大鼠肢體缺血再灌注時早期血栓前狀態(tài)的研究

1、大鼠肢體缺血再灌注早期血栓前狀態(tài)的研究作者：楊敏，馬平，徐文會，張宏江 作者單位：(山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，山西 太原 030001) 【摘要】 目的 探討大鼠急性下肢缺血再灌注早期血栓的形成情況。方法 將大鼠隨機分為假手術(shù)組、下肢缺血再灌注組兩組。夾閉大鼠股動脈并用張力帶綁扎下肢，建立急性下肢缺血再灌注大鼠模型。觀察急性下肢缺血再灌注大鼠血小板膜糖蛋白gpb/a和血管內(nèi)皮細(xì)胞血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomoclulin，tm)的表達(dá)。結(jié)果 缺血再灌注組大鼠血小板膜糖蛋白gpb/a表達(dá)高于假手術(shù)組(p0.05)；缺血再灌注組大鼠血管內(nèi)皮tm表達(dá)低于假手術(shù)組(p0.05)。結(jié)論 急性下肢

2、缺血再灌注可能導(dǎo)致大鼠血栓前狀態(tài)的形成。 【關(guān)鍵詞】 肢體缺血再灌注；血栓前狀態(tài)；血小板膜糖蛋白；血栓調(diào)節(jié)蛋白 prethrombotic state in rats after ischemiareperfusion of limb and its intervention study yang min，ma ping，xu wenhui，et al (department of anesthesia，the 2nd hospital of shanxi medical university，taiyuan 030001，china) abstract：objective to invest

3、igate the emerge condition of thromb in rats after ischemiareperfusion of limb.methods the rats were randomly divided into 2 groups：sham operation group(n group)；the hind limb ischemia reperfusion group (ir group).an animal model of acute hind limb ischemiareperfusion was developed by clamping femor

4、al artery and banding hind limb of rats.changes in the expression of gpb/a of platelet membrane and tm of vascular endothelial cell in rats after ischemiareperfusion of limb were observed.results the expression of gpb/a of platelet membrane in the ir group was significantly higher than that of the n

5、 group (p0.05).the expression of tm of vascular endothelial cell in the ir group was significantly lower than that of the n group (p0.05).conclusion acute hind limb ischemiareperfusion may induce the formation of prethrombotic state in rats. key words：limb ischemiareperfusion；prethrombotic state；pla

6、telet membrane lycoprotein；thrombomodulin 缺血再灌注損傷是臨床肢體血運重建后出現(xiàn)意外致殘、致死的主要原因之一，是當(dāng)今外科臨床醫(yī)生所常面對的具有挑戰(zhàn)性的問題之一。創(chuàng)傷、斷肢再植、術(shù)中使用止血帶時間過長、腹主動脈瘤手術(shù)中鉗夾血管及大血管栓塞再通等都可引起肢體缺血再灌注損傷。肢體缺血再灌注損傷是處于頓抑、休眠的肢體在血運重建之后的損傷導(dǎo)致的機體生理、生化改變和各器官的病理改變，這種損傷幾乎影響到整個機體，進(jìn)一步導(dǎo)致如心、肺、腎等遠(yuǎn)隔器官的損傷13，甚至發(fā)生多器官功能障礙4。盡管近來手術(shù)技術(shù)得以改善且圍手術(shù)期管理水平有所提高，但死亡率和截肢率仍居高不下。如何認(rèn)

7、識再灌注損傷的預(yù)防和治療，降低致殘率和死亡率，將是我們長期所要研究的課題。 缺血再灌注損傷的機制是多因素和錯綜復(fù)雜的，其中微血栓的形成可能起到重要作用。研究證實再灌注時血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞激活，內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種黏附分子，激活的內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞相互作用，對微血管和細(xì)胞損傷產(chǎn)生影響。150多年前，virchow就指出血管壁的損傷、血液流動的變化、血液性質(zhì)的改變是形成血栓的三要素，而血栓前狀態(tài)是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系統(tǒng)失調(diào)的一種病理過程，具有易導(dǎo)致血栓形成的多種血液學(xué)變化，是血栓形成的前期階段。本試驗通過黏附分子血小板膜糖蛋白gpb/a和血管內(nèi)皮細(xì)胞血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomoclul

8、in，tm)的測定，從血管內(nèi)皮損傷、血小板活化、抗凝作用減弱三個方面對肢體缺血再灌注后血栓前狀態(tài)進(jìn)行研究。 1 材料和方法 1.1 實驗材料 1.1.1 實驗動物 健康成年雄性sd大鼠，體重(20030)g，購于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。 1.1.2 主要試劑及儀器 山羊抗大鼠gpb/a抗體，santa cruz公司；抗大鼠tm抗體，lab vision公司；fitc標(biāo)記兔抗山羊igg，北京中山金橋公司；sabc免疫組化試劑盒，北京中山金橋公司；olympus bx51光學(xué)顯微鏡，日本；leicarm2015切片機，德國萊卡公司；ida2000數(shù)碼顯微圖象分析系統(tǒng)，中科院北京空?？萍脊?；ca

9、libur流式細(xì)胞儀，美國bd公司。 1.2 實驗方法 1.2.1 實驗分組 分為假手術(shù)組、缺血再灌注組兩組，采用隨機化原則，每組8只。 1.2.2 動物模型制作 術(shù)前常規(guī)禁食12 h，自由飲水。以20烏拉坦(1 000 mg/kg)行腹腔內(nèi)注射麻醉。將大鼠仰臥固定于操作臺上，在后肢雙側(cè)股三角處剪毛，于腹股溝處沿血管走行縱行切開皮膚、皮下組織，鈍性分離縫匠肌后部，游離股動脈、股靜脈和股神經(jīng)。在股動、靜脈近端分別用動、靜脈夾夾閉，并用張力帶于股鞘下綁扎肢體阻斷側(cè)支循環(huán)。右頸部開口分離頸內(nèi)靜脈，置管建立靜脈輸液系統(tǒng)，接微電腦靜脈微量輸液泵。2 h后撤除血管夾，恢復(fù)動、靜脈血流，3 h后進(jìn)行標(biāo)本采集

10、。 1.2.3 實驗動物的處理 假手術(shù)組與缺血再灌組相同的麻醉與手術(shù)操作，但未行血管夾閉及張力帶綁扎；缺血再灌注組缺血2 h，再灌注3 h。 1.2.4 標(biāo)本制備和檢測方法 檢測gpb/a需取血，從心臟采血0.5 ml(3.8枸櫞酸鈉19抗凝)，1 000 r/min離心5 min，取上清5 ul加入試管中；加入一抗5 ul，避光孵育20 min；加入熒光標(biāo)記二抗5 ul，避光孵育20 min；加1多聚甲醛200 ul固定30 min；pbs洗滌4 min，用流式細(xì)胞儀檢測，每管收集gpb/a陽性細(xì)胞20 000個，記錄gpb/a的陽性率。 檢測tm需取血管，取股動脈、股靜脈，脫水、石蠟包埋，

11、用免疫組化方法定性檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞上tm的表達(dá)。步驟如下：a)切片常規(guī)脫蠟至水，二甲苯(20 min)二甲苯(20 min)100酒精(10 min)100酒精(10 min)95酒精(10 min)85酒精(10 min)70酒精(10 min)。b)3h2o2室溫孵育510 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的作用。蒸餾水沖洗2 min，沖洗3次。c)熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.001m枸櫞酸緩沖液(ph 6.0)，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔8 min后，重復(fù)1次，冷卻2 h，冷卻后pbs液(ph 7.4)洗滌2 min，沖洗2次。d)滴加5bsa封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。

12、e)滴加稀釋150的一抗(抗大鼠igg)，4過夜。pbs液沖洗2 min，沖洗3次。f)滴加生物素標(biāo)記的羊抗小鼠igg，室溫20 min，pbs液沖洗2 min，沖洗3次。g)滴加試劑sabc室溫20 min。pbs液沖洗5 min，沖洗4次。h)dab顯色，自來水沖洗。i)蘇木素輕度復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。再用bx51型olympus顯微鏡及ida2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每組觀察30個高倍視野(400)，隨機取8個視野，以平均光度為指標(biāo)進(jìn)行半定量分析。 1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用spss 11.5統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以(s)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗。檢驗

