18c18）和苯基。）和苯基。（2 2）極性基團極性基團 如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。如氨丙基、氰乙基、醚和醇等。（3 3）離子交換基團離子交換基團 如作為陰離子交換基團的胺基、

20、如作為陰離子交換基團的胺基、季鍍鹽；作為陽離子交換季鍍鹽；作為陽離子交換 基團的磺酸等?；鶊F的磺酸等。鍵合固定相成鍵類型鍵合固定相成鍵類型 a. a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： si siooc c b. b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：si sioosi si c c 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣；穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣； c. c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： si sic c d. d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： si sinn鍵合固定相的制備鍵合固定相的制備（l l）硅酸酯（）硅酸酯（si si一一oror）鍵合固定相）鍵合固定相, , 最最先用于液相色譜。先用于液相

21、色譜。用醇與硅醇基發(fā)生酯用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應化反應： si si0h0hrohsirohsiororh h2 20 0 這類鍵合固定相的有機表面是一些單體這類鍵合固定相的有機表面是一些單體，具有良好的傳質特性，具有良好的傳質特性, ,但這些酯化過的但這些酯化過的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅僅適用于不含水或醇的流動相適用于不含水或醇的流動相。 共價鍵鍵合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定共價鍵鍵合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點是格氏反應不方便；較硅酸酯好。缺點是格氏反應不方便；當使當使用水溶液時，必須限制用水溶液時，必須限制phph在在4 48 8范

22、圍內范圍內。ohsiso cl2clsi+hgbrsisinhch2chnh2h2nch2ch2nh2（2 2）si sic c或或si si一一nn共價鍵合固定相制備反應如下：共價鍵合固定相制備反應如下： （3）硅烷化（硅烷化（si sioosi sic c）鍵合固定相）鍵合固定相制備反應如下：制備反應如下： ohsiclsir3+sio(rosir3)sir3+ hcl這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸這類鍵合固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機溶劑的優(yōu)點。水，耐有機溶劑的優(yōu)點。能在能在7070以下，以下，ph=2ph=28 8范圍內正常工作，應用較廣泛范圍內正常工作，應用較廣泛。第四節(jié)第

23、四節(jié) 反相填料及色譜柱反相填料及色譜柱 非極性固定相，極性流動相非極性固定相，極性流動相 在色譜的應用中，反相模式占在色譜的應用中，反相模式占5757。反相色譜填料的種類與性質反相色譜填料的種類與性質 品種繁多，性質各異。品種繁多，性質各異。 市場主流：市場主流：無機材料無機材料為基質制備的填料為基質制備的填料 在硅膠基質的填料中，以在硅膠基質的填料中，以鍵合有鍵合有c c1818、c c8 8、c c4 4及及c c3 3的球形、全多孔填料的球形、全多孔填料最常見。最常見。 參見參見p p239239：表：表11116 6；p p242242244244：表：表11117 7。第五節(jié)第八節(jié)第五節(jié)第八節(jié) 其它色譜類型填料其它色譜類型填料自學！自學！請注意掌握幾個要點：請注意掌握幾個要點： 色譜的分離原理色譜的分離原理 色譜填料的種類與性能色譜填料的種類與性能 色譜填料的制備色譜填料的制備 常見的色譜填料常見的色譜填料第九節(jié)第九節(jié) 生化分離用色譜填料的新進展生化分離用色譜填料的新進展未來液相色譜的特點：兩極分化式發(fā)展未來液相色譜的特點：兩極分化式發(fā)展 適應制備色譜需要：高效、高選擇性、高速、低成本適應制備色譜需要：高效、高選擇性、高速、低成本液相色譜