核醫(yī)學第8章受體的放射性配基結(jié)合分析

1、安徽醫(yī)科大學 易啟毅 第八章 受體的放射性配基結(jié)合分析radioligand binding assay,RBA 2014-3-14受體受體: : 細胞表面或亞細胞組分中的一種分子，可細胞表面或亞細胞組分中的一種分子，可以識別并特異地與有生物活性的化學信號物質(zhì)以識別并特異地與有生物活性的化學信號物質(zhì)( (配配體體) )結(jié)合，從而激活或啟動一系列生化反應(yīng)，最后結(jié)合，從而激活或啟動一系列生化反應(yīng)，最后導致該信號物質(zhì)特定的生物效應(yīng)。導致該信號物質(zhì)特定的生物效應(yīng)。迄今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的受體都是具有特定氨基迄今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的受體都是具有特定氨基酸序列和特定構(gòu)型的蛋白質(zhì)。每一種受體在細胞酸序列和特定構(gòu)

2、型的蛋白質(zhì)。每一種受體在細胞上都有特定的宏觀分布和微觀分布。上都有特定的宏觀分布和微觀分布。 1. 1. 概概 論論 一、受體功能一、受體功能 識別特異的信號物質(zhì)識別特異的信號物質(zhì)-配基，識別的表現(xiàn)在于配基，識別的表現(xiàn)在于兩者的特異結(jié)合。兩者的特異結(jié)合。 把識別和接受的信號準確無誤的放大并傳遞到把識別和接受的信號準確無誤的放大并傳遞到細胞內(nèi)部，同時啟動一系列胞內(nèi)生化反應(yīng)，最細胞內(nèi)部，同時啟動一系列胞內(nèi)生化反應(yīng)，最后導致特定的細胞反應(yīng)，使得胞外信號轉(zhuǎn)換為后導致特定的細胞反應(yīng)，使得胞外信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號。胞內(nèi)信號。 受體接受細胞外的特定信號受體接受細胞外的特定信號 ( (神經(jīng)遞質(zhì)、激神經(jīng)遞質(zhì)、激素

3、、某些藥物和毒物等，稱為素、某些藥物和毒物等，稱為配基，配基，ligandligand) )，通過受體后特定的信號傳遞系統(tǒng)，引起細胞特定通過受體后特定的信號傳遞系統(tǒng)，引起細胞特定的生物效應(yīng)，因此是高等動物適應(yīng)環(huán)境、協(xié)調(diào)整的生物效應(yīng)，因此是高等動物適應(yīng)環(huán)境、協(xié)調(diào)整體各種細胞功能的關(guān)鍵性分子。體各種細胞功能的關(guān)鍵性分子。 受體及其信號傳遞系統(tǒng)參與了體內(nèi)多種生理受體及其信號傳遞系統(tǒng)參與了體內(nèi)多種生理、病理過程，例如腫瘤的生成、免疫應(yīng)答、補體、病理過程，例如腫瘤的生成、免疫應(yīng)答、補體激活等。激活等。根據(jù)在細胞中的定位，把所有的受體分為根據(jù)在細胞中的定位，把所有的受體分為: 膜受體膜受體1. 核受體核受

4、體 二、受體的分類:1 1、膜受體：、膜受體：膜受體的分子一般由幾條到幾十條氨基酸鏈膜受體的分子一般由幾條到幾十條氨基酸鏈組成組成胞膜外胞膜外、胞膜內(nèi)胞膜內(nèi)及及跨膜區(qū)跨膜區(qū)三部分。三部分。配基從細胞的外側(cè)與受體的胞外部分或跨膜配基從細胞的外側(cè)與受體的胞外部分或跨膜部分上特定的結(jié)合位點結(jié)合，使受體分子發(fā)部分上特定的結(jié)合位點結(jié)合，使受體分子發(fā)生構(gòu)型變化，通過膜內(nèi)部分將信息傳給相應(yīng)生構(gòu)型變化，通過膜內(nèi)部分將信息傳給相應(yīng)的信息傳遞機制，引起細胞功能變化。的信息傳遞機制，引起細胞功能變化。 根據(jù)膜受體的跨膜結(jié)構(gòu)又可以分為：根據(jù)膜受體的跨膜結(jié)構(gòu)又可以分為：單鏈跨膜受體：包括單鏈跨膜受體：包括酪氨酸激酶型受

5、體酪氨酸激酶型受體，如各，如各種生長因子受體；種生長因子受體；非激酶型受體非激酶型受體，如細胞因子受，如細胞因子受體。體。G蛋白偶聯(lián)受體：受體的氨基酸鏈蛋白偶聯(lián)受體：受體的氨基酸鏈7次跨越細胞次跨越細胞膜，在人體內(nèi)分布很廣泛。膜，在人體內(nèi)分布很廣泛。a)離子通道型受體：受體的幾個組成亞單位豎插離子通道型受體：受體的幾個組成亞單位豎插入膜，中央形成空隙即為離子通道，如入膜，中央形成空隙即為離子通道，如N-膽堿能膽堿能受體、甘氨酸受體等。受體、甘氨酸受體等。 2 2、核受體：、核受體：為一條氨基酸鏈，可分為四個功能區(qū)：為一條氨基酸鏈，可分為四個功能區(qū)：A/BA/B區(qū)區(qū): :在不同受體中差異最大，主

6、要功能是在不同受體中差異最大，主要功能是選擇和激活基因轉(zhuǎn)錄。選擇和激活基因轉(zhuǎn)錄。 C C區(qū)區(qū): :與染色體與染色體DNADNA結(jié)合的區(qū)域，上面有一定的結(jié)合的區(qū)域，上面有一定的氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序氨基酸序列，能和靶基因上一定的核苷酸序列列 ( (稱作反應(yīng)原件稱作反應(yīng)原件, response element) , response element) 相相結(jié)合。結(jié)合。 D D區(qū)區(qū): :主要作用是受體在核內(nèi)的定位。主要作用是受體在核內(nèi)的定位。 E E區(qū)區(qū): :與配基結(jié)合的區(qū)，并有轉(zhuǎn)錄激活作用。與配基結(jié)合的區(qū)，并有轉(zhuǎn)錄激活作用。 受體的亞型受體的亞型受體亞型：在分子結(jié)構(gòu)上既有相似之處，

7、又存在受體亞型：在分子結(jié)構(gòu)上既有相似之處，又存在一定的差別，對一定的配基具有不同的親和力，一定的差別，對一定的配基具有不同的親和力，在生物學上具有不同的效應(yīng)。在生物學上具有不同的效應(yīng)。在藥理實驗等研究中發(fā)現(xiàn)，許多受體存在著兩種在藥理實驗等研究中發(fā)現(xiàn)，許多受體存在著兩種或兩種以上的亞型。只有內(nèi)源性配基相同而氨基或兩種以上的亞型。只有內(nèi)源性配基相同而氨基酸序列同源性很高的受體才可列為同一型的不同酸序列同源性很高的受體才可列為同一型的不同亞型。亞型。例如表皮生長因子受體家族就包括表皮生長因子、例如表皮生長因子受體家族就包括表皮生長因子、HER2、HER3、HER4等四個成員。等四個成員。 受體數(shù)量：

