利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象

1、北京大學校長基金論文集（ 2003 年） 利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象化學學院 2000 級 葛寧目錄第一章緒論 .1一、背景知識 .1二、關于 MjsHSP16.51第二章 試驗內(nèi)容及方法 .4一、 MjHSP16.5 的表達 .4二、 MjHSP16.5的分離與純化 .6三、MjHSP16.5濃度的測定 .9四、丙稀酰胺對 Trp的熒光淬滅 .10 第三章 結果討論 . .14 致謝 15參考文獻 16北京大學校長基金論文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象第一章 緒論、背景知識熱休克蛋白 Heat Shock Prot

2、eins (HSPs),是在從細菌到哺乳動物中廣泛存在一類熱應 急蛋白質。當有機體暴露于高溫的時候， 就會由熱激發(fā)合成此種蛋白， 來保護有機體自身。 許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小，熱休克蛋白共分為五類，分別為 HSP100， HSP90， HSP70， HSP60 以及小分子熱休克蛋白small Heat Shock Proteins(sHSPs)( Kyeong et al., 1998。)小分子熱休克蛋白分子量為 12-34KD ，它的分布極為廣泛， 從細菌到人的基因組里都 有小分子熱休克蛋白的基因。與其他大分子的熱休克蛋白不同的是， 小分子熱休克蛋白似乎對于細胞的功能并

3、不是 必不可少的。但是， sHSPs具有多種功能，包括賦予細胞以耐熱性以抵抗高溫，作為分子 伴侶以防止蛋白聚集， 對坑正常的細胞死亡， 從而調(diào)節(jié)細胞的生存和死亡的平衡。 能避免 底物變性的 sHSPs最少量與底物和熱休克蛋白都有關 (Rosalind et al., 1998)。許多小分子熱休克蛋白基因一般并不表達， 顯著表達小分子熱休克蛋白一般是細胞受 到外部刺激的時候， 比如高溫刺激?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)， 除了熱刺激之外還有許多物理、化學刺激 可以激活小分子熱休克蛋白的表達，例如紫外線、射線、機械損傷、酸、氧化劑等等?？?見，小分子熱休克蛋白是抵御外界不良刺激的重要物質。、關于 MjsHSP16.5

4、1蛋白的結構來自 Methanococcus jannaschi(i 一種甲烷球菌屬古細菌)的熱休克蛋白 MjHSP16.5， 相對分子量 16500kD，共 167 個氨基酸殘基，是第一個有晶體結構數(shù)據(jù)的小熱休克蛋白。 它的序列中存在一段長 90個殘基的 -晶狀體結構域(殘基 46至 135)，此結構域與人的 A-晶狀體蛋白有 20.7%的相似性，與水稻的 HSP16.9有 31.4%的相似性(Rosalind et al., 1998)。圖 1. MjHSP16.5 的單體結構MjHSP16.5 的結構已經(jīng)解出。它是一個中空的球狀的 24 聚體，分子量約 16500kD。 聚合體的外徑約

5、120?，內(nèi)徑約 65?。球的內(nèi)部是空的，并沒有明顯的電荷密度。它具有非 常規(guī)則的結構，對稱性包括 12 個二重軸， 3 個三重軸， 3 個四重軸， 8 個三重軸窗口， 6北京大學校長基金論文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象個四重軸窗口，邊長分別為 30 ?和 17 ?聚合體中的每一個折疊單位是由組成兩個片的 結構、兩個短的 310- 螺旋和一個短的結構組成的， 其中一個結構來自相鄰的折疊單位。 蛋白 N-末端的 32 個氨基酸殘基高度無序的。從第 33 個殘基開始， 是蛋白的 -晶狀體結構域，在蛋白的 C-末端還有一 段長 12 個殘基的短小結構 (Dana A.

