基因工程基因文庫的構(gòu)建課件

1、基因工程基因文庫的構(gòu)建第六部分第六部分 基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建一、基因文庫的概述一、基因文庫的概述二、基因組二、基因組DNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建三、三、cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建基因工程基因文庫的構(gòu)建1 1、基因文庫、基因文庫(gene library)(gene library)概念概念是指將某種生物的全部基因組的遺傳信息是指將某種生物的全部基因組的遺傳信息貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，貯存在可以長期保存的穩(wěn)定的重組體中，以備需要時(shí)能夠隨時(shí)應(yīng)用它分離所需要的以備需要時(shí)能夠隨時(shí)應(yīng)用它分離所需要的目的基因，這種保存基因遺傳信息的材料目的基因，這種保存基因遺傳信息的材料，就稱為基因文

2、庫又稱，就稱為基因文庫又稱DNADNA文庫。文庫?；蛭膸煊赏庠椿蛭膸煊赏庠碊NADNA片段、載體和宿主細(xì)胞片段、載體和宿主細(xì)胞組成。組成。一、一、基因文庫的概述基因文庫的概述基因工程基因文庫的構(gòu)建2 2、基因文庫的分類、基因文庫的分類基因組基因組DNADNA：提取的染色體基因組提取的染色體基因組DNADNA。如果要研究。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在mRNAmRNA中不存中不存在的某種特定序列，有關(guān)這類的信息就只能從染色在的某種特定序列，有關(guān)這類的信息就只能從染色體基因組體基因組DNADNA中獲得。中獲得。cDNAcDNA：mRNAmRNA反

3、轉(zhuǎn)錄成的反轉(zhuǎn)錄成的cDNA cDNA 。如果研究的目標(biāo)是。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的cDNAcDNA分子的核苷酸序列直接推導(dǎo)出來。分子的核苷酸序列直接推導(dǎo)出來?；蚪M文庫（基因組文庫（genomic librarygenomic library）含有全部基因。）含有全部基因。 cDNAcDNA文庫（文庫（cDNA librarycDNA library）含有全部蛋白質(zhì)編碼的）含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因。 基因工程基因文庫的構(gòu)建用用鳥槍法鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體染色體DNAD

4、NA。用用cDNAcDNA法法構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫，材料來自文庫，材料來自mRNAmRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的的mRNAmRNA種類不同（種類不同（即基因的表達(dá)譜不同即基因的表達(dá)譜不同），因此同種），因此同種生物體的生物體的cDNAcDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組肝組織織cDNAcDNA文庫文庫或或胚胎組織胚胎組織cDNAcDNA文庫文庫等。很顯然，等。很顯然， cDNAcDNA文文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫。庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建(1)(1)

5、基因組文庫基因組文庫(Genomic library)(Genomic library)是指將某種生物體的全部基因組是指將某種生物體的全部基因組DNADNA用限制性內(nèi)切用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的DNADNA片段，再片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落，這個(gè)群體就稱為該生物基獲得的所有陽性菌落，這個(gè)群體就稱為該生物基因組文庫。因組文庫。目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。部基因?；蚪M文庫根據(jù)基因組文庫根據(jù)DNADNA

6、來源分為：核基因組文庫、葉來源分為：核基因組文庫、葉綠體基因組文庫、線粒體基因組文庫。綠體基因組文庫、線粒體基因組文庫?？寺⊥庠纯寺⊥庠?DNADNA片段的切割主要采用片段的切割主要采用機(jī)械斷裂或限機(jī)械斷裂或限制性部分酶解制性部分酶解兩種方法，其基本原則：兩種方法，其基本原則：DNA DNA 片段之間存在部分重疊序列。片段之間存在部分重疊序列。DNA DNA 片段大小均一。片段大小均一。2021-10-16基因工程基因文庫的構(gòu)建6(2) cDNA(2) cDNA文庫文庫 (cDNA library) (cDNA library) ：是指將某種生物體某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部是指將某種生物體某一發(fā)