8、受體數(shù)量：占細胞蛋白總量十萬之一到百占細胞蛋白總量十萬之一到百萬分之一（一個細胞上僅有數(shù)千個受體分萬分之一（一個細胞上僅有數(shù)千個受體分子），一般方法難以分離和測定受體分子。子），一般方法難以分離和測定受體分子。 配體：配體：是指能和受體結(jié)合并引起相關(guān)效應(yīng)的是指能和受體結(jié)合并引起相關(guān)效應(yīng)的化合物。除了與受體結(jié)合外本身并無其他功化合物。除了與受體結(jié)合外本身并無其他功能，它不能參加代謝產(chǎn)生有用產(chǎn)物，也不直能，它不能參加代謝產(chǎn)生有用產(chǎn)物，也不直接誘導任何細胞活性，更無酶的特點，它唯接誘導任何細胞活性，更無酶的特點，它唯一的功能就是一的功能就是通知細胞在環(huán)境中存在一種特通知細胞在環(huán)境中存在一種特殊信號或

9、刺激因素殊信號或刺激因素。 三、受體與配體的結(jié)合三、受體與配體的結(jié)合 配體與受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它靠配體與受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它靠氫鍵氫鍵、離子鍵與范德華力、離子鍵與范德華力的作用，隨著兩種分子空間結(jié)構(gòu)的作用，隨著兩種分子空間結(jié)構(gòu)互補程度增加，相互作用基團之間距離就會縮短，作互補程度增加，相互作用基團之間距離就會縮短，作用力就會大大增加，因此用力就會大大增加，因此分子空間結(jié)構(gòu)的互補性是特分子空間結(jié)構(gòu)的互補性是特異結(jié)合的主要因素異結(jié)合的主要因素。 同一配體可能有兩種或兩種以上的不同受體同一配體可能有兩種或兩種以上的不同受體，例，例如乙酰膽堿有煙堿型和毒蕈型兩種受體。如乙酰膽堿

10、有煙堿型和毒蕈型兩種受體。同一配體與同一配體與不同類型受體結(jié)合會產(chǎn)生不同的細胞反應(yīng)，不同類型受體結(jié)合會產(chǎn)生不同的細胞反應(yīng)，如如AchAch可以可以使骨骼肌興奮，但對心肌則是抑制的。使骨骼肌興奮，但對心肌則是抑制的。 配體可以是神經(jīng)遞質(zhì)、激素、某些藥物等。配體可以是神經(jīng)遞質(zhì)、激素、某些藥物等。四、受體與配基結(jié)合的特性 1 1、可飽和性、可飽和性(saturability)(saturability) ：每種受體在一個細胞上的量有一定限度，所以如每種受體在一個細胞上的量有一定限度，所以如果不斷增加細胞周圍配基的濃度，結(jié)合到細胞上果不斷增加細胞周圍配基的濃度，結(jié)合到細胞上的配基將漸趨飽和。的配基將漸

11、趨飽和。 2 2、可逆性：、可逆性：如果在放射配基與受體結(jié)合后將受體周圍多如果在放射配基與受體結(jié)合后將受體周圍多余的放射配基移去余的放射配基移去( (例如淋洗或透析例如淋洗或透析) )，則放射配，則放射配基與受體的復(fù)合物會逐步解離，亦即這種結(jié)合是基與受體的復(fù)合物會逐步解離，亦即這種結(jié)合是可逆反應(yīng)?？赡娣磻?yīng)。如果向反應(yīng)系統(tǒng)中加入大量非標記配基，使如果向反應(yīng)系統(tǒng)中加入大量非標記配基，使其濃度遠高于放射配基，則將取代大部分原已結(jié)其濃度遠高于放射配基，則將取代大部分原已結(jié)合的放射配基，使放射性復(fù)合物減少合的放射配基，使放射性復(fù)合物減少, , 也說明配也說明配基與受體的結(jié)合是可逆的?；c受體的結(jié)合是可逆

12、的。 解離后的配基是原形，不起代謝變化。解離后的配基是原形，不起代謝變化。 3 3、特異性和親和性：、特異性和親和性：受體的特異性：受體的特異性：受體具有特異識別配基的性能，受體具有特異識別配基的性能，因此只有嚴格構(gòu)型和構(gòu)象的配基分子才能選擇性地因此只有嚴格構(gòu)型和構(gòu)象的配基分子才能選擇性地與受體結(jié)合。與受體結(jié)合。受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織（靶器官）的受體的特異性還表現(xiàn)在器官或組織（靶器官）的專一性上，如雌激素對子宮等器官有興奮作用，這專一性上，如雌激素對子宮等器官有興奮作用，這是因為這些器官上雌激素受體的數(shù)量明顯高于其它是因為這些器官上雌激素受體的數(shù)量明顯高于其它器官。器官。受體的親和性受

13、體的親和性是指受體和配基的結(jié)合能力，受體是指受體和配基的結(jié)合能力，受體親和性高就說明受體和配基結(jié)合牢固，不容易解離。親和性高就說明受體和配基結(jié)合牢固，不容易解離。4 4、與效應(yīng)的一致性：、與效應(yīng)的一致性：受體的主要功能是介導配體的生物效應(yīng)，如果受體的主要功能是介導配體的生物效應(yīng)，如果一種蛋白能與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導特定的生物一種蛋白能與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導特定的生物效應(yīng)，那么這種蛋白不能稱之為受體。效應(yīng)，那么這種蛋白不能稱之為受體。配體與受體結(jié)合后，引起陽性生理效應(yīng)，稱為配體與受體結(jié)合后，引起陽性生理效應(yīng)，稱為激動劑激動劑。配體與受體結(jié)合后，阻斷內(nèi)源性配基的陽性生配體與受體結(jié)合后，阻斷內(nèi)源性配

14、基的陽性生理作用，稱為理作用，稱為拮抗劑或阻斷劑拮抗劑或阻斷劑。 五、受體的生理調(diào)節(jié) 正常生理狀態(tài)下的受體處在一個不斷合成與降正常生理狀態(tài)下的受體處在一個不斷合成與降解的動態(tài)平衡中，但其數(shù)量和親和性也會因疾病、解的動態(tài)平衡中，但其數(shù)量和親和性也會因疾病、藥物作用而發(fā)生變化。藥物作用而發(fā)生變化。1、向下調(diào)節(jié)、向下調(diào)節(jié)(down-regulation) 細胞所處環(huán)境中某種激動劑濃度增高或長期細胞所處環(huán)境中某種激動劑濃度增高或長期作用，結(jié)果使其相應(yīng)受體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)受體作用，結(jié)果使其相應(yīng)受體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)受體對此物質(zhì)的敏感性下降或耐受性增高等現(xiàn)象。對此物質(zhì)的敏感性下降或耐受性增高等現(xiàn)象。 如