6、Haley et al., 2000)。每個蛋白的折疊單位大小為 25? 28?75?， 最長的方向與折疊片的長軸平行。MjHSP16.5 的 24 聚體中的每一個單 位都與其他單位有 很強的聯(lián)系。 對應于 復合體中二重、三 重、四重對稱軸，一 共存在三種折疊單 位間的相互作用。 最 強的相互作用存在 于二重軸周圍： 一個 單位的 2- 折疊和另一單位的 6- 折疊通過形成氫鍵已形成單位間的折疊片，同時強烈的疏水相互作用和靜電力也使該結構得到北京大學校長基金論文集( 2003 年) 利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象 穩(wěn)定。在四重軸周圍，由于氫鍵、靜電力和疏水相互作用，四個分子互相接觸。而

7、在三重 軸周圍，單位間的作用力最弱，只有離子間作用力是三個單位組成的三角形頂角處穩(wěn)定 ( Kyeong et al., 1998)。2 jHSP16.5 對細胞和蛋白的熱保護實驗表明，在表達了 MjHSP16.5 的大腸桿菌提取物中， 75%的蛋白在 80高溫下因 為被保護而沒有聚集沉淀，而提純得到的 MjHSP16.5 對大腸桿菌提取物有相同的作用， 說明對大腸桿菌的熱保護主要是由 MjHSP16.5 完成的。另外，對于變性溫度為 80的單 鏈應樂果甜蛋白( single chain monellin )， MjHSP16.5 一樣可以阻止其在變性溫度下發(fā)生 聚集 (Rosalind et

8、al., 1998)。一種可能機制是，可能在體內(nèi)，在這個過程中，蛋白或對細胞重要的 RNA 可以嵌入 MjHSP16.524聚球狀體的空腔或表面。 另一種可能性是， MjHSP16.5 多聚體與他的功能和 活性無關，而是一種蛋白的儲存狀態(tài)： 當?shù)鞍资艿酵饨鐗毫Φ臅r候， 多聚體就會迅速分解。北京大學校長基金論文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象第二章 實驗內(nèi)容及方法、 M jHSP16.5 的表達1.原理蛋白質表達是為獲得大量的目標蛋白質而進行的有目的性的蛋白質合成。 常用方法是 將編碼所需產(chǎn)物的基因插入質粒或其他載體，然后將該載體導入活細胞，進行大量合成。大多數(shù)克隆載體

9、都以大腸桿菌作為宿主。 因為大腸桿菌具有兩個特征： 操作簡易和能 在廉價的培 養(yǎng)基 上迅速的生長。在大腸桿菌里表達外源基因一般是始于將基因插入表達載體（一般是質粒） 。載體應 具有的幾種元件有：選擇標志的編碼序列，它可供篩選以確定載體是否進入了細胞； 可控轉錄啟動子，經(jīng)誘導后從克隆化基因產(chǎn)生大量的 mRNA ； 轉錄調(diào)控序列，如一個合適的核糖體結合位點和起始密碼子 ATG； 一個多限制酶位點接頭，便于外源基因以正確方向插入載體中。 含有待表達基因的載體構建好后，經(jīng)轉化導入大腸桿菌某一合適菌株中。編碼 MjHSP 16.5 的基因（ Mj285 ）已經(jīng)從古細菌 Mathanococcus jan

10、naschii中得到克 隆，利用 PCR 技術擴增，并插入帶有氨芐（ AMP.）抗性的載體 pET21a 質粒（ Novagen 出品）中。將此載體轉化進入宿主 E.coli BL21（DE3） ，宿主體內(nèi)含有質粒 pSJS1240，此質 粒含有可以編碼 E.coli 的 tRNA 稀有密碼子（精氨酸密碼子 AGA 和異亮氨酸密碼子 ATA），并帶有壯觀霉素 （Spectinomycin）抗性。 我們用含 Amp. 和 Spec. 的 LB 培養(yǎng)基來篩 選出可以表達 MjHSP 16.5的菌株。得到的菌株在適當條件下大量培養(yǎng)，即得到表達出所 需蛋白的細胞。2儀器和試劑儀器a） YXQG02 型

11、蒸汽消毒器：山東新華醫(yī)療儀器廠；b）LS-B50L 立 式 圓 形 壓 力 蒸 汽 滅 菌 器 ： 張 家 港 市 華 菱 醫(yī) 療 設 備 制造有限公司；c） CS501-SP超級數(shù)顯恒溫器：重慶四達實驗儀器廠；d） Model 4518 臺式恒溫培養(yǎng)搖床： Forma Scientific Inc.；e） Spectrumlab PC 22 分光光度計：上海棱光技術有限公司； .f） Sorvall RC 5C Plus冷凍離心機： Kendro Laboratory Products； 其他常規(guī)儀器： 電子分析天平； 漩渦混合器；一次性培養(yǎng)皿； 燒杯；錐形瓶；接種環(huán)； 酒精燈；微量移液器；

