以木薯為原料檸檬酸發(fā)酵原理綜述

1、摘要摘要 本工藝采用黑曲霉在好氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。文章闡本工藝采用黑曲霉在好氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。文章闡述了利用木薯粉進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，及其發(fā)酵機(jī)制、發(fā)酵過程述了利用木薯粉進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，及其發(fā)酵機(jī)制、發(fā)酵過程控制、和產(chǎn)品的分離純化等?？刂?、和產(chǎn)品的分離純化等。 黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡黑曲霉利用糖類發(fā)酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經(jīng)萄糖經(jīng)EMP、HMP途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰脫羧生成乙酰CoA，另一方面經(jīng)，另一方面經(jīng)CO2固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，固定化反應(yīng)生成草酰乙酸，草酰乙酸與乙酰草酰乙酸與乙酰C

2、oA縮合生成縮合生成檸檬酸檸檬酸。 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞： 木薯粉、檸檬酸、發(fā)酵機(jī)制、分離純化木薯粉、檸檬酸、發(fā)酵機(jī)制、分離純化Abstract This process utilizes Aspergillus niger to fermentate production of citric acid under aerobic conditions. This artiele expounds the manioc flour was fermented to produce citric acid，fermentation mechanism, control of the fermentat

3、ion process, and product separation and purification. Aspergillus carbohydrate fermentation to generate citric acid biosynthetic pathway, glucose degradation of pyruvate by the EMP, the HMP pathway, pyruvate, on the one hand oxidative decarboxylation to generate the acetyl - CoA generated grass, on

4、the other hand by the CO2 fixation reaction . Keyword manioc flour; citric acid ; fermentation mechanism ; separation and purification.前言前言檸檬酸檸檬酸(citric acid)，學(xué)名，學(xué)名2-羥基丙烷三羧酸，分子式羥基丙烷三羧酸，分子式C6H8O7。為無色透明斜方晶系晶體顆粒，或白色結(jié)晶性粉末。無臭，有很為無色透明斜方晶系晶體顆粒，或白色結(jié)晶性粉末。無臭，有很強(qiáng)的酸味，味閾值為強(qiáng)的酸味，味閾值為0.0025%。在溫暖的空氣中漸漸風(fēng)化，在。在溫暖的空氣中漸漸

5、風(fēng)化，在潮濕空氣中微有潮解性。檸檬酸易溶于水，能溶于乙醇，而不溶潮濕空氣中微有潮解性。檸檬酸易溶于水，能溶于乙醇，而不溶于乙醚、氯仿、苯、于乙醚、氯仿、苯、CS2、CCl4及脂肪酸。及脂肪酸。采用木薯生產(chǎn)檸檬酸，既克服了薯干原料的質(zhì)量問題，同時(shí)也減采用木薯生產(chǎn)檸檬酸，既克服了薯干原料的質(zhì)量問題，同時(shí)也減少了用玉米粉生產(chǎn)檸檬酸時(shí)糖化、過濾等環(huán)節(jié)，縮短了輔助時(shí)間，少了用玉米粉生產(chǎn)檸檬酸時(shí)糖化、過濾等環(huán)節(jié)，縮短了輔助時(shí)間，節(jié)約了能源。發(fā)酵產(chǎn)酸可達(dá)節(jié)約了能源。發(fā)酵產(chǎn)酸可達(dá)14%以上，轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵周期等都比以上，轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵周期等都比薯干原料要強(qiáng)。因此已被廣泛采用。薯干原料要強(qiáng)。因此已被廣泛采用。 1.

6、 發(fā)酵機(jī)制發(fā)酵機(jī)制v1.1 生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種v1.2 生物合成途徑生物合成途徑v1.3 代謝調(diào)節(jié)機(jī)制代謝調(diào)節(jié)機(jī)制v1.4 產(chǎn)物積累機(jī)制產(chǎn)物積累機(jī)制1.1 生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種黑曲霉黑曲霉(Aspergillus niger)Wml-016,經(jīng)經(jīng)激光復(fù)合誘變選育激光復(fù)合誘變選育的木薯原料檸檬酸的木薯原料檸檬酸生產(chǎn)菌生產(chǎn)菌,該菌種由南該菌種由南通華澤生物化學(xué)有通華澤生物化學(xué)有限公司保藏。限公司保藏。黑曲霉的形態(tài)特征黑曲霉的形態(tài)特征在固體培養(yǎng)基上，菌落在固體培養(yǎng)基上，菌落由白由白色逐漸變至棕色色逐漸變至棕色。孢子區(qū)域。孢子區(qū)域?yàn)楹谏?，菌落呈絨毛狀，邊為黑色，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。緣不整齊。菌絲有隔膜