7、育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNAmRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNAcDNA片段與某種載體連接而形成的片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。克隆的集合。cDNA(complementary DNAcDNA(complementary DNA，互補(bǔ)，互補(bǔ)DNA)DNA)：是由生物的：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNAmRNA經(jīng)體外經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNADNA?；蚪M文庫與基因組文庫與cDNAcDNA文庫的最大區(qū)別：文庫的最大區(qū)別：基因組文庫含有而基因組文庫含有而cDNAcDNA文庫不含有文庫不含有非轉(zhuǎn)錄的基因組非轉(zhuǎn)錄

8、的基因組序列。序列?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建3 3、構(gòu)建基因文庫的基本方法、構(gòu)建基因文庫的基本方法將特定生物體的因組將特定生物體的因組DNADNA或或cDNAcDNA分解成適當(dāng)大分解成適當(dāng)大小的小的DNADNA片段片段, ,然后分別與克隆載體連接成重然后分別與克隆載體連接成重組組DNADNA分子。分子。通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同DNADNA片段的片段的重組重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得一套包含特分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得一套包含特定生物體所有定生物體所有DNADNA序列的克隆。序列的克隆?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建二、基因組文庫的構(gòu)建二、基因組文庫的構(gòu)建( (一

9、一) )基因組文庫的類型基因組文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫等）。體文庫等）?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建( (二二) )基因文庫的完備性基因文庫的完備性基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)數(shù)N N之間的關(guān)系可用下式表示：之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 P )

10、 / ln ( 1 N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) f )基因工程基因文庫的構(gòu)建（三）基因組（三）基因組DNADNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因組除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因組DNADNA文庫應(yīng)具備下列條件：文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分 隔克隆。隔克隆?？寺∨c克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以 利于克隆排序。利

11、于克隆排序?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建( (四四) )基因組文庫構(gòu)建的一般步驟基因組文庫構(gòu)建的一般步驟 載體的選擇和制備。載體的選擇和制備。 高純度、大分子量基因組高純度、大分子量基因組 DNA DNA 的提取。的提取。 基因組基因組 DNA DNA 的部分酶切與分級分離。的部分酶切與分級分離。 載體與載體與DNADNA片段的連接。片段的連接。 轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。篩選鑒定基因組及保存。篩選鑒定基因組及保存。 基因工程基因文庫的構(gòu)建載體和受體的選擇

12、載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的通常選裝載量較大的l l-DNA-DNA或考斯質(zhì)粒；對于大型基因或考斯質(zhì)粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用組（如動植物和人類）需使用YACYAC或或BACBAC載體由于絕大多載體由于絕大多數(shù)真核生物的數(shù)真核生物的mRNAmRNA小于小于10 10 kbkb，因此用于因此用于cDNAcDNA文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒或的載體通常選質(zhì)?；騦 l-DNA-DNA上述幾種載體的最大裝載量如下：上述幾種載體的最大裝載量如下：用于基因用于基因文庫構(gòu)文庫構(gòu)建的受體則

13、根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌基因工程基因文庫的構(gòu)建基因組基因組DNADNA的制備的制備為了最大限度保證基因在克隆過程中的完整性，為了最大限度保證基因在克隆過程中的完整性， 用于用于基因組文庫構(gòu)建的基因組文庫構(gòu)建的DNADNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的度的斷裂。制備的DNADNA分子量越大（至少是插入片斷大分子量越大（至少是插入片斷大小的小的3 35 5倍），文庫的重組率和完備性也就越高。倍），文庫的重組率和完備性也就越高。用常規(guī)方法制備的染色體用常規(guī)方法制備的染色體DNADNA的長度一般在的長度一般在100 1

14、00 kbkb左右左右如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDSSDS蛋白酶蛋白酶K K、RNaseARNaseA的緩沖液中浸泡，可獲得的緩沖液中浸泡，可獲得 100 kb100 kb大大小的小的DNADNA片段。片段。AAAA基因工程基因文庫的構(gòu)建基因組基因組DNADNA的切割的切割用于基因組文庫構(gòu)建的用于基因組文庫構(gòu)建的DNADNA片段的切割一般采用超聲波片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：保證保證DNADNA片段之間存在部分重疊區(qū)。片段之間存在部分重疊區(qū)。保