13、水準(zhǔn)取0.05，p0.05差異有顯著性。 2 結(jié) 果 2.1 缺血再灌注組大鼠血小板膜糖蛋白gpb/a表達(dá)為(53.843.05)，高于假手術(shù)組(42.316.29)，二者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2 缺血再灌注組大鼠血管內(nèi)皮tm表達(dá)低于假手術(shù)組(p0.05)(見表1)表1 急性肢體缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞tm的表達(dá)注：假手術(shù)組與缺血再灌組比較p0.05 3 討 論 早在1944年，jesse等5對止血帶引發(fā)休克研究發(fā)現(xiàn)，止血帶使用時間不超過3 h，引發(fā)止血帶休克可能性極小，相反止血帶使用時間超過3 h，則較易導(dǎo)致止血帶休克，這種止血帶休克不能通過靜脈補充容量來預(yù)防。后來人們對動物骨骼肌缺血

14、代謝變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺血開始，骨骼肌的無氧代謝開始，細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷、磷酸肌酸進(jìn)行性耗竭，缺血3 h三磷酸腺苷就完全水解，而在缺血后1 h磷酸肌酸就完全水解。在28下，如果止血帶時間不超過3 h，隨著再灌注開始，細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷在再灌注2 h后恢復(fù)正常水平，而磷酸肌酸則在再灌注后1 h恢復(fù)到正常水平。如果缺血超過3 h，而缺血的肢體溫度保持在2，也不會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷、磷酸肌酸的耗竭，從而避免了細(xì)胞損傷。這可能與低溫下細(xì)胞能量代謝降低有關(guān)6。raymond等7用無創(chuàng)性p標(biāo)記核磁共振分光鏡觀察細(xì)胞缺血再灌注時代謝改變得出，在肢體長時間的缺血中，如果每缺血1 h插入10 min再灌注，

15、則可維持細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷正常水平，快速恢復(fù)細(xì)胞代謝，保護(hù)細(xì)胞不受傷害；而miller8等則認(rèn)為插入5 min就可以恢復(fù)細(xì)胞正常代謝。臨床手術(shù)中，使用止血帶的最大時限為1.5 h，因此本實驗選擇室溫下缺血2 h再灌注3 h造模以更加接近于臨床研究。 近年來研究表明，肢體缺血再灌注可致微血管和細(xì)胞損傷。a)微血管血液流變學(xué)改變：缺血再灌注早期可見中性粒細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，隨后可有血小板沉積和紅細(xì)胞緡線狀聚集；再灌注期，激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表面可表達(dá)黏附分子，增強細(xì)胞間的親和力，使細(xì)胞在微血管內(nèi)流速減慢，造成“滾動”現(xiàn)象；隨著再灌注時間延長，中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)

16、進(jìn)一步增加，中性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附。黏附的中性粒細(xì)胞釋放化學(xué)趨化物質(zhì)，如白三烯、血栓素a2和血小板激活因子等，加重細(xì)胞間黏附和微血管堵塞。b)微血管口徑的變化：損傷的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放縮血管物質(zhì)、擴(kuò)血管物質(zhì)合成與釋放減少等作用共同導(dǎo)致微血管口徑變小。c)微血管通透性增高：自由基損傷和中性粒細(xì)胞黏附是微血管通透性增高的的主要原因。 150多年前，virchow就指出血管壁的損傷、血液流動的變化、血液性質(zhì)的改變是形成血栓的三要素，而血栓前狀態(tài)是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系統(tǒng)失調(diào)的一種病理過程，具有易導(dǎo)致血栓形成的多種血液學(xué)變化，是血栓形成的前期階段9。表現(xiàn)在：

17、a)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損或受刺激；b)血小板和白細(xì)胞被激活或功能亢進(jìn)；c)凝血蛋白(凝血因子)含量增高或被活化；d)抗凝蛋白(抗凝因子)含量減少或結(jié)構(gòu)異常；e)纖溶因子含量減少或活性減弱；f)血液黏度增高和血流減慢10。 目前肢體缺血再灌注動物模型很難造成與臨床情況完全相同，因此都有一定的局限性。主要的造模方法有11：a)止血帶模型：是將橡皮止血帶或氣囊止血帶扎于肢體近端阻斷血流，造模操作簡單。b)改良止血帶模型：在麻醉下游離出肢體動、靜脈，用血管夾阻斷動、靜脈，并用橡皮止血帶環(huán)扎肢體以阻斷側(cè)支循環(huán)，此方法造模復(fù)雜，易出現(xiàn)傷口感染。c)將肢體某塊肌肉分離出，保留或不保留血管束或血管神經(jīng)束與活體相連