15、哮喘病人長期服用如哮喘病人長期服用-激動劑產(chǎn)生耐受性增激動劑產(chǎn)生耐受性增高，即藥效減弱。高，即藥效減弱。 2、向上調(diào)節(jié)、向上調(diào)節(jié)(up-regulation)細胞所處環(huán)境中某種拮抗劑的濃度過高或長期細胞所處環(huán)境中某種拮抗劑的濃度過高或長期作用，結(jié)果會使受體數(shù)量增高，出現(xiàn)受體敏感性作用，結(jié)果會使受體數(shù)量增高，出現(xiàn)受體敏感性增高，表現(xiàn)為增敏或撤藥后反跳現(xiàn)象。增高，表現(xiàn)為增敏或撤藥后反跳現(xiàn)象。如高血壓病人長期服用心得安，若突然停藥，如高血壓病人長期服用心得安，若突然停藥，可出現(xiàn)血壓升高的反跳現(xiàn)象?？沙霈F(xiàn)血壓升高的反跳現(xiàn)象。由于受體在整體條件下，隨機體狀態(tài)變化，會由于受體在整體條件下，隨機體狀態(tài)變化，

16、會出現(xiàn)生理調(diào)節(jié)，因此對受體數(shù)量和親和性測定就出現(xiàn)生理調(diào)節(jié)，因此對受體數(shù)量和親和性測定就成為研究病理變化和評價藥效的重要內(nèi)容。成為研究病理變化和評價藥效的重要內(nèi)容。 六、受體與疾病 遺傳缺陷與免疫異常遺傳缺陷與免疫異常為受體性疾病的常見原因為受體性疾病的常見原因 1 1、基因突變致使受體異常，引發(fā)功能障礙，基因突變致使受體異常，引發(fā)功能障礙，絕大多數(shù)是功能降低或絕大多數(shù)是功能降低或完全喪失，有家族史，病情嚴重。如睪酮受體基因突變致該受體缺完全喪失，有家族史，病情嚴重。如睪酮受體基因突變致該受體缺陷引起睪丸完全雌性化病。陷引起睪丸完全雌性化病。 2 2、機體對受體產(chǎn)生自身抗體，機體對受體產(chǎn)生自身抗

17、體，激動（如激動（如GravesGraves綜合癥患者產(chǎn)生綜合癥患者產(chǎn)生TSHTSH受體抗體，直接持續(xù)激動甲狀腺受體抗體，直接持續(xù)激動甲狀腺TSHTSH受體）或阻斷（如重癥肌無力患受體）或阻斷（如重癥肌無力患者產(chǎn)生者產(chǎn)生N-AchN-Ach受體抗體，占領(lǐng)但不激動受體）受體。受體抗體，占領(lǐng)但不激動受體）受體。 3 3、某些病有受體異常，非原始發(fā)病環(huán)節(jié)，為發(fā)病重要環(huán)節(jié)，采取針某些病有受體異常，非原始發(fā)病環(huán)節(jié)，為發(fā)病重要環(huán)節(jié)，采取針對措施可控制病情。對措施可控制病情。甲亢用甲亢用腎上腺素阻斷劑，哮喘用腎上腺素阻斷劑，哮喘用腎上腺素腎上腺素激動劑。激動劑。 4 4、受體與腫瘤受體與腫瘤：某些受體基因可

18、突變成為癌基因，引發(fā)腫瘤；激素：某些受體基因可突變成為癌基因，引發(fā)腫瘤；激素受體在腫瘤中存在與否決定治療方案（乳腺癌，白血?。?。受體在腫瘤中存在與否決定治療方案（乳腺癌，白血?。?.受體-配基結(jié)合反應(yīng)的基本原理 RBA(radioligand binding assay)的基本原理的基本原理與與IRMA基本相同，應(yīng)用基本相同，應(yīng)用放射性標記配體放射性標記配體，在，在一定條件下與受體（一定條件下與受體（R）結(jié)合成配體與受體復(fù)）結(jié)合成配體與受體復(fù)合物（合物（R*L），分離并測定），分離并測定R*L的放射性，的放射性，然后經(jīng)數(shù)據(jù)處理，對受體的性質(zhì)進行定性和定然后經(jīng)數(shù)據(jù)處理，對受體的性質(zhì)進行定性和定

19、量的分析。量的分析。定性定性RBA：是通過反應(yīng)的量效關(guān)系的變化來判：是通過反應(yīng)的量效關(guān)系的變化來判斷受體的類型，單位點或多位點結(jié)合式，及受體斷受體的類型，單位點或多位點結(jié)合式，及受體與配體結(jié)合的特點，反應(yīng)的可逆性、協(xié)作性等。與配體結(jié)合的特點，反應(yīng)的可逆性、協(xié)作性等。定量定量RBA：是在已知配體與受體反應(yīng)性質(zhì)的基：是在已知配體與受體反應(yīng)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過結(jié)合反應(yīng)，給出一定量的組織或細胞礎(chǔ)上，通過結(jié)合反應(yīng)，給出一定量的組織或細胞中能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)及結(jié)合的平衡中能與該放射性配體結(jié)合的受體數(shù)及結(jié)合的平衡解離常數(shù)或結(jié)合位點數(shù)（最大結(jié)合容量）。解離常數(shù)或結(jié)合位點數(shù)（最大結(jié)合容量）。 RBA的優(yōu)

20、點：的優(yōu)點： 高靈敏度：高比活度的配基和高親和力的受體反高靈敏度：高比活度的配基和高親和力的受體反應(yīng)必然會產(chǎn)生高靈敏度的分析技術(shù)。應(yīng)必然會產(chǎn)生高靈敏度的分析技術(shù)。RBA的靈敏的靈敏度可以達到度可以達到10-15mol/l； 特異性強：受體和配基的結(jié)合特異性和專一性保特異性強：受體和配基的結(jié)合特異性和專一性保證了方法的特異性證了方法的特異性; 受體制劑的多樣性：同一組織或細胞上有多種受受體制劑的多樣性：同一組織或細胞上有多種受體，因此某種組織或細胞制劑可以用多種配基做體，因此某種組織或細胞制劑可以用多種配基做受體分析；受體分析；1. 動物受體和人的受體存在相容性，在動物上獲得動物受體和人的受體存