15、證保證DNADNA片段大小均一。片段大小均一。超聲波處理后的超聲波處理后的DNADNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。部分酶切法一般選用部分酶切法一般選用4 4堿基識別序列堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶的限制性內(nèi)切酶，如：如：Sau3ASau3A或或MboIMboI等，這樣等，這樣DNADNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控連接前，上述處理的連接前，上述處理的DNADNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級分離，以杜絕不相干的行分級分離，以杜絕不相干的DNADNA片段隨機(jī)連為一體！片段隨機(jī)連為一體！基因工程基因文庫的構(gòu)建載體與載體與DNADN

16、A片段的連接片段的連接在基因組文庫的構(gòu)建過程中，大量體系連在基因組文庫的構(gòu)建過程中，大量體系連接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！方法一：粘末端連接方法一：粘末端連接方法二：人工接頭法方法二：人工接頭法轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最好選擇轉(zhuǎn)在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的?；矢叩?。進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進(jìn)口包裝蛋進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進(jìn)口包裝蛋白！白！基因工程基因文庫的構(gòu)建（五）基因組文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題（五）基因組文庫構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：在基因組文庫的構(gòu)

17、建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源嚴(yán)禁外源DNADNA片段之間的連接！片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：將待連接的將待連接的DNADNA片段根據(jù)載體的裝載量分級分離。片段根據(jù)載體的裝載量分級分離。用堿性磷酸單酯酶除去用堿性磷酸單酯酶除去DNADNA片段的末端磷酸基團(tuán)。片段的末端磷酸基團(tuán)。在在DNADNA片段的末端添加人工接頭片段的末端添加人工接頭 。基因工程基因文庫的構(gòu)建（六）構(gòu)建基因組文庫應(yīng)注意的問題（六）構(gòu)建基因組文庫應(yīng)注意的問題構(gòu)建一個(gè)文庫，插入構(gòu)建一個(gè)文庫，插入DNADNA和載體和載體DNADNA的質(zhì)量是的

18、質(zhì)量是成功與否的關(guān)鍵。基因組成功與否的關(guān)鍵?；蚪MDNADNA應(yīng)當(dāng)非常純以適應(yīng)當(dāng)非常純以適應(yīng)應(yīng)DNADNA的酶解，而且基因組的酶解，而且基因組DNADNA也應(yīng)足夠大（也應(yīng)足夠大（最好超過最好超過200kb200kb）以獲得兩個(gè)末端的消化產(chǎn)物）以獲得兩個(gè)末端的消化產(chǎn)物。 不論是載體不論是載體DNADNA還是靶還是靶DNADNA不含外源片段是一不含外源片段是一個(gè)基本條件。污染少量探針順序或載體的基個(gè)基本條件。污染少量探針順序或載體的基因組因組DNADNA將引起很大麻煩，這是因?yàn)樵诤Y選過將引起很大麻煩，這是因?yàn)樵诤Y選過程中它們將被鑒定為所要的克隆。程中它們將被鑒定為所要的克隆。 基因工程基因文庫的構(gòu)

19、建部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個(gè)基因組的部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個(gè)基因組的隨機(jī)片段。識別隨機(jī)片段。識別4個(gè)堿基的限制酶要比識別個(gè)堿基的限制酶要比識別6個(gè)堿基酶能產(chǎn)生更隨機(jī)的插入片段。部分消個(gè)堿基酶能產(chǎn)生更隨機(jī)的插入片段。部分消化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。限制酶和部分消化過程應(yīng)事先檢查。一些批限制酶和部分消化過程應(yīng)事先檢查。一些批次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA片段末片段末端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒有出現(xiàn)端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒有出現(xiàn)，檢查限制酶和，檢查限制酶和DNA濃度及純度。濃度及純度?；蚬こ袒?/p>