18、。因分離肌肉時已將組織切開且一塊肌肉很難代表整個肢體，目前此模型較少應(yīng)用。d)顯露某條肌腱而不破壞表面微血管，觀察缺血再灌注后的微循環(huán)變化。本研究采用改良止血帶模型。臨床手術(shù)中，使用止血帶的最大時限為1.5 h，因此本實驗選擇缺血2 h再灌注3 h造模足以反映缺血及再灌注對機體造成的影響。 血小板參與血栓形成主要與血小板具有的功能有關(guān)，包括黏附、聚集、釋放、促凝血功能。在血栓性疾病中，血小板活化與血栓形成存在密切關(guān)系。血小板膜糖蛋白gpb/a(cd41/cd61)歸屬于黏附分子中的整合素家族，70存在于血小板表面，30以隱蔽狀態(tài)分布在開放管道系統(tǒng)和顆粒上。當(dāng)血小板活化時，隱蔽狀態(tài)的gpb/a復(fù)

19、合物全部表達(dá)在血小板膜表面。血小板通過與纖維蛋白原的聯(lián)結(jié)而產(chǎn)生聚集，而血小板聯(lián)結(jié)纖維蛋白原的結(jié)合點位于gpb/a分子上，是通過精氨酸天冬氨酸天冬酰胺序列與纖維連接蛋白及vwf等結(jié)合的。gpb/a與纖維蛋白原的結(jié)合過程是多種因素引起血小板聚集的共同通路，故gpb/a可以更直接地反映血小板的活化狀態(tài)12。有研究表明血小板活化時可能形成一個黏附蛋白口袋，產(chǎn)生多個結(jié)合點，這種現(xiàn)象反映了gpb/a復(fù)合物在血小板活化時出現(xiàn)了許多離散的構(gòu)型狀態(tài)。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測gpb/a的分子數(shù)，可直接反映血小板活化狀態(tài)。 參與血小板黏附反應(yīng)的因素包括血小板、內(nèi)皮下組織和血漿成分。血小板黏附受體主要歸gpb，此外，

20、還有其他的黏附蛋白參與，比如gpb/a。在非流動條件下，gpb/a可以與fn、vwf、fg、tsp或膠原聯(lián)結(jié)，但在流動條件下，gpb/a只與vwf結(jié)合，并使黏附的血小板在表面伸展，使血小板牢固地黏著在表面上，經(jīng)得住高切變率時血流的沖刷而不脫落。 肢體缺血再灌注損傷與血小板的功能狀態(tài)有重要關(guān)系。本研究觀察到缺血再灌注組gpb/a表達(dá)量較假手術(shù)組表達(dá)量增加，表明肢體缺血再灌注后血小板有一定程度的活化，其機制可能是在肢體缺血再灌注后，微血管有一定程度的損傷，如內(nèi)皮細(xì)胞受損、血液流變學(xué)改變(血液為非牛頓液體，其黏度隨切變率的變化而發(fā)生了變化，在低切應(yīng)力情況下，血液黏度升高血流阻力增大，導(dǎo)致流速減慢)。

21、內(nèi)皮下膠原暴露，在低切變率情況下gpb通過vwf介導(dǎo)與膠原結(jié)合，膠原作為弱激活劑與其他激活劑(如adp、腎上腺素等)使黏附的血小板激活，同時引起釋放反應(yīng)，進(jìn)一步激活血小板。在此過程中txa2被激活，txa2作為強激活劑通過以plc途徑為主的不同途徑激活血小板，活化的血小板膜表面表達(dá)更多的gpb/a復(fù)合物，兩個相鄰血小板的gpb/a可能會通過與纖維蛋白原的結(jié)合，產(chǎn)生“搭橋”作用，使血小板發(fā)生聚集。纖維蛋白原是目前已知最重要的gpb/a的配基，其上有兩個gpb/a結(jié)合位點，可同時與兩個活化血小板結(jié)合，從而導(dǎo)致血小板交聯(lián)，介導(dǎo)血小板聚集。 這與劉育英等13應(yīng)用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)沙土鼠在腦缺血再灌注后1