7、和分枝，是多細(xì)菌絲有隔膜和分枝，是多細(xì)胞的菌絲體，無色或有色，胞的菌絲體，無色或有色，有足細(xì)胞，頂囊生成一層或有足細(xì)胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一兩層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串串分生孢子。串串分生孢子。 黑曲霉的生理特征黑曲霉的生理特征 黑曲霉可利用淀粉，黑曲霉可利用淀粉，生長最適生長最適pH3-7pH3-7，產(chǎn)酸最適，產(chǎn)酸最適pH1.8-2.5pH1.8-2.5。 生長最適溫度生長最適溫度33-3733-37，產(chǎn)酸最適溫度，產(chǎn)酸最適溫度28-28-3737，溫度過高易形成雜酸。，溫度過高易形成雜酸。1.2生物合成途徑生物合成途徑 檸檬酸是葡萄糖經(jīng)檸檬酸是葡萄糖經(jīng)EMP或或HMP途徑生

8、產(chǎn)丙酮酸，途徑生產(chǎn)丙酮酸，丙酮酸再在有氧條件下，丙酮酸再在有氧條件下，一方面氧化脫羧生成乙一方面氧化脫羧生成乙酰酰CoA，另一方面丙酮酸，另一方面丙酮酸羧化生成草酰乙酸，草羧化生成草酰乙酸，草酰乙酸和乙酰酰乙酸和乙酰CoA在檸檬在檸檬酸合成酶的作用下縮合酸合成酶的作用下縮合生成檸檬酸。生成檸檬酸。1.3 代謝調(diào)節(jié)機(jī)制代謝調(diào)節(jié)機(jī)制糖酵解途徑與有氧呼吸途徑的調(diào)節(jié)糖酵解途徑與有氧呼吸途徑的調(diào)節(jié)（）激活（）激活 （）抑制（）抑制1.4 產(chǎn)物積累機(jī)制產(chǎn)物積累機(jī)制 由錳缺乏抑制了蛋白由錳缺乏抑制了蛋白質(zhì)的合成，而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的合成，而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)的 NH4+濃度升高和濃度升高和一條呼吸活性強(qiáng)的側(cè)系一條呼吸

9、活性強(qiáng)的側(cè)系呼吸鏈不產(chǎn)生呼吸鏈不產(chǎn)生ATP ，這，這兩方面的因素分別解除兩方面的因素分別解除了對(duì)磷酸果糖激酶的代了對(duì)磷酸果糖激酶的代謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)了謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)了EMP 途途徑暢通。徑暢通。 由組成型的丙酮酸羧化酶源源不斷提供草酰乙由組成型的丙酮酸羧化酶源源不斷提供草酰乙酸。酸。 在控制在控制Fe2+含量的情況下，順烏頭酸水合酶活含量的情況下，順烏頭酸水合酶活性低，從而使檸檬酸積累，順烏頭酸水合酶在催性低，從而使檸檬酸積累，順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立如下平衡，檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬化時(shí)建立如下平衡，檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸酸=90:3:7。（4）丙酮酸氧化脫羧生成乙酰）丙酮酸氧化脫羧生成乙酰

10、CoA和固定兩個(gè)反應(yīng)和固定兩個(gè)反應(yīng)平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)增強(qiáng)了合成檸平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)增強(qiáng)了合成檸檬酸能力。檬酸能力。（5）檸檬酸積累增多，）檸檬酸積累增多，pH低，在低低，在低pH時(shí)，順烏頭時(shí)，順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，從而進(jìn)一步促酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，從而進(jìn)一步促進(jìn)了檸檬酸自身的積累。進(jìn)了檸檬酸自身的積累。2. 發(fā)酵過程控制發(fā)酵過程控制v2.1 發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程v2.2 發(fā)酵控制要點(diǎn)發(fā)酵控制要點(diǎn)2.1 發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程2.2 發(fā)酵控制要點(diǎn)發(fā)酵控制要點(diǎn)（1）控制控制Mn2+、NH4+濃度濃度，解除檸檬酸對(duì)磷酸果糖激酶的抑制，解除檸檬酸對(duì)磷