20、因文庫的構(gòu)建在考慮把在考慮把噬菌體臂和插入噬菌體臂和插入DNADNA片段連接過程中有兩片段連接過程中有兩個(gè)重要參數(shù)：個(gè)重要參數(shù)：噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組組DNADNA的濃度和純度。大約的濃度和純度。大約10pg10pg噬菌臂和噬菌臂和4gDNA4gDNA能能產(chǎn)生有效地包裝。對一個(gè)典型的基因組要產(chǎn)生一個(gè)可產(chǎn)生有效地包裝。對一個(gè)典型的基因組要產(chǎn)生一個(gè)可表達(dá)文庫，重組子數(shù)一般要大于表達(dá)文庫，重組子數(shù)一般要大于1 110106 666l0l06 6。 包裝抽提物的包裝效率貯存于液氮中可保持包裝抽提物的包裝效率貯存于液氮中可保持1 1年多。年多。而在而在-70-

21、70中只能保存幾星期，而且包裝效率還會降中只能保存幾星期，而且包裝效率還會降低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個(gè)關(guān)鍵性因素，商業(yè)低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個(gè)關(guān)鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如性包裝抽提物，例如GigapackGigapack（StratageneStratagene），都已），都已有商售。這種包裝提取物質(zhì)量高，且在體外包裝有商售。這種包裝提取物質(zhì)量高，且在體外包裝噬噬菌體菌體DNADNA和插入片段過程能產(chǎn)生大量的噬菌斑。和插入片段過程能產(chǎn)生大量的噬菌斑?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建（七（七) )原核生物基因組文庫的構(gòu)建原核生物基因組文庫的構(gòu)建1 1、原核生物基因組的提取、原核生物基因組的

22、提取染色體染色體DNADNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA要求：制備的要求：制備的DNADNA的長度為的長度為100-200kb100-200kb。防止在制備過程中的機(jī)械斷裂。防止在制備過程中的機(jī)械斷裂?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建2 2、酶切片段與載體連接、酶切片段與載體連接酶切片段及分離、純化酶切片段及分離、純化基因組的不完全酶切基因組的不完全酶切根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶 四個(gè)識別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率四個(gè)識別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/256: 1/256 六個(gè)識別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率六個(gè)識別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/1024: 1/1024分離目的酶

23、切片段大小的確定分離目的酶切片段大小的確定 克隆單個(gè)基因：克隆單個(gè)基因： 10 kb 10 kb 克隆基因族：克隆基因族： 20kb 20kbDNADNA不完全酶切條件的確定不完全酶切條件的確定 確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間 固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量基因工程基因文庫的構(gòu)建DNADNA的不完全酶切的不完全酶切酶切片段回收酶切片段回收低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段試劑盒回收目的片段試劑盒回收目的片段基因工程基因文庫的構(gòu)建酶切片段與克隆載體連接酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇：克隆載體的選擇：質(zhì)粒載體可承載質(zhì)粒載體

24、可承載15kb DNA15kb DNA左右片段左右片段 l l載體可承載載體可承載25kb DNA25kb DNA左右片段左右片段Cosmid Cosmid 載體可承載載體可承載45kb DNA45kb DNA左右片段左右片段3 3、重組、重組DNADNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：常見的宿主細(xì)胞：DH5DH5 、HB101HB101、JM101JM101、JM109JM109重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1 1）轉(zhuǎn)化法）轉(zhuǎn)化法(transformation)(transformation)2 2）轉(zhuǎn)

25、染法）轉(zhuǎn)染法(transfection)(transfection)3 3）轉(zhuǎn)導(dǎo)法）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)(transduction)基因工程基因文庫的構(gòu)建4 4、基因組、基因組DNADNA文庫克隆子保存與篩選文庫克隆子保存與篩選基因組基因組DNADNA文庫的保存文庫的保存文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌混合的細(xì)菌生長數(shù)代后生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于，其培養(yǎng)物于-80-80儲存（加終儲存（加終濃度為濃度為25%25%的甘油）。