21、在相容性，在動物上獲得的知識，多數(shù)可以用于人類。的知識，多數(shù)可以用于人類。 ( (一一) ) 簡單單點系統(tǒng)受體與配基相互結(jié)合的簡單單點系統(tǒng)受體與配基相互結(jié)合的基本規(guī)律基本規(guī)律 簡單單位點系統(tǒng)：簡單單位點系統(tǒng)：對某種受體而言，其所有的對某種受體而言，其所有的受體具有完全相同的結(jié)合特異性和生理效應(yīng)，且所受體具有完全相同的結(jié)合特異性和生理效應(yīng)，且所有受體都只有一個結(jié)合位點，以有受體都只有一個結(jié)合位點，以1 1：1 1的關(guān)系與配基的關(guān)系與配基結(jié)合，不表現(xiàn)明顯的正負協(xié)同效應(yīng)。結(jié)合，不表現(xiàn)明顯的正負協(xié)同效應(yīng)。 有時，一個受體系統(tǒng)中存在兩有時，一個受體系統(tǒng)中存在兩( (多多) )種亞型，但種亞型，但結(jié)合的配

22、基無選擇性，盡管亞型的生物效應(yīng)可能不結(jié)合的配基無選擇性，盡管亞型的生物效應(yīng)可能不全相同，結(jié)合反應(yīng)卻表現(xiàn)出完全相同的特征，這時全相同，結(jié)合反應(yīng)卻表現(xiàn)出完全相同的特征，這時，也可作為單位點系統(tǒng)來看待。，也可作為單位點系統(tǒng)來看待。將上式展開重排，得到將上式展開重排，得到可以看出，可以看出，RL(RL(復(fù)合物濃度復(fù)合物濃度) )和和LT(LT(配基總濃配基總濃度度) )并非線性關(guān)系，而是曲線關(guān)系。并非線性關(guān)系，而是曲線關(guān)系。對一定數(shù)量對一定數(shù)量(RT(RT(受體總濃度受體總濃度) )固定固定) )和一定親和和一定親和力力(KD(KD固定固定) )的受體來說，配基濃度從零開始上升時，的受體來說，配基濃度

23、從零開始上升時，復(fù)合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕復(fù)合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大多數(shù)受體都變?yōu)閺?fù)合物，也就是受體被飽和了。大多數(shù)受體都變?yōu)閺?fù)合物，也就是受體被飽和了。這就是飽和曲線。這就是飽和曲線。 曲線的高度曲線的高度主要反映受體的數(shù)主要反映受體的數(shù)量多少，受體越多，曲線高度量多少，受體越多，曲線高度越高；越高；曲線上升的快慢曲線上升的快慢取決于配基與受取決于配基與受體的親和力，所以，體的親和力，所以，KDKD越小越小( (親和親和力越大力越大) )，飽和曲線上升越快，飽和曲線上升越快，KDKD越大越大( (親和力越小親和力越小) )，飽和曲線上，飽和曲線上升越慢。

24、升越慢。(二二) Scatchard作圖：作圖：將將改寫成改寫成在繪制飽和曲線時，以復(fù)合物濃度在繪制飽和曲線時，以復(fù)合物濃度RL為橫為橫坐標，以復(fù)合物和游離配基的濃度比值坐標，以復(fù)合物和游離配基的濃度比值RL/L 為縱坐標，則對簡單單位點系統(tǒng)來為縱坐標，則對簡單單位點系統(tǒng)來說，將得到一條逐漸下降的直線。說，將得到一條逐漸下降的直線。Scatchard作圖作圖目前，目前，Scatchard作圖主要用于定性，即判斷是否簡單單作圖主要用于定性，即判斷是否簡單單位點，還是有其它復(fù)雜情況。例如同一系統(tǒng)中同一種受體位點，還是有其它復(fù)雜情況。例如同一系統(tǒng)中同一種受體有兩種以上親和力的亞型，或者受體有正協(xié)同或

25、負協(xié)同作有兩種以上親和力的亞型，或者受體有正協(xié)同或負協(xié)同作用用(Scatchard作圖呈曲線作圖呈曲線)（三）正負協(xié)同作用（三）正負協(xié)同作用 當一部分受體與配基結(jié)合后當一部分受體與配基結(jié)合后使相鄰的受體的親和使相鄰的受體的親和力發(fā)生改變力發(fā)生改變，倘若親和力逐步下降，稱之為負協(xié)同作，倘若親和力逐步下降，稱之為負協(xié)同作用如曲線用如曲線(2)(2)，親和力逐步增大，稱之為正協(xié)同作用如，親和力逐步增大，稱之為正協(xié)同作用如曲線曲線(3)(3)。 負協(xié)同正協(xié)同（四）非特異結(jié)合（四）非特異結(jié)合（non-specific binding，NSB） 上述飽和曲線是受體與配基的特異結(jié)合形成的。這種上述飽和曲線是

26、受體與配基的特異結(jié)合形成的。這種結(jié)合的特點是低容量和高親和力，所以容易飽和。但是，結(jié)合的特點是低容量和高親和力，所以容易飽和。但是，任何受體標本除特異結(jié)合外，還會有一部分非特異結(jié)合，任何受體標本除特異結(jié)合外，還會有一部分非特異結(jié)合，當分離特異結(jié)合的復(fù)合物測量放射性時，這部分非特異結(jié)當分離特異結(jié)合的復(fù)合物測量放射性時，這部分非特異結(jié)合的放射性混在一起，測到的是總放射性合的放射性混在一起，測到的是總放射性(total binding, TB)，必需先減去非特異結(jié)合，必需先減去非特異結(jié)合(NSB)，才能得到特異結(jié)合，才能得到特異結(jié)合(specific binding, SB)的放射性。的放射性。 N

27、SB NSB主要來自雜蛋白，反應(yīng)器壁，分離材料的吸主要來自雜蛋白，反應(yīng)器壁，分離材料的吸附，它的特點是，附，它的特點是，容量很大，而親和力低容量很大，而親和力低，因此在一，因此在一般情況下不被飽和，也就是隨著配基濃度的升高，它般情況下不被飽和，也就是隨著配基濃度的升高，它不呈飽和曲線，而是一條上升的直線。不呈飽和曲線，而是一條上升的直線。（五）受體與配基反應(yīng)的動力學（五）受體與配基反應(yīng)的動力學（kineticskinetics） 受體與配基的結(jié)合反應(yīng)一般都較快（多數(shù)在數(shù)十受體與配基的結(jié)合反應(yīng)一般都較快（多數(shù)在數(shù)十秒至數(shù)十分鐘）達到平衡。當周圍的游離配基急劇下秒至數(shù)十分鐘）達到平衡。當周圍的游離