11、酸果糖激酶的抑制，使使EMP暢通無阻。暢通無阻。 Mn2+濃度高時(shí)，檸檬酸合成明顯受影響，濃度高時(shí)，檸檬酸合成明顯受影響，其作用遠(yuǎn)甚于其作用遠(yuǎn)甚于Fe2+ 。Mn2+的不足可使細(xì)胞內(nèi)的不足可使細(xì)胞內(nèi)NH4+濃度升高，濃度升高，從而解除檸檬酸對(duì)酵解途徑的抑制作用。從而解除檸檬酸對(duì)酵解途徑的抑制作用。（2） 發(fā)酵發(fā)酵15h30h階段，菌體大量生長繁殖耗氧量最大，階段，菌體大量生長繁殖耗氧量最大，控制控制溶氧溶氧，防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ?。，防止?cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ?。?） pH偏堿性，則草酸增加偏堿性，則草酸增加；pH偏向中性，則葡萄糖酸增加偏向中性，則葡萄糖酸增加。在檸檬酸發(fā)酵時(shí)應(yīng)將在檸檬酸發(fā)酵時(shí)應(yīng)將pH降

12、到降到3.0以下，以控制草酸的產(chǎn)生。以下，以控制草酸的產(chǎn)生。（4）不同的發(fā)酵階段一般采用不同的溫度不同的發(fā)酵階段一般采用不同的溫度。較高的溫度（。較高的溫度（36-38）對(duì)黑曲霉生長有利。我國檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸溫度為）對(duì)黑曲霉生長有利。我國檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸溫度為34-36，與國外，與國外28-32的發(fā)酵溫度相比，稱為較高溫度。的發(fā)酵溫度相比，稱為較高溫度。3. 產(chǎn)物分離純化產(chǎn)物分離純化v3.1 工藝流程工藝流程v3.2 工藝要點(diǎn)說明工藝要點(diǎn)說明3.1.1 檸檬酸的分離提純方法檸檬酸的分離提純方法 檸檬酸的分離提純方法有檸檬酸的分離提純方法有鈣鹽法鈣鹽法、直接提取法直接提取法、溶溶媒萃取法媒萃取法、離

13、子交換法離子交換法和和滲析法滲析法等。等。 （1） 鈣鹽法鈣鹽法 即是將發(fā)酵液中的檸檬酸變成鈣鹽沉淀，然后用硫即是將發(fā)酵液中的檸檬酸變成鈣鹽沉淀，然后用硫酸將檸檬酸鈣置換出游離的檸檬酸，生成的酸將檸檬酸鈣置換出游離的檸檬酸，生成的硫酸鈣硫酸鈣沉淀沉淀出來，然后將檸檬酸進(jìn)一步純化結(jié)晶。出來，然后將檸檬酸進(jìn)一步純化結(jié)晶。（2）直接提取法）直接提取法 本法適用于本法適用于檸檬酸含量高檸檬酸含量高、雜質(zhì)少雜質(zhì)少的發(fā)酵濾液?？梢杂玫陌l(fā)酵濾液?？梢杂靡韵聨追N方法得到檸檬酸結(jié)晶。以下幾種方法得到檸檬酸結(jié)晶。 過濾清液先用過濾清液先用活性炭脫色活性炭脫色去除雜質(zhì)，濃縮結(jié)晶。去除雜質(zhì)，濃縮結(jié)晶。 用用CFCl-

14、CFCl（一氟二氯甲烷）（一氟二氯甲烷）抽提除去蛋白質(zhì)及其抽提除去蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)，將濾液分離出來濃縮結(jié)晶。他雜質(zhì)，將濾液分離出來濃縮結(jié)晶。 以以甲醇甲醇沉淀濾液中的蛋白質(zhì)，洗滌沉淀，回收甲醇后沉淀濾液中的蛋白質(zhì)，洗滌沉淀，回收甲醇后濃縮結(jié)晶。濃縮結(jié)晶。 用用活性炭活性炭將濾液脫色，濃縮，再將將濾液脫色，濃縮，再將3倍量丙酮沉淀蛋倍量丙酮沉淀蛋白質(zhì)，分離、回收丙酮，然后再濃縮結(jié)晶。白質(zhì)，分離、回收丙酮，然后再濃縮結(jié)晶。（3）萃取法）萃取法 即用即用溶媒溶媒將檸檬酸從發(fā)酵液中分離出來，常用的萃取溶將檸檬酸從發(fā)酵液中分離出來，常用的萃取溶劑有劑有4類：類： 僅含碳、氫、氧的乙酸乙酯、二乙醚、甲基異

