熒光定量PCR基礎(chǔ)原理PPT參考幻燈片

1、1PCR擴增的理論模式Real time PCR理論基礎(chǔ)2 PCR是將樣本中微量的DNA模版放大來研究模版特性。隨著研究的深入，要了解樣本中基因的表達模式與疾病的關(guān)系，就需要了解標本中的DNA原始拷貝數(shù)。3 由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進入平臺期的時間和平臺期的高低都有很大變化，即使是重復(fù)實驗，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也往往不同。因此經(jīng)過PCR擴增的DNA產(chǎn)物量不能反映起始模板量的真實情況。通過凝膠電泳EB染色或者同位素標記只能定量PCR的終產(chǎn)物量，而不能定量起始DNA模版的拷貝數(shù)。4 實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入

2、熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高，特異性和可靠性強，重復(fù)性好，自動化程度高、無污染性等突出優(yōu)勢，因此被公認為當今世界用于臨床的最先進核酸分子診斷技術(shù)。5 PCR擴增的理論模式 PCR中，隨著擴增周期的增加，模板以指數(shù)方式進行擴增。PCR 理論方程：N = N0 (1+E)nN: 擴增子數(shù)量N0: 起始模板數(shù)量E：擴增效率n: 循環(huán)數(shù)此公式僅在指數(shù)擴增期（20-30個循環(huán)）內(nèi)成立。6 PCR分期“S”形曲線對 PCR 擴增過程的詳細分析表明，PCR 擴增曲線可被分為

3、三個典型時期：早期背景擴增期、中期指數(shù)擴增期（或?qū)?shù)線形擴增期），以及晚期的平臺期7 理論上PCR過程中反應(yīng)產(chǎn)物是以指數(shù)規(guī)模增長的，但實際的PCR擴增曲線并不是標準的指數(shù)曲線，而是S形曲線；因為隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率降低，產(chǎn)物生成的速度逐漸減緩，最終進入平臺期。8 兩種定量方法9 10 兩種定量方法終點定量終點定量起點定量起點定量無規(guī)律對數(shù)期分析：平行性好終點產(chǎn)物數(shù)量：誤差大拐點產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好，誤差小影響因素多擴增效率恒定，標準曲線呈線性起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小擴增效率恒定，

4、標準曲線呈線性11 普通PCR技術(shù)的檢測模式普通PCR儀器擴增，約2.5小時瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳，約約1小時小時EB染色染色，約，約20分鐘分鐘紫外成像紫外成像陰性陰性陽性陽性樣品檢測結(jié)果樣品檢測結(jié)果無法定量無法定量12 實時熒光定量PCR的檢測模式熒光定量PCR儀器擴增，約2小時檢測過程有實時監(jiān)測檢測過程有實時監(jiān)測數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)光滑的光滑的S型指數(shù)曲線型指數(shù)曲線，陽性陽性無無S型指數(shù)曲型指數(shù)曲線，陰性線，陰性13 實時熒光定量PCR的檢測模式需絕對定量時四個已知濃度的標準品，得四個已知濃度的標準品，得到標準曲線到標準曲線系統(tǒng)即可自動計算出未知樣品的濃度系統(tǒng)即可自動計算出未知樣品的濃度14

5、陰性結(jié)果曲線圖示15陽性結(jié)果曲線圖示16實時熒光定量PCR基本原理在常規(guī)PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，加入熒光染料或熒光標記的探針，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR產(chǎn)物不段累積，熒光信號強度等比增強。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，從而對起始模板定量及定性的分析。17 熒光擴增曲線分三階段熒光背景信號，熒光信號指數(shù)擴增階段，平臺期熒光背景信號階段：該時期擴增的熒光信號被背景信號所掩蓋，擴增產(chǎn)物量無法判斷。平臺期：擴增產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量無線性關(guān)系，無法計算起

6、始DNA拷貝數(shù)。熒光信號指數(shù)擴增階段：該時期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系，因此選擇這一階段進行定量分析。引入兩個概念：熒光閾值和Ct值。18 實時定量PCR的兩個重要概念（1）熒光域值（熒光域值（ thresholdthreshold）：）：熒光擴增曲線上人為設(shè)定一個值，以PCR反應(yīng)的前15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域值定義為3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10 倍。閾值 = 基線信號的標準偏差 x 1019 實時定量PCR的兩個重要概念(2)CtCt值值：也稱循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold。指在PCR循環(huán)過程中熒光信號開始由本底進入