26、的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序列過多或過少。庫中某些特定的序列過多或過少?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子單個(gè)克隆子接種于合適的含接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為入終濃度為25%25%的甘油，于的甘油，于-80-80保存。保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建基因組文庫的篩選基因組

27、文庫的篩選表型篩選法：表型篩選法：表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選。表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選?？剐院Y選法：抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐。如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐。 二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長。二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長。分子雜交法：分子雜交法：利用分子探針對文庫進(jìn)行篩選。利用分子探針對文庫進(jìn)行篩選。免疫篩選法：免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交利用多肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交 篩選。篩選。PCRPCR篩選法：篩選法：根據(jù)保守序列合成引物根據(jù)保守序列合成引物, ,擴(kuò)增特異性擴(kuò)增特異性 片段。片段?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建基因工程基因文庫的構(gòu)建從

28、基因文庫中迅速準(zhǔn)確地鎖定目的基因至從基因文庫中迅速準(zhǔn)確地鎖定目的基因至關(guān)重關(guān)重要，其成敗與所掌握的有關(guān)目的基因的背要，其成敗與所掌握的有關(guān)目的基因的背景知景知識密切相關(guān)。目的基因的背景知識包括：識密切相關(guān)。目的基因的背景知識包括：目的基因的部分或全部堿基序列已知。目的基因的部分或全部堿基序列已知。目的基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或功能已知。目的基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或功能已知。目的基因與某些生物表型的相關(guān)性已知目的基因與某些生物表型的相關(guān)性已知。基因工程基因文庫的構(gòu)建( (八八) )用用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的步驟噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的步驟準(zhǔn)備載體準(zhǔn)備載體DNA(DNA(如置換型如置換型噬菌體載體噬菌

29、體載體) )，用適當(dāng)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化并分離得到載體的左右的限制性內(nèi)切核酸酶消化并分離得到載體的左右兩臂。兩臂。純化真核細(xì)胞高分子質(zhì)量純化真核細(xì)胞高分子質(zhì)量DNADNA，并用適當(dāng)?shù)南拗疲⒂眠m當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶部分消化。性內(nèi)切核酸酶部分消化。分離適當(dāng)大小的基因組分離適當(dāng)大小的基因組DNADNA片段片段(20-24kb)(20-24kb)。連接載體與外源連接載體與外源DNADNA。連接產(chǎn)物體外包裝及感染。連接產(chǎn)物體外包裝及感染?；蚪M文庫的擴(kuò)增?；蚪M文庫的擴(kuò)增?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建基因組文庫基因組文庫限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶基因組基因組DNADNA基因重組基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)

30、菌體外包裝體外包裝基因工程基因文庫的構(gòu)建三、三、cDNAcDNA文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建真核生物基因組大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的非真核生物基因組大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的非編碼區(qū)、內(nèi)含子和重復(fù)序列等，直接利用基因編碼區(qū)、內(nèi)含子和重復(fù)序列等，直接利用基因文庫很難分離得到目的基因。即使分離到文庫很難分離得到目的基因。即使分離到DNADNA片片段，也要同段，也要同cDNAcDNA序列進(jìn)行比較。序列進(jìn)行比較。 mRNAmRNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，且只在特定組是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，且只在特定組織器官和發(fā)育時(shí)期表達(dá)。因此，從織器官和發(fā)育時(shí)期表達(dá)。因此，從cDNAcDNA克隆文克隆文庫分離基因更具優(yōu)勢。此外，庫分

31、離基因更具優(yōu)勢。此外，mRNAmRNA決定了功能決定了功能蛋白質(zhì)的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白蛋白質(zhì)的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白質(zhì)的功能。質(zhì)的功能?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建( (一一)cDNA)cDNA文庫的特征文庫的特征從從cDNAcDNA文庫獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的文庫獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA,cDNA,它不含真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū)它不含真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū), , 只反映只反映mRNAmRNA的分子結(jié)構(gòu)，并不是真正意義上的基因。的分子結(jié)構(gòu)，并不是真正意義上的基因。cDNAcDNA文庫僅包含某種組織或細(xì)胞正在表達(dá)的基因。文庫僅包含某種組織或細(xì)胞正