12、離心管（ 500ml，50ml）；一次性小離心管（ 1.5ml ，0.6ml）；滴管； 玻璃棒。北京大學校長基金論文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象試劑a) LB 液體培養(yǎng)基： 每 100ml Tryptone：1g Yeast-extract：0.5g NaCl：1g 加水至 100ml并用 NaOH調(diào) pH至 7b) LB 固體培養(yǎng)基：每 100ml 液體培養(yǎng)基中加入 1.5g 瓊脂 (Agar-B)c) Ampicillin(Amp.) 50mg/ml每 10ml Ampicillin ： 500mg ddH2O：10mld) Spectinomycin(Spe

13、c.) 50mg/ml 每 10mlSpectinomycin：500mg ddH2O：10mle) 1 M IPTG 每 5ml IPTG：1.2g ddH2O： 4.5mlf) 0.8% NaCl 溶液 每 100ml NaCl ： 0.8g ddH2O：100ml注：配制 Ampicillin 和 Spectinomycin 時要無菌操作。在無菌環(huán)境中將配好的溶液過一次性濾器裝入無菌細口瓶，于 4冰箱中保存。3實驗步驟3.1轉化質粒 pET21a：a)配制 LB 液體培養(yǎng)基兩份各 50ml，LB 固體培養(yǎng)基一份 50ml。0.1MPa下滅菌 20min。b)待培養(yǎng)基冷卻而固體培養(yǎng)基未凝固

14、時加入 50mg/ml Amp. 和 Spec. 各 50 l，搖勻， 倒平板。向一瓶液體培養(yǎng)基中加入 Amp. 和 Spec. 各 50l；另一瓶液體培養(yǎng)基中 加入 Spec. 50l。c)在含 Spec. 的液體培養(yǎng)基中加入 10l E.coli BL21(DE3) ，恒溫搖床上 37， 150rpm 培養(yǎng) 6 小時，至 O.D. 至 0.6 左右北京大學校長基金論文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象d)取 1ml 菌液，離心，棄上清液。e)加入 100l 0.1M CaCl 2重懸菌體沉淀，加入 3l pET21a質粒，振蕩均勻。冰浴 30 分鐘左右，保持細菌處于

15、感受態(tài)。f)于 42恒溫水浴下熱休克 45 秒(時間要精確)。g)冰浴 1 2 分鐘。h)取 50 l 菌種于含 Amp. 和 Spec. 的固體培養(yǎng)基中，涂布均勻。在恒溫搖床上于 37， 150rpm下培養(yǎng) 16小時左右。出現(xiàn)分布均勻的單菌落證明轉化成功。3.2菌種保藏a)單菌落接入含 Amp. 和 Spec. 的培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫搖床上 37，150rpm 下培養(yǎng) 8 小時左右，至 O.D.值為 1。b)取 1ml 菌液于 1.5ml 小離心管中，加入 80無菌甘油至終濃度 8%-10%，于 20 冰箱中保存。3.3大量培養(yǎng)：取菌種 200l 于 1L 已滅菌的 LB 培養(yǎng)液 (含 50g/m

16、l Amp. , 30g/ml Spec.) 中，37， 150rpm下?lián)u床培養(yǎng) 8小時左右，至菌體 O. D. (600nm)值為 0.8-1 。3.4誘導：加入 IPTG 500l(終濃度為 0.5M)，繼續(xù)在 37oC，150rpm下培養(yǎng) 2 小時左右 誘導過程中，菌不再生長。注：以上所有操作均在無菌條件下進行3.5收獲菌體：將菌液于 4， 5000g下離心 10min；棄去上清液，用 0.8% NaCl 溶液重懸菌體， 再于 4， 5000g 下離心 10min；沉淀的菌體于 20下保存。二、 MjHSP 16.5 的分離與純化：1. 原理：為了提高蛋白純度，我們借鑒文獻的純化方法(