28、配基急劇下降，或非標記配基濃度急劇升高時，放射性復(fù)合物的降，或非標記配基濃度急劇升高時，放射性復(fù)合物的解離也很快，這種快速結(jié)合和快速解離對保證受體的解離也很快，這種快速結(jié)合和快速解離對保證受體的迅速反應(yīng)有很重要的意義。迅速反應(yīng)有很重要的意義。大量非標記配基（六）競爭性取代反應(yīng)（六）競爭性取代反應(yīng) 在一個受體和放射配基的反應(yīng)系統(tǒng)中加入另在一個受體和放射配基的反應(yīng)系統(tǒng)中加入另一個化合物，它若能和受體的結(jié)合位點結(jié)合，則一個化合物，它若能和受體的結(jié)合位點結(jié)合，則會與放射配基競爭與受體結(jié)合，最終將表現(xiàn)為放會與放射配基競爭與受體結(jié)合，最終將表現(xiàn)為放射配基與受體形成復(fù)合物的能力降低，但受體數(shù)射配基與受體形成

29、復(fù)合物的能力降低，但受體數(shù)量不變量不變, ,所以叫競爭性取代反應(yīng)。此時，非標記的所以叫競爭性取代反應(yīng)。此時，非標記的起競爭作用的配基稱為競爭劑起競爭作用的配基稱為競爭劑, ,它們和受體結(jié)合后它們和受體結(jié)合后不改變受體分子的結(jié)構(gòu)。不改變受體分子的結(jié)構(gòu)。表示競爭劑抑制作用強弱的指標：表示競爭劑抑制作用強弱的指標：IC50值和值和KI。IC50值：值：指抑制指抑制50受體與放射配基結(jié)合所需競受體與放射配基結(jié)合所需競爭劑的濃度，爭劑的濃度，IC50值大，表明競爭劑抑制作用小。值大，表明競爭劑抑制作用小。KI：競爭劑的平衡解離常數(shù)，競爭劑的平衡解離常數(shù)，KI越小，表明競爭越小，表明競爭劑抑制作用越大。劑

30、抑制作用越大。 二、雙（多）位點系統(tǒng)二、雙（多）位點系統(tǒng)一種配基可以和兩種以上的受體亞型結(jié)合，每一種配基可以和兩種以上的受體亞型結(jié)合，每種亞型都有相應(yīng)的種亞型都有相應(yīng)的KDKD值（自學）。值（自學）。3. 受體放射分析的基本方法 RBA的方法學：的方法學：一般一般RBA分析都是以求得樣品中的受體數(shù)量分析都是以求得樣品中的受體數(shù)量RT為為目的。目的。用定量的受體制劑與大量的標記配基反應(yīng)，使受體用定量的受體制劑與大量的標記配基反應(yīng)，使受體得以飽和。分離受體得以飽和。分離受體-標記配基復(fù)合物，測量標記配基復(fù)合物，測量其放射性。根據(jù)復(fù)合物的放射性計算受體的其放射性。根據(jù)復(fù)合物的放射性計算受體的結(jié)合容量

31、或結(jié)合位點數(shù)。結(jié)合容量或結(jié)合位點數(shù)。 離體離體RBARBA基本方法的流程為基本方法的流程為： 一、受體標本的制備一、受體標本的制備 在受體結(jié)合實驗的研究中，所用的受體材料可以是在受體結(jié)合實驗的研究中，所用的受體材料可以是組織切片，也可以是完整的單層培養(yǎng)細胞或游離活細胞，組織切片，也可以是完整的單層培養(yǎng)細胞或游離活細胞，粗制的或純化的細胞膜受體，可溶性的受體蛋白等。粗制的或純化的細胞膜受體，可溶性的受體蛋白等。 （一）組織切片（一）組織切片冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中與標記配基進行反應(yīng)。反應(yīng)后用緩沖液洗幾次即可，切與標記配基進行

32、反應(yīng)。反應(yīng)后用緩沖液洗幾次即可，切片厚度一般為片厚度一般為5-50m。用組織切片的目的更多是研究受。用組織切片的目的更多是研究受體的分布（用放射自顯影法或免疫組化）。體的分布（用放射自顯影法或免疫組化）。 （二）游離的完整細胞懸液（二）游離的完整細胞懸液完整的活細胞可以是血細胞，培養(yǎng)的單層細胞，腫瘤的完整的活細胞可以是血細胞，培養(yǎng)的單層細胞，腫瘤的腹水型細胞以及經(jīng)處理的原代細胞等。腹水型細胞以及經(jīng)處理的原代細胞等。使用完整細胞的優(yōu)點：使用完整細胞的優(yōu)點：1、受體處于原有的正常環(huán)境中。膜未受擾亂，膜內(nèi)、受體處于原有的正常環(huán)境中。膜未受擾亂，膜內(nèi)pH、離子梯度也保存著。受體與其相連的效應(yīng)系統(tǒng)（如離

33、子梯度也保存著。受體與其相連的效應(yīng)系統(tǒng)（如G蛋蛋白）也保存完好。白）也保存完好。2、在受體功能反應(yīng)完全的情況下研究受體，可以同時、在受體功能反應(yīng)完全的情況下研究受體，可以同時觀察配基與受體結(jié)合的情況和細胞的生物效應(yīng)。所得的觀察配基與受體結(jié)合的情況和細胞的生物效應(yīng)。所得的結(jié)果更能反映受體的生理特點。結(jié)果更能反映受體的生理特點。3、能直接給出平均每一個細胞的受體數(shù)、能直接給出平均每一個細胞的受體數(shù)。 注意點：注意點：完整細胞的受體分析必須盡可能選用不易穿完整細胞的受體分析必須盡可能選用不易穿透細胞膜雙層磷脂的標記物，否則由于游離透細胞膜雙層磷脂的標記物，否則由于游離配基進入細胞內(nèi)可引起較大誤差。配

34、基進入細胞內(nèi)可引起較大誤差。1. 此外，還必須注意防止操作過程中可能導致此外，還必須注意防止操作過程中可能導致細胞表面生理活性的改變。如，完整細胞的細胞表面生理活性的改變。如，完整細胞的膜受體在膜受體在37時會發(fā)生受體入內(nèi)化現(xiàn)象，這時會發(fā)生受體入內(nèi)化現(xiàn)象，這會破壞結(jié)合反應(yīng)的平衡狀態(tài)，導致測定的會破壞結(jié)合反應(yīng)的平衡狀態(tài)，導致測定的KD值不正確，如值不正確，如80% EGF受體入內(nèi)化，而在受體入內(nèi)化，而在4則可阻止入內(nèi)化。則可阻止入內(nèi)化。（三）亞細胞組分（三）亞細胞組分 大多數(shù)受體的大多數(shù)受體的RBA需經(jīng)差速離心法分成胞膜、胞需經(jīng)差速離心法分成胞膜、胞漿、胞核，取所需組分進行分析。漿、胞核，取所需