32、在表達(dá)的基因?；蚩偭可?，顯然比基因組基因總量少，顯然比基因組DNADNA文庫小得多，很容易文庫小得多，很容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)基因。從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)基因。cDNAcDNA文庫是有時(shí)效性的，文庫構(gòu)建時(shí)的信息供體是某文庫是有時(shí)效性的，文庫構(gòu)建時(shí)的信息供體是某一時(shí)空條件下的細(xì)胞總一時(shí)空條件下的細(xì)胞總mRNAmRNA，它是在轉(zhuǎn)錄水平上反映，它是在轉(zhuǎn)錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)育時(shí)期，某一特定組織該生物在某一特定發(fā)育時(shí)期，某一特定組織( (或器官或器官) )在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況并不能包括該生物在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況并不能包括該生物有機(jī)體的全部基因，不同物種、不

33、同組織的有機(jī)體的全部基因，不同物種、不同組織的cDNAcDNA文庫文庫不同。不同?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建( (二二)cDNA)cDNA文庫的用途文庫的用途cDNAcDNA文庫可作為研究功能基因組學(xué)的基本手段。文庫可作為研究功能基因組學(xué)的基本手段。cDNAcDNA便于克隆和大量表達(dá)便于克隆和大量表達(dá), ,因此可以從因此可以從cDNAcDNA文庫中篩選到所文庫中篩選到所需的目的基因需的目的基因, ,并直接用于該目的基因的表達(dá)。并直接用于該目的基因的表達(dá)。cDNAcDNA文庫也可用于保護(hù)瀕危珍稀生物資源，提供構(gòu)建文庫也可用于保護(hù)瀕危珍稀生物資源，提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，可用于分離全長基因

34、，分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，可用于分離全長基因，進(jìn)而開展基因功能的研究。進(jìn)而開展基因功能的研究。cDNAcDNA在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，在個(gè)體發(fā)表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。等生命現(xiàn)象的研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建( (三三)cDNA)cDNA文庫構(gòu)建的步驟文庫構(gòu)建的步驟細(xì)胞總細(xì)胞總RNARNA的提取和的提取和mRNAmRNA的分離

35、的分離第一鏈第一鏈cDNAcDNA合成合成第二鏈第二鏈cDNAcDNA合成合成雙鏈雙鏈cDNAcDNA的分級分離的分級分離雙鏈雙鏈cDNAcDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖入宿主中繁殖重組體的篩選與鑒定重組體的篩選與鑒定基因工程基因文庫的構(gòu)建1 1、細(xì)胞總、細(xì)胞總RNARNA的提取和的提取和mRNAmRNA的分離的分離mRNAmRNA的來源的來源: :選用選用mRNAmRNA含量高的組織材料，或通過藥物含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高等方法提高mRNAmRNA的含量。的含量。mRNAmRNA的制備的制備: :動物細(xì)胞或植物細(xì)胞動物細(xì)胞或植物細(xì)胞mRN

36、AmRNA的制備的制備mRNAmRNA完整性的檢測完整性的檢測哺乳動物哺乳動物mRNAmRNA長度為長度為500-8000bp500-8000bp，大部分，大部分mRNAmRNA位于位于1.5-2.0kb1.5-2.0kb之間。之間?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建mRNAmRNA的提取的提取全長全長mRNAmRNA具有一個(gè)具有一個(gè)polyApolyA的的33末端，可以被用于末端，可以被用于mRNAmRNA的的分離。分離?？梢杂霉丫劾w維素柱，選擇性地吸附可以用寡聚纖維素柱，選擇性地吸附mRNAmRNA?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建2 2、第一鏈、第一鏈cDNAcDNA的合成的合成oligo(dT)oligo(