17、Kyeong Kyu Kim et al.,1998 )，摸索 出了一套純化方法。 使用分離純化生物大分子最高效液相色譜分離技術， 連續(xù)使用三種色 譜法：離子交換色譜，疏水作用色譜，凝膠過濾色譜。1.1離子交換色譜氨基酸是一種兼性離子，在生理條件下，羧基帶負電，氨基帶正電。由于不同的 氨基酸側鏈不同，使其具有不同的酸堿性，從而在生理條件下又帶上了額外的電荷。 自然，有大量氨基酸組合而成的蛋白質，也有可能是帶電體。北京大學校長基金論文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象離子交換色譜，是利用被分離物質帶電性質不同而達到分離效果的一類液相色譜。 色譜柱的固定相上帶有可解離的陽(

18、陰)離子，當帶有同種電荷的物質流入柱內(nèi)，會 將該種離子置換出來，從而停留在柱內(nèi)。逐漸加大洗脫液的離子強度，或者改變體系 的 pH 值，都可能使新的離子取代被提純物質的位置，從而是物質被洗脫下來。電荷 性質不同的物質，與固定相間的作用力不同，洗脫時間不同，從而達到分離提純的效 果。1.2疏水層析 疏水層析是基于溶質，極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種 色譜模式。它利用分離的物質的疏水性質不同，而達到分離效果的。與疏水作用相對 的是靜電作用力。在很高離子濃度時，被分離物質因為與柱內(nèi)固定相間的疏水相互作 用而被停留在柱內(nèi)。根據(jù)相似相容原理，降低洗脫液的離子強度，增加了流動相與被 分離

19、物質間的疏水作用，加大了物質離開固定相的趨勢，直至被洗脫下來。1.3凝膠過濾色譜 凝膠過濾色譜是根據(jù)蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料 中含有大量微孔，只允許緩沖液以及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質以及 一些蛋白質復合物被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質在填料顆粒間隙中流動， 比小分子量蛋白更早的被洗脫下來。最大的蛋白質分子最早流出柱子，因為它們 在到達柱底前經(jīng)過的體積最?。恢械鹊牡鞍踪|可以進入填料分子中較大的孔內(nèi)， 有最大的通過體積，故最后到達柱底。2.儀器和試劑 儀器 a)FPLC Fast protein, peptide, and polynucleotide liq

20、uid chromatography快 速(蛋白， 多肽，核酸)液相層析儀 ：PHARMACIA ；b)陰離子交換柱 5ml High-Trap Q 柱： PHARMACIA ；c)疏水柱 Hi PREP Octyl FFd)凝膠過濾柱為 Superose S200e)Sorvall RC 5C Plus 冷凍離心機： Kendro Laboratory Products；f)JY92-II 超聲細胞粉碎機：上海新芝生物技術研究所；g)SHB-88 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；h)0.22 微米一次性無菌濾器。其他常規(guī)儀器：電子分析天平；電磁攪拌器；燒杯；微量移液器； 50ml

21、 離心管； 次性使用無菌注射器滴管；玻璃棒。 試劑 a)50 mM Tris-HCl pH 7.5每 100mlTris：1.212g ddH2O：95ml 用 HCl 調(diào)至 pH7.5 后，室溫保存；北京大學校長基金論文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象b） 100mM PMSF （劇毒 ）：每 15mlPMSF：261mg異丙醇： 15ml 溶解后分裝 750l/管， 20oC 保存；c） 1M DTT （儲液）： 每 100mlDTT ：1.55mg ddH2O：10ml， 20oC 保存；d） 200mM PBS 緩沖液（ 5 倍儲液） pH6.9 每 1LNa

22、2HPO4 100mM ：358.14g；NaH2PO4 100mM ：156.01g；e） Buffer A：40mM PBS 緩沖液 將儲液 d）稀釋 5 倍； 0.45m 濾膜過濾；f） Buffer B ：每 1L儲液 d）：200ml；NaCl： 58.44g （1M ）； ddH2O ：配至總體積為 1L ； 0.45m 濾膜過濾；g） Buffer C：每 1L儲液 d）：200ml；（NH4）2SO4： 201.18（1.5M）； ddH2O： 配至總體積 1L； 0.22m 濾膜過濾；h） Buffer D ：每 1L 儲液 d）200ml； NaCl： 5.844g （ 0