7、指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。在實際操作中，Ct值也就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值的循環(huán)次數(shù),可見Ct值取決于閾值。 20 基線 閾值 Ct值21 Ct值DNA起始濃度Ct值與模板DNA的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，達到熒光閾值的Ct值越小。Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs總信號=本底信號+分子數(shù)量單位信號強度Rn ：第n個循環(huán)時的總信號RB ：本底RS ：單位信號強度X0 ：起始DNA數(shù)目E：PCR效率22 Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs 當循環(huán)次數(shù)n=CT值時： RT = RB + X0 (1+ E)CTRs lg (RT-R

8、B) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg Rs CTlg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT -RB) lg Rs即 CT= - k lg X0 + b （線性方程）23 定量方法利用已知起始拷貝數(shù)的標準品做出標準曲線，縱坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標代表Ct值。所以，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。24 Real time PCR 化學原理雙鏈DNA結(jié)合染料染色-非特異性檢測 SYBR Green I 溴乙錠(Ethidium Bromide)探針標記-特異性檢測 TaqManTM TaqMan MGB Dual-ol

9、igo FRET pairs 分子信標(Molecular beacons) ScorpionsTM/AmplifluorTM25 SYBR Green I熒光染料的作用原理 SYBR Green I是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結(jié)合。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；變性時，DNA雙鏈分開時，熒光信號急劇減弱。在延伸結(jié)束階段，采集熒光信號。因此，在一個體系內(nèi)，信號強度與DNA雙鏈總數(shù)目成正比其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。26 退火：產(chǎn)生熒光信號退火：產(chǎn)生熒光信號結(jié)合結(jié)合SYBR Green I27 SYBR Green I 染料僅在與雙

10、鏈 DNA（dsDNA）結(jié)合時發(fā)射熒光，所發(fā)射的光波是藍色光。SYBR Green I 不會與單鏈 DNA 結(jié)合，因此變性時熒光強度最低。dsDNA形成單鏈（圖 A）合成雙鏈（圖 B）時，SYBR Green I 結(jié)合于dsDNA上，結(jié)合的 SYBR Green I（綠色光）的熒光信號強度增強。延伸末期（圖 C）時，所有 DNA 均是雙鏈，結(jié)合狀態(tài)的SYBR Green I 含量達最大，該 PCR 周期中熒光信號也達最大。因此，通常是在延伸期結(jié)束時進行 SYBR Green I 熒光信號測定。28 染料法優(yōu)缺點優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點成本低只能檢測單一模板，無法多重檢測通用性好無模板特異性，非特異性擴

11、張和引物二聚體也產(chǎn)生熒光適合初步篩查敏感度低，不能準確測序低拷貝模板融解曲線功能，分析非特異性擴增熒光本底高，易引起假陽性29 30 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，實際相當于短波長熒光基團釋放的熒光被屏蔽。Hybprobe探針和水解探針均基于 FRET （熒光共振能量傳遞）的原理設(shè)計的。31 TaqMan探針法-水解探針PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)

12、合位點在兩條引物之間。TaqMan探針為一寡核苷酸，包含兩個分子標記，探針的5端標記有熒光報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)，如TAMRA等。32 探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被近距離的淬滅基團吸收；隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針， 其53外切酶活性外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，游離于反應(yīng)體系中，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。33 34 TaqMan探針的數(shù)量關(guān)系每擴增一條DNA鏈，就切斷一條探針；每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位熒光信號，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步；信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比，報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。因此該技術(shù)可對模板進行準確定量。由于擴增產(chǎn)物較短時效率較高，故擴增長度一般為50150bp。35 TaqMan探針的優(yōu)點特異性高多重基因定量熒光強度正比于產(chǎn)物不可逆反應(yīng) 信號生成后不會自動淬滅36 Real time PCR優(yōu)點對整個PCR實時監(jiān)控，明確了指數(shù)擴增期，進而可對起始模板進行定量，且定量范圍廣；測定敏感性高，比電泳方法的靈敏度高2-3個數(shù)量級；測定準確度和重復(fù)性好，Ct值和模板起始濃度有函數(shù)關(guān)系；大大降低實驗室“污染”的