35、組分進行分析。其優(yōu)點是：其優(yōu)點是：除去大部分雜蛋白和內(nèi)源性配基，減少除去大部分雜蛋白和內(nèi)源性配基，減少NSB或其或其它干擾因素；它干擾因素；1. 受體蛋白得到初步濃縮，使富集的受體制劑獲受體蛋白得到初步濃縮，使富集的受體制劑獲得可靠的分析結(jié)果。得可靠的分析結(jié)果。亞細胞組分的分離一般都采用差速離心法。一般先制成亞細胞組分的分離一般都采用差速離心法。一般先制成勻漿，再在含勻漿，再在含0.250.250.3mol/L0.3mol/L蔗糖緩沖液中先后以不同蔗糖緩沖液中先后以不同離心力進行離心，分離不同的亞細胞組分。離心力進行離心，分離不同的亞細胞組分。實驗過程應(yīng)注意：實驗過程應(yīng)注意：全部過程在全部過程

36、在4下進行操作，以保證受體標本的結(jié)下進行操作，以保證受體標本的結(jié)合活性；合活性；制備緩沖液的蔗糖密度，離子強度，制備緩沖液的蔗糖密度，離子強度，pH值及其它值及其它物質(zhì)（如物質(zhì)（如 EDTA，Mg2）應(yīng)嚴格控制。）應(yīng)嚴格控制。為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制劑為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制劑。 二、放射性配基的選擇二、放射性配基的選擇 制備優(yōu)良的放射性配基是受體結(jié)合試驗的制備優(yōu)良的放射性配基是受體結(jié)合試驗的首要條件。對任何一種受體系統(tǒng)，通常都有首要條件。對任何一種受體系統(tǒng)，通常都有好幾種標記配基可供選擇。選擇應(yīng)從兩方面好幾種標記配基可供選擇。選擇應(yīng)從兩方面考慮：配基的特性

37、；實驗?zāi)康??？紤]：配基的特性；實驗?zāi)康摹?（一）對放射性配基的基本要求（一）對放射性配基的基本要求1、高比活度：、高比活度：組織細胞內(nèi)的受體濃度一般都很組織細胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約低，約104-105個個/細胞，或細胞，或0.01-1.0 pmol/mg蛋蛋白的水平，低比活度的配基難于達到分析靈敏白的水平，低比活度的配基難于達到分析靈敏度的要求。一般要求比活度在度的要求。一般要求比活度在3.71011 Bq/mmol以上。以上。 2、高親和力、高親和力:可以減少標記配基用量可以減少標記配基用量a) 放射性配基與受體的結(jié)合物解離較慢，有利于放射性配基與受體的結(jié)合物解離較慢，有利于結(jié)合和游離

38、配基的分離。結(jié)合和游離配基的分離。3 3、高特異性、高特異性: :即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，理想的是該配基只與一種受體或受體亞型結(jié)合。但沒有理想的是該配基只與一種受體或受體亞型結(jié)合。但沒有一種配基是完全選擇性的，所以要結(jié)合實驗研究的目的，一種配基是完全選擇性的，所以要結(jié)合實驗研究的目的，選擇對某一受體或其中某一亞型親和力高的放射性配基。選擇對某一受體或其中某一亞型親和力高的放射性配基。4 4、高的穩(wěn)定性及放化純度、高的穩(wěn)定性及放化純度: :包括標記的穩(wěn)定性、貯包括標記的穩(wěn)定性、貯藏時的穩(wěn)定性以及溫育分析時之穩(wěn)定性。具有藏時的穩(wěn)定性以及溫育分析時之穩(wěn)定性

39、。具有95%95%以上以上的放化純度。的放化純度。 總的來說總的來說, ,配基的選擇要根據(jù)實驗?zāi)縼矶?。配基的選擇要根據(jù)實驗?zāi)縼矶āＤ壳?，用作受體放射分析的放射性配基多用目前，用作受體放射分析的放射性配基多用3 3H H、125125I I標記。標記。 3 3H H標記配基與原型配基為同型式，生物學活性好，標記配基與原型配基為同型式，生物學活性好，多數(shù)情況下比活度也能達到要求，且半衰期長，使用多數(shù)情況下比活度也能達到要求，且半衰期長，使用方便，主要缺點是需用液閃測量，操作較麻煩，一般方便，主要缺點是需用液閃測量，操作較麻煩，一般實驗室不能進行標記。實驗室不能進行標記。多肽及蛋白質(zhì)配基多用多肽及蛋

40、白質(zhì)配基多用125125I I標記，其優(yōu)點是可以達標記，其優(yōu)點是可以達到較高的比活度。只要很好掌握標記條件，仍能保持到較高的比活度。只要很好掌握標記條件，仍能保持較好的生物活性。另外，碘標記法快速、方便、經(jīng)濟，較好的生物活性。另外，碘標記法快速、方便、經(jīng)濟，一般實驗室可進行。一般實驗室可進行。（二）放射性配基的質(zhì)量鑒定（二）放射性配基的質(zhì)量鑒定 1 1、放射化學純度、放射化學純度: : 除新鮮產(chǎn)品外除新鮮產(chǎn)品外, ,存放一定時間存放一定時間后的標記配基均應(yīng)重測其放化純度，以保證分析后的標記配基均應(yīng)重測其放化純度，以保證分析的準確性。一般要求放化純度應(yīng)在的準確性。一般要求放化純度應(yīng)在9595以上

41、。以上。 2 2、結(jié)合活性鑒定、結(jié)合活性鑒定 3 3、比活度：、比活度：受體結(jié)合分析的結(jié)果計算離不開準受體結(jié)合分析的結(jié)果計算離不開準確的比活度數(shù)據(jù)。確的比活度數(shù)據(jù)。三、受體放射分析的類型三、受體放射分析的類型 （一）標記配基飽和法（一）標記配基飽和法1 1、單點飽和法：、單點飽和法：定量受體制劑加大量的標記配基定量受體制劑加大量的標記配基使受體得以飽和結(jié)合。根據(jù)受體使受體得以飽和結(jié)合。根據(jù)受體- -配基復(fù)合物的放配基復(fù)合物的放射性計算受體結(jié)合容量（或結(jié)合位點數(shù)）。這種射性計算受體結(jié)合容量（或結(jié)合位點數(shù)）。這種方法操作簡便、標本用量少。但只憑單點實驗數(shù)方法操作簡便、標本用量少。但只憑單點實驗數(shù)據(jù)