15、丁酮；僅含碳、氫、氧的乙酸乙酯、二乙醚、甲基異丁酮； 含磷氧鍵的磷酸三丁脂；含磷氧鍵的磷酸三丁脂； 含硫氧鍵的亞砜；含硫氧鍵的亞砜； 有機(jī)胺如三辛胺。使用時(shí)可用正己烷、甲苯、乙酸乙有機(jī)胺如三辛胺。使用時(shí)可用正己烷、甲苯、乙酸乙酯、正丁醇等對(duì)某些黏度大的萃取劑進(jìn)行稀釋。酯、正丁醇等對(duì)某些黏度大的萃取劑進(jìn)行稀釋。（4）離子交換和滲析法）離子交換和滲析法 用用弱堿性弱堿性O(shè)H-型型701陰離子樹脂陰離子樹脂吸附，用吸附，用5%氫氧化銨氫氧化銨洗脫，得到檸檬酸胺溶液，然后通過強(qiáng)酸性洗脫，得到檸檬酸胺溶液，然后通過強(qiáng)酸性H+型型732樹脂交換，檸檬酸游離出來。樹脂交換，檸檬酸游離出來。 目前，德國和日本

16、的專利采用一種新的目前，德國和日本的專利采用一種新的CI-型陰離子型陰離子樹脂樹脂，直接用鹽酸洗脫，簡化了操作步驟，直接用鹽酸洗脫，簡化了操作步驟。3.1.2 工藝流程工藝流程 鈣鹽法提取工藝流程圖鈣鹽法提取工藝流程圖:離心離心干燥干燥包裝包裝成品成品凈化凈化濃縮濃縮結(jié)晶結(jié)晶發(fā)酵液發(fā)酵液過過 濾濾中和、過濾中和、過濾酸解、過濾酸解、過濾 石灰石石灰石 CaCO3鈣鹽鈣鹽H2SO4石膏渣石膏渣母液母液主要步驟主要步驟（1）檸檬酸鈣的生成檸檬酸鈣的生成 70%碳酸鈣粉中和，檸檬酸鈣碳酸鈣粉中和，檸檬酸鈣沉淀，在沉淀，在9095熱水洗滌熱水洗滌（2）硫酸置換反應(yīng)硫酸置換反應(yīng) 攪拌加入攪拌加入80%9

17、0%的濃硫酸，溫的濃硫酸，溫度在度在80 以上以上（3）脫色脫色 活性炭脫色和大孔樹脂脫色等活性炭脫色和大孔樹脂脫色等（4）去除陽離子雜質(zhì)去除陽離子雜質(zhì) 陽離子樹脂進(jìn)行離子交換陽離子樹脂進(jìn)行離子交換（5）濃縮濃縮 減壓濃縮減壓濃縮（6）結(jié)晶結(jié)晶 緩慢攪拌，冷卻結(jié)晶緩慢攪拌，冷卻結(jié)晶3.2 工藝要點(diǎn)說明工藝要點(diǎn)說明 發(fā)酵液經(jīng)加熱處理后，濾去菌體等殘?jiān)谥泻屯爸屑影l(fā)酵液經(jīng)加熱處理后，濾去菌體等殘?jiān)谥泻屯爸屑尤肴隒aCO3 或石灰乳中和，使檸檬酸以鹽的形式沉淀下來，或石灰乳中和，使檸檬酸以鹽的形式沉淀下來，廢糖水和可溶性雜質(zhì)則過濾除去。廢糖水和可溶性雜質(zhì)則過濾除去。 檸檬酸鈣在酸解槽中加入檸檬

18、酸鈣在酸解槽中加入H2SO4 酸解使檸檬酸分離出來，酸解使檸檬酸分離出來，形成的硫酸鈣被濾除，作為副產(chǎn)品利用，這時(shí)得到的粗形成的硫酸鈣被濾除，作為副產(chǎn)品利用，這時(shí)得到的粗檸檬酸溶液通過脫色和離子交換凈化，除去色素和膠體檸檬酸溶液通過脫色和離子交換凈化，除去色素和膠體雜質(zhì)以及無機(jī)雜質(zhì)離子。雜質(zhì)以及無機(jī)雜質(zhì)離子。 凈化后的檸檬酸溶液濃縮后結(jié)晶出來，離心分離晶體，凈化后的檸檬酸溶液濃縮后結(jié)晶出來，離心分離晶體，母液則重新凈化后濃縮，結(jié)晶。檸檬酸晶體經(jīng)干燥和檢母液則重新凈化后濃縮，結(jié)晶。檸檬酸晶體經(jīng)干燥和檢驗(yàn)后出廠。驗(yàn)后出廠。小結(jié)小結(jié) 以上對(duì)黑曲霉好氧發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的菌種、代謝途徑、以上對(duì)黑曲霉好氧發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的菌種、代謝途徑、發(fā)酵機(jī)理及流程和發(fā)酵結(jié)束后對(duì)產(chǎn)品的分離純化過程發(fā)酵機(jī)理及流程和發(fā)酵結(jié)束后對(duì)產(chǎn)品的分離純化過程進(jìn)行了簡單描述。很多內(nèi)容沒有詳細(xì)寫，如菌種的篩進(jìn)行了簡單