23、.1M）； ddH2O： 配至總體積 1L；0.45m 濾膜過濾；i）蔗糖；固體，分析純；北京大學校長基金論文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象j） （NH 4）2SO4：固體，分析純；3實驗步驟3.1 破壁（機械法）：1）配制破壁用緩沖液：每 3g 菌50 mM Tris-HCl ： 15ml；100mM PMSF ：150l；蔗糖： 3g； 1M DTT ：60 l；2）破壁： 將收獲的菌體用破壁緩沖液重懸，冰水浴中，以 3秒脈沖（ 3 秒開， 3秒關） 超聲破壁 120 次，超聲功率為 400W，至混合液呈半透明。注：破壁后的溶液要馬上進行下一步提純，因為破壁后的

24、溶液里含有蛋白酶會降解蛋白3）離心：將破壁后的液體于 4， 24000g下離心 20min，上清液 0.22 濾膜過濾3.2 色譜法分離 （均以 1L 培養(yǎng)液所得約 3g 菌體為例）：1）離子交換色譜：a） 將蛋白樣品用 0.22m 濾膜過濾；b） 以 Buffer A 為 A 泵溶液， Buffer B 為 B 泵溶液，采用 5ml Hitrap Q 柱，取蛋 白溶液每次 5ml 進行分離。用 A 泵上樣，用 buffer A 沖平。洗脫為 30%B-60%B， 在 30%B-60%B 收集。收集樣品后加入 （NH4）2SO4 至 1.5M。2）疏水層析疏水柱 Hi PREP Octyl F

25、F，依次以 1M NaOH, dd 水， buffer C 充分平衡；上一步 樣品 0.22m濾膜過濾后用 B 泵上樣，在用 buffer C沖平。洗脫為 100%C-0%C， 在 60%C-25%C 收集，洗脫峰約為 47%C。收集溶液超濾濃縮小于 2ml。3）凝膠過濾色譜凝膠過濾柱為 Superose S200。用 2ml loop ，一次上樣 2ml。收集方式為峰收集， 50mAu 時停止收集。一次收集 1.5ml ，最后收集的樣品應舍棄第一管。3.3保存用 millipore Ultra free 15 超濾管濃縮， 1：1 加入已經(jīng)滅菌的 80%甘油， -20 保存。MjHSP16.

26、5 濃度的測定北京大學校長基金論文集( 2003 年)1. 原理利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象蛋白質通常在波長 280nm處，有最大吸收峰，因此可以利用紫外可見分光光度計，測 出一定濃度蛋白溶液在該波長下的吸收。 再根據(jù)蛋白濃度和吸收強度成正比的定理， 利用 該蛋白的吸光系數(shù)，求出溶液中蛋白的濃度。據(jù)文獻報道 MjHSP16.5 在 280nm 處的吸光系數(shù)為 0.565(mg/ml)-1cm-1，使用光程 1cm 的吸收池，故可利用公式計算蛋白濃度。蛋白濃度 =280nm 處紫外吸收值 / (吸光系數(shù)光程長)=280nm 處紫外吸收值 / 0.5652. 儀器和試劑 儀器 a) La

27、mbda 45 UV/Vis Spectrometer: PerkinElmer Instrumentsb)微量光吸收池(光程 1cm，樣品量 50 l )：PerkinElmer Instruments 試劑 Buffer: 視情況而定，應與蛋白溶液除去蛋白后的組成完全相同3.實驗步驟：a) 將兩吸收池洗凈吹干，分別用作樣品池和參比池，在 280nm波長下自動調(diào)零；b) 估計蛋白溶液濃度， 取少量將其用 Buffer 稀釋至約 0.5mg/m(l 即吸光度約 0.2-0.4 為宜)；c)取蛋白溶液 100l 于樣品池， Buffer 100 l 于參比池，測定蛋白溶液在 280nm 處的吸收