42、計算受體結(jié)合容量，比多點法的結(jié)果略低，不據(jù)計算受體結(jié)合容量，比多點法的結(jié)果略低，不能給出能給出KDKD，誤差也相對大些。，誤差也相對大些。 2 2、多點飽和法：、多點飽和法：一定量的受體制劑，逐步增一定量的受體制劑，逐步增加標記配基的量（一般加標記配基的量（一般7-87-8個實驗點），使受個實驗點），使受體的結(jié)合趨于飽和。用曲線擬合法或直線擬體的結(jié)合趨于飽和。用曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力（合法計算受體結(jié)合容量和親和力（RTRT、KDKD），），結(jié)果可靠性高。但受體標本、標記配基用量結(jié)果可靠性高。但受體標本、標記配基用量大，工作量大。大，工作量大。 （二）非標記配基飽和法（二

43、）非標記配基飽和法 一定量的受體和標記配基，逐漸增加非標一定量的受體和標記配基，逐漸增加非標記配基（一般記配基（一般7 78 8個實驗點），使受體飽和結(jié)個實驗點），使受體飽和結(jié)合，曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容合，曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力。量和親和力。 這種方法克服了多點飽和法標記配基用量這種方法克服了多點飽和法標記配基用量大的缺點，但由于非標記配基的用量逐漸加大，大的缺點，但由于非標記配基的用量逐漸加大，放射性逐步減少，必需標記配基比活度較高才放射性逐步減少，必需標記配基比活度較高才能得到滿意結(jié)果。能得到滿意結(jié)果。 四、分析條件的選擇四、分析條件的選擇（一）標記配

44、基濃度（一）標記配基濃度 試驗類型不同，選用的標記配基濃度也有不同。試驗類型不同，選用的標記配基濃度也有不同。單點飽和試驗要求飽和量的標記配基。對于多點飽單點飽和試驗要求飽和量的標記配基。對于多點飽和試驗，應(yīng)盡可能覆蓋飽和區(qū)及非飽和區(qū)，還應(yīng)考和試驗，應(yīng)盡可能覆蓋飽和區(qū)及非飽和區(qū)，還應(yīng)考慮最低一點有足夠的放射性滿足放射性測量統(tǒng)計上慮最低一點有足夠的放射性滿足放射性測量統(tǒng)計上的要求，最高一點的濃度則往往要考慮配基的來源的要求，最高一點的濃度則往往要考慮配基的來源及價格。及價格。 （二）受體濃度（二）受體濃度 一般說在一定范圍內(nèi)受體結(jié)合位一般說在一定范圍內(nèi)受體結(jié)合位點隨組織量的增加而增加，特異性結(jié)合

45、量與組織濃度點隨組織量的增加而增加，特異性結(jié)合量與組織濃度成線性關(guān)系。在線性范圍內(nèi)，較高受體濃度，有時可成線性關(guān)系。在線性范圍內(nèi)，較高受體濃度，有時可增加特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合的比值，有人提出，增加特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合的比值，有人提出，受體濃度應(yīng)選為約相當于受體濃度應(yīng)選為約相當于KDKD值。在實踐中，往往需要值。在實踐中，往往需要通過實驗來確定受體濃度。通過實驗來確定受體濃度。 （三）溫育溫度與時間（三）溫育溫度與時間 溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素。溫度高，結(jié)溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素。溫度高，結(jié)合快，達到反應(yīng)平衡時間短，溫度低，反應(yīng)終止時合快，達到反應(yīng)平衡時間短，溫度低，反應(yīng)終止時容

46、易降溫，減少分離過程中復(fù)合物的解離。另外，容易降溫，減少分離過程中復(fù)合物的解離。另外，溫度低對配基及受體的穩(wěn)定性有利。不同受體結(jié)合溫度低對配基及受體的穩(wěn)定性有利。不同受體結(jié)合系統(tǒng)的最佳溫度和時間要經(jīng)過試驗選定。系統(tǒng)的最佳溫度和時間要經(jīng)過試驗選定。 對于飽和或競爭取代試驗，應(yīng)要求反應(yīng)達到平對于飽和或競爭取代試驗，應(yīng)要求反應(yīng)達到平衡，故溫育時間應(yīng)足夠長以達到平衡狀態(tài)。溫育溫衡，故溫育時間應(yīng)足夠長以達到平衡狀態(tài)。溫育溫度與平衡時間是緊密相關(guān)的，不同的受體結(jié)合系統(tǒng)度與平衡時間是緊密相關(guān)的，不同的受體結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)平衡時間因親和力、溫育溫度、配基及受體的反應(yīng)平衡時間因親和力、溫育溫度、配基及受體濃度的不

47、同而不同。一般室溫（濃度的不同而不同。一般室溫（2222）操作比較方）操作比較方便。便。00溫育平衡時間雖然長一些，但其結(jié)果之重復(fù)溫育平衡時間雖然長一些，但其結(jié)果之重復(fù)性更好。性更好。 （四）緩沖液（四）緩沖液 結(jié)合分析使用過多種緩沖液，如磷酸鹽緩沖液結(jié)合分析使用過多種緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，Tris-HCITris-HCI緩沖液等，所選緩沖液應(yīng)不干擾結(jié)合，緩沖液等，所選緩沖液應(yīng)不干擾結(jié)合，并在較大范圍內(nèi)可穩(wěn)定并在較大范圍內(nèi)可穩(wěn)定pHpH。一般說，結(jié)合分析的。一般說，結(jié)合分析的pHpH應(yīng)處于生理范圍，即應(yīng)處于生理范圍，即pH=7-8pH=7-8。 鈉、鎂等離子在不同的受體系統(tǒng)中會有不同的鈉、鎂

48、等離子在不同的受體系統(tǒng)中會有不同的影響。因此要根據(jù)具體目的決定選用與否。如果加影響。因此要根據(jù)具體目的決定選用與否。如果加入的受體蛋白量較少時，宜在緩沖液加入適量蛋白入的受體蛋白量較少時，宜在緩沖液加入適量蛋白，使反應(yīng)液內(nèi)蛋白濃度為，使反應(yīng)液內(nèi)蛋白濃度為0.1mg-1mg/ml0.1mg-1mg/ml為好。為好。 為了阻止肽類的降解，常在分析時加入各種肽為了阻止肽類的降解，常在分析時加入各種肽酶抑制劑。但要視具體是哪種肽而定，以確保實際酶抑制劑。但要視具體是哪種肽而定，以確保實際有效。因為有些蛋白酶抑制劑有抑制特異性結(jié)合的有效。因為有些蛋白酶抑制劑有抑制特異性結(jié)合的作用。作用。 五、結(jié)合體與游