37、dT)引導(dǎo)的引導(dǎo)的DNADNA合成法：合成法：利用真核利用真核mRNAmRNA分子所具有的分子所具有的poly(A)poly(A)尾巴的特性，尾巴的特性，加入加入12-2012-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNAcDNA第一鏈第一鏈 缺點(diǎn)：因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶無法到達(dá)缺點(diǎn)：因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶無法到達(dá)mRNAmRNA分子的分子的55末端，末端，必須從必須從33末端開始合成末端開始合成cDNAcDNA。對于大分子量的較。對于大分子量的較長的長的mRNAmRNA分子無法達(dá)到分子無法達(dá)到55末端。末端?；蚬こ?/p>

38、基因文庫的構(gòu)建cDNAcDNA第一鏈的合成第一鏈的合成 基因工程基因文庫的構(gòu)建隨機(jī)引物引導(dǎo)的隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNAcDNA合成法合成法 ：根據(jù)許多可能的序列，合成出根據(jù)許多可能的序列，合成出6-106-10個(gè)核苷酸長的個(gè)核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNAcDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNAcDNA的合成可以從的合成可以從mRNAmRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生，而不僅僅從，而不僅僅從33末端的末端的oligo(dT)oligo(dT)引物一處開始引物一處開始。

39、比較容易合成特長的。比較容易合成特長的mRNAmRNA分子的分子的55端序列端序列隨機(jī)引物隨機(jī)引物 cDNA cDNA 合成的方法不適合構(gòu)建合成的方法不適合構(gòu)建cDNA cDNA 文文庫，一般用于克隆特定庫，一般用于克隆特定 mRNAmRNA的的 5 5 末端，如末端，如 RT-PCR RT-PCR 和和 5-RACE 5-RACE 。基因工程基因文庫的構(gòu)建3 3、第二鏈、第二鏈cDNAcDNA的合成的合成cDNAcDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNAmRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈雜合雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈cDNAcDNA的過程。的過程。cDN

40、AcDNA第二鏈的合成的方法大致第二鏈的合成的方法大致4 4種：種：自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、引導(dǎo)合自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、引物銜接頭合成法。成法、引物銜接頭合成法?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建自身引導(dǎo)合成法：自身引導(dǎo)合成法：獲得的單鏈獲得的單鏈cDNA3cDNA3端會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此端會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此作為第二鏈合成的引物，在作為第二鏈合成的引物，在KlenowKlenow酶或反轉(zhuǎn)錄酶或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成酶的作用下，合成cDNAcDNA的第二鏈。的第二鏈。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： S1S1核酸酶切割核酸酶切割cDNAcDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)，的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)，會導(dǎo)致對應(yīng)于會導(dǎo)致對應(yīng)于mR

41、NA 5mRNA 5端的地方的序列出現(xiàn)缺端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。失和重排。 S1S1核酸酶的純度不夠時(shí)，會偶爾核酸酶的純度不夠時(shí)，會偶爾破壞合成的雙鏈破壞合成的雙鏈cDNAcDNA分子。分子?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建自身合成法：獲得的雙鏈自身合成法：獲得的雙鏈cDNAcDNA55端會有幾對堿基缺失。端會有幾對堿基缺失?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建置換合成法：置換合成法：cDNA cDNA 第一鏈合成反應(yīng)的產(chǎn)物第一鏈合成反應(yīng)的產(chǎn)物 cDNAmRNAcDNAmRNA不經(jīng)變性不經(jīng)變性直接與直接與 RNARNA酶酶 H H 和大腸桿菌和大腸桿菌 DNA DNA 聚合酶聚合酶混合混合，此時(shí)，此時(shí) RNA