28、；d)計算蛋白濃度。四、丙稀酰胺對 Trp 的熒光淬滅1 原理 熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn) 象稱為熒光淬滅。能引起熒光強度降低的物質稱為淬滅劑。一種研究蛋白構象非 常有用的試驗方法是將淬滅劑加入溶劑中。有三種常用的 淬滅劑：丙稀酰胺，I -,Cs+。其中丙稀酰胺是中性分子， 而后兩種分別帶負電和正電。 淬滅劑的濃度變 化從 0.01M到 0.5M。對于蛋白來講，丙稀酰胺被廣泛的應用到確定 Trp 殘基的暴 露度。此試驗是在每一溫度下用丙稀酰胺進行滴定，記錄熒光信號以獲得淬滅數(shù) 據(jù)。這一過程可以描述如下：M(S1) + Q M(S0) + Qk qQ(1)

29、無淬滅劑時，0FkR (2)F kR k010北京大學校長基金論文集( 2003 年)利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象有淬滅劑存在時，kR k0 k QQ(3)所以，0FkR k0 kQQFkR k0(4)其中 k0 kNR kISC kPR因為無淬滅時單重態(tài)壽命為 s 1/(kR k0 ) 所以， (4) 式可以簡化為：0F 1 kQ SQ(5)F以上就是著名的 Stern-Volmer 等式。令KV kQ S，KV 值可以表示 Trp殘基在溶劑中的暴露程度， 高的KV 值可以說明殘基暴露于溶劑中，低的 KV 值則說明殘基被包含在蛋白中。2儀器和試劑 ：a) 色譜純丙稀酰胺溶液( 5M

30、 )；b) 純化后的小熱休克蛋白溶液；c)1-cm quartz fluorescence cuvette；s3步驟與方法 ：a) 2.00ml 蛋白溶液樣品，使其濃度大約為紫外吸收在 EX 0.05 。b) 記錄蛋白和空白的熒光光譜：熒光的激發(fā)波長為295nm，記錄發(fā)射光譜從310nm 到 450nm。c)分別加入丙稀酰胺溶液 5，5，10，20，20，20，20，20， 40，40 l 使最后丙稀酰胺的濃度大約在 0.5M。d)按照上述步驟測量空白的熒光光譜。e)重復上述步驟，控制溫度從 25到 95，每隔 5測量一次。4.數(shù)據(jù)處理 ：將 b)中測得的熒光強度減掉相應的 c )中的空白值，

31、 初始熒光強度為 F0, 在熒光淬滅劑濃 度Q時熒光強度為 F。F0/F 對Q 作圖，數(shù)據(jù)用 SAS線性擬合，擬合直線強制過( 0,1) 點，獲得 KV 值。將不同溫度下獲得的 KV 對溫度作圖。5.試驗結果：a) 各個溫度下 Stern-Volmer 等式的線性擬合：2511北京大學校長基金論文集（ 2003 年）利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象4530354012505560北京大學校長基金論文集（ 2003 年） 利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象8570809013T/Kv2514.80423016.00273521.02954022.06454518.24335020.51

32、795521.54036024.2997北京大學校長基金論文集( 2003 年) 利用丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構象6522.56877024.08888027.79308528.78659030.08239533.5938注釋：以上圖中縱坐標 F1 為(F 0/F)-1 ， 橫坐標為丙稀酰胺濃度 Q第三章 結果討論從以上圖形可以看出， KV隨溫度變化有較為明顯的上升趨勢， 由于KV 值大小體現(xiàn)了 Trp殘基在溶劑中的暴露程度， 所以KV值的上升可能說明 Trp殘基隨溫度的上升， 其在溶 劑中暴露的越多。致謝感謝來魯華老師和曹敖能老師在一年多的時間里給予我的指導和關心。從他們身 上，我不僅學到了生物化學領域的知識，更重要的是作為一個科學工作者的研究方法和 治學態(tài)度。這些注定將讓我受用終身。感謝蔡利峰博士和王錚研究生給予我的幫助， 是他們一開始將我領進這個我相對陌 生的領域。感謝范可強、魏平兩位師兄平時對我學習上的幫助和支持。感謝徐菲、楊銘兩位同學平時對我生活上的照顧與幫助。最后，感謝我的家人在我實驗和學習期間給