49、離配基的分離五、結(jié)合體與游離配基的分離 受體受體- -配基結(jié)合分析主要是測定反應(yīng)平衡時結(jié)合配配基結(jié)合分析主要是測定反應(yīng)平衡時結(jié)合配基的量，求解受體的密度與平衡解離常數(shù)。反應(yīng)一般基的量，求解受體的密度與平衡解離常數(shù)。反應(yīng)一般在達到平衡后先經(jīng)分離，再測結(jié)合部分的放射性。在達到平衡后先經(jīng)分離，再測結(jié)合部分的放射性。 理論上，一經(jīng)分離，反應(yīng)的平衡就會被破壞，所以理論上，一經(jīng)分離，反應(yīng)的平衡就會被破壞，所以選擇適當?shù)姆蛛x方法和環(huán)境，使受體選擇適當?shù)姆蛛x方法和環(huán)境，使受體- -配基復(fù)合物在分配基復(fù)合物在分離過程中的解離減少到最低限度。低溫是降低解離的離過程中的解離減少到最低限度。低溫是降低解離的最有效手段

50、，分離快慢也是重要因素。最有效手段，分離快慢也是重要因素。 常用的分離方法有離心法、濾膜法、吸附法、透析常用的分離方法有離心法、濾膜法、吸附法、透析法、電泳法等。若復(fù)合物解離快，則只能選擇快速的法、電泳法等。若復(fù)合物解離快，則只能選擇快速的分離方法。同時一定要在分離時間，分離溫度等方面分離方法。同時一定要在分離時間，分離溫度等方面保持各樣品管之間的一致性，以減少誤差。保持各樣品管之間的一致性，以減少誤差。 （一）抽濾法（濾膜法）（一）抽濾法（濾膜法） 1 1、選用的濾膜材料：、選用的濾膜材料：既能阻擋復(fù)合物又不要過多產(chǎn)生對既能阻擋復(fù)合物又不要過多產(chǎn)生對 游離標記配基的非特異性吸附。常用的濾膜是

51、玻璃纖維游離標記配基的非特異性吸附。常用的濾膜是玻璃纖維 濾膜。濾膜。 2 2、影響因素、影響因素 （1 1）復(fù)合物的解離：一般說，低溫時解離較慢，故濾膜）復(fù)合物的解離：一般說，低溫時解離較慢，故濾膜 及緩沖液應(yīng)保存于低溫。用冰冷緩沖液抽洗為好。及緩沖液應(yīng)保存于低溫。用冰冷緩沖液抽洗為好。 （2 2）負壓：若為多頭抽濾器，應(yīng)注意各孔壓力的均一性）負壓：若為多頭抽濾器，應(yīng)注意各孔壓力的均一性 （3 3）標記配基對濾膜的吸附：標記配基吸附于濾膜是抽）標記配基對濾膜的吸附：標記配基吸附于濾膜是抽 濾法非特異性結(jié)合的主要來源之一。也是抽濾法的主要濾法非特異性結(jié)合的主要來源之一。也是抽濾法的主要 缺點，

52、減少標記配基吸附于濾膜的方法有：濾膜預(yù)先缺點，減少標記配基吸附于濾膜的方法有：濾膜預(yù)先 用非標記配基浸泡；如果是多肽或蛋白標記配基，用用非標記配基浸泡；如果是多肽或蛋白標記配基，用 1 1白蛋白浸泡；用一定量的淋洗液或保證一定淋洗次白蛋白浸泡；用一定量的淋洗液或保證一定淋洗次 數(shù)，充分淋洗。數(shù)，充分淋洗。 （二）離心法（二）離心法 這也是常用方法之一，很多受體分析建立之初都用這也是常用方法之一，很多受體分析建立之初都用此法，離心法可以在復(fù)合物很少解離的狀態(tài)下達到較好此法，離心法可以在復(fù)合物很少解離的狀態(tài)下達到較好的分離效果，但非特異性較高的分離效果，但非特異性較高。（三）吸附法（三）吸附法 上

53、述分離方法均系分離后測定復(fù)合物的放射性。但當上述分離方法均系分離后測定復(fù)合物的放射性。但當研究可溶性受體時，如類固醇激素受體，上述方法就不研究可溶性受體時，如類固醇激素受體，上述方法就不適合，可采用吸附法。固相吸附物有炭素、滑石粉、葡適合，可采用吸附法。固相吸附物有炭素、滑石粉、葡聚糖衣活性炭等。其中以活性炭使用最多。目前，已廣聚糖衣活性炭等。其中以活性炭使用最多。目前，已廣泛應(yīng)用葡聚糖衣活性炭。它是在固相炭素上包一層葡聚泛應(yīng)用葡聚糖衣活性炭。它是在固相炭素上包一層葡聚糖，形成分子篩的作用，吸附小分子的游離配基。這種糖，形成分子篩的作用，吸附小分子的游離配基。這種炭液有一定的粘性，易于離心沉淀

54、，分離效果好。炭液有一定的粘性，易于離心沉淀，分離效果好。 4.4.受體放射分析的數(shù)據(jù)處理及應(yīng)用受體放射分析的數(shù)據(jù)處理及應(yīng)用 一、數(shù)據(jù)處理一、數(shù)據(jù)處理 受體放射分析所得測定數(shù)據(jù)都是放射性單位，受體放射分析所得測定數(shù)據(jù)都是放射性單位，如如cpmcpm，dpmdpm等，而受體分析沒有標準品，不能通過標等，而受體分析沒有標準品，不能通過標準曲線得到所需結(jié)果，只能靠數(shù)據(jù)換算來解決。如換準曲線得到所需結(jié)果，只能靠數(shù)據(jù)換算來解決。如換算成每毫克蛋白或算成每毫克蛋白或10105 5細胞所含受體數(shù)（通常以細胞所含受體數(shù)（通常以fmolfmol或或受體分子數(shù)表示）或平衡解離常數(shù)（通常以受體分子數(shù)表示）或平衡解離

55、常數(shù)（通常以nmol/Lnmol/L表表示）。示）。 另外，較多的受體放射分析是各種多點法，實驗另外，較多的受體放射分析是各種多點法，實驗得到的是若干點的實測值，需要經(jīng)過用一定的數(shù)學模得到的是若干點的實測值，需要經(jīng)過用一定的數(shù)學模型進行直線或曲線擬合，才能得到所要的結(jié)果。所以型進行直線或曲線擬合，才能得到所要的結(jié)果。所以受體放射分析的數(shù)據(jù)處理包括兩個方面，一是受體放射分析的數(shù)據(jù)處理包括兩個方面，一是正確的正確的單位換算單位換算，二是，二是各種手工或計算機的數(shù)據(jù)擬合各種手工或計算機的數(shù)據(jù)擬合。 (一一) )、單點飽和分析法的單位換算、單點飽和分析法的單位換算 設(shè)測得復(fù)合物的放射性是設(shè)測得復(fù)合物的放射性是2000cpm2000cpm，則除以測，則除以測量效率成為量效率成為dpmdpm（除以（除以6060成為成為BqBq），再除以標記配），再除以標記配基的比活度（絕大多數(shù)受體以基的比活度（絕大多數(shù)受體以1 1：1 1關(guān)系與