22、.6 h血小板膜糖蛋白cd61表達(dá)水平顯著升高一致。但與趙立明等14研究結(jié)果有差別，有待進(jìn)一步研究。 tm是由575個氨基酸組成的單鏈糖蛋白，由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板等合成釋放，廣泛分布于人體內(nèi)的動脈、靜脈、毛細(xì)血管和淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞膜表面，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，tm便從細(xì)胞中釋放入血，內(nèi)皮細(xì)胞表面tm減少，因此，近年來已把tm作為血管內(nèi)皮損傷和破壞的一個新的標(biāo)志物15，16。在功能上它是凝血酶激活蛋白c的輔因子，tm通過第5、6個上皮生長因子和硫酸軟骨素鏈與凝血酶以11或12形成復(fù)合物，使凝血酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，抑制凝血酶活性17，使其失去促纖維蛋白凝塊形成及血小板聚集能力；在ca離子參

23、與下，促進(jìn)凝血酶活化蛋白c的效率提高20 000倍以上，其作為tm/pc/ps抗凝系統(tǒng)的效應(yīng)分子，通過降解凝血因子va和a，抑制內(nèi)、外源性凝血反應(yīng)，產(chǎn)生抗凝作用；tm還可促進(jìn)抗凝血酶滅活凝血酶。tm由內(nèi)皮細(xì)胞釋放入血后，游離的凝血酶增多，tm的抗凝作用減弱，造成了促凝血作用，有利于血栓的形成。 本研究觀察到缺血再灌注組tm表達(dá)量較假手術(shù)組表達(dá)量下降，tm作為血管內(nèi)皮損傷和破壞的一個標(biāo)志物，其在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)量的下降可能表明肢體缺血再灌注后血管內(nèi)皮細(xì)胞受損傷，tm從細(xì)胞中釋放入血；其次，tm通過與凝血酶形成復(fù)合物，使凝血酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，抑制凝血酶活性，肢體缺血再灌注后，血管內(nèi)皮細(xì)胞上tm的量

24、減少，凝血酶活性增強，促進(jìn)凝血；再次，凝血酶與血管內(nèi)皮細(xì)胞的tm形成的復(fù)合物激活凝血活化蛋白c的抗凝作用也因此減弱。且凝血酶又可引起白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促炎介質(zhì)(如tnfa、il6、il8等)和黏附分子(如cd11b、cd18、vcam1等)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，使損傷進(jìn)一步加重。晉升網(wǎng)簡介晉升網(wǎng)（）致力于成為醫(yī)務(wù)工作者晉升職稱心靈導(dǎo)師；是目前國內(nèi)收錄醫(yī)學(xué)期刊、醫(yī)學(xué)雜志最多最權(quán)威的醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)平臺；提供免費醫(yī)學(xué)期刊在線閱讀；網(wǎng)羅和甄選海量優(yōu)秀醫(yī)學(xué)論文檢索，獨立研發(fā)醫(yī)學(xué)在線資源分享庫和醫(yī)學(xué)在線模擬考試庫；整合刊類、標(biāo)題、關(guān)鍵詞檢索及全文檢索，并獨家研發(fā)刊社管理和刊社加盟系統(tǒng)、在線投稿、在線查稿、在

25、線閱讀、遠(yuǎn)程審稿、在線下載等系統(tǒng)；聚刊社力量，建服務(wù)平臺，讓晉升網(wǎng)通過“專業(yè)”走入每一個醫(yī)務(wù)人員的身邊是我們不懈的追求目標(biāo)；晉升網(wǎng)()標(biāo)準(zhǔn) 最便捷的晉升通道 最高效的學(xué)習(xí)方法 最豐富的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn) 最權(quán)威的醫(yī)學(xué)期刊 最專業(yè)的醫(yī)學(xué)服務(wù)【參考文獻(xiàn)】1taniguchi t.knanakure h.yamamomto k.effects of posttreatment with propofol on mortality and cytokine responces to endotoxininduced shock in ratsj.crit care med，2002，30(12)：904907.

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