42、RNA 酶酶 H H 在雜合雙鏈的在雜合雙鏈的 mRNA mRNA 鏈上產(chǎn)生鏈上產(chǎn)生缺口（內(nèi)切作用）并形成部分缺口（內(nèi)切作用）并形成部分 cDNA cDNA 單鏈區(qū)（外單鏈區(qū)（外切作用）切作用）DNA DNA 聚合酶聚合酶則以殘存的則以殘存的 mRNAmRNA作為引物作為引物合成合成 cDNA cDNA 第二鏈，最后用第二鏈，最后用 T4DNAT4DNA連接酶修復(fù)缺連接酶修復(fù)缺口。用這種方法獲得的口。用這種方法獲得的 cDNAcDNA雙鏈分子含有殘留的雙鏈分子含有殘留的一小段一小段 RNARNA，但這并不影響后續(xù)的克隆操作。，但這并不影響后續(xù)的克隆操作。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：cDNAcDNA雙鏈合成效率

43、高，操作簡捷無需對第雙鏈合成效率高，操作簡捷無需對第一鏈合成產(chǎn)物進(jìn)行額外的變性處理，更重要的是一鏈合成產(chǎn)物進(jìn)行額外的變性處理，更重要的是避免了避免了 cDNA cDNA 雙鏈分子末端的缺損。雙鏈分子末端的缺損?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建置換合成法置換合成法基因工程基因文庫的構(gòu)建引物合成法：引物合成法：在第一鏈合成完畢后，變性在第一鏈合成完畢后，變性殘留的殘留的 mRNAmRNA，用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶，用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶在在 cDNA cDNA 游離的游離的 33羥基上添加同聚物（羥基上添加同聚物（d Cd C ） 末 端 ， 然 后 將 之 與 人 工 合 成 的） 末 端 ， 然 后 將

44、之 與 人 工 合 成 的 oligodGoligodG退火，形成引物結(jié)構(gòu)，在退火，形成引物結(jié)構(gòu)，在 Klenow Klenow 酶的作用下合成第二條酶的作用下合成第二條 cDNA cDNA 鏈。鏈?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA cDNA 能保留完整的能保留完整的55端序列端序列基因工程基因文庫的構(gòu)建引物引物- -銜接頭法銜接頭法基因工程基因文庫的構(gòu)建4 4、雙鏈、雙鏈cDNAcDNA的分級分離的分級分離mRNAmRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNAcDNA，在插入到克隆載體，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的前，通過瓊脂糖

45、凝膠電泳，將不同大小的cDNAcDNA分子分離開來。分子分離開來。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：避免了分離過程中避免了分離過程中mRNAmRNA被污染的被污染的RNARNA酶降解酶降解增加了獲得全長增加了獲得全長cDNAcDNA克隆的概率?？寺〉母怕?。獲得更準(zhǔn)確的分級分離效果（分子量）。獲得更準(zhǔn)確的分級分離效果（分子量）?；蚬こ袒蛭膸斓臉?gòu)建5 5、雙鏈、雙鏈cDNAcDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖中繁殖cDNAcDNA末端的處理末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈了避免用平末端

46、與載體連接，對雙鏈cDNAcDNA的末的末端進(jìn)行加工是十分必要的。端進(jìn)行加工是十分必要的。方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端。的黏性末端。末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶可以向可以向cDNAcDNA末端加上與克隆載體末端加上與克隆載體末端互補(bǔ)的尾部。末端互補(bǔ)的尾部。基因工程基因文庫的構(gòu)建6、利用、利用PCR技術(shù)構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫文庫能夠從極其有限的起始材料中構(gòu)建能夠從極其有限的起始材料中構(gòu)建cDNA文庫文庫。以總以總RNA為模板合成為模板合成cDNA，無需無需mRNA的的純化，不僅簡化操作，而且避免了低豐度信純化，不僅簡化操作，而且避免了低豐度信息分子的丟失。息分子的丟失。能夠提高能夠提高cDNA文庫的完整性，獲得那些低水文庫的完整性，獲得那些低水平表達(dá)的基因的平表達(dá)的基因的cDNA克隆。此法對植物基因克隆。此法對植物基因功能的研究，如對某種外界因素作用后或不